《Journal of Extracellular Vesicles》：RVG-Modified BMSCs-Derived Small Extracellular Vesicles Loaded With miR-21 Alleviate Neuronal Injury Resulted From Excessive Autophagy via Targeting PTEN/Akt/mTOR Pathway After Cerebral Ischaemia
编辑推荐：
缺血性卒中（IS）导致极高的成人残疾率和死亡率，但目前针对该疾病的治疗手段有限。由骨髓间充质干细胞（BMSCs）衍生的装载其内含微小RNA（miRNA）的小细胞外囊泡（sEVs）已被证实对IS具有满意的治疗效果。然而，系统给药的天然sEVs难以跨越血脑屏障（B
缺血性卒中（IS）导致极高的成人残疾率和死亡率，但目前针对该疾病的治疗手段有限。由骨髓间充质干细胞（BMSCs）衍生的装载其内含微小RNA（miRNA）的小细胞外囊泡（sEVs）已被证实对IS具有满意的治疗效果。然而，系统给药的天然sEVs难以跨越血脑屏障（BBB）进入脑实质；此外，sEVs货物miRNA的低丰度也限制了其调控功能的最大化。因此，脑靶向修饰和miRNA递送策略对于优化BMSC-sEVs的治疗效果至关重要。在本研究中，基于sEVs miRNA测序（miRNA-seq）和GEO数据库中缺血性卒中患者样本的RNA-seq数据集分析，研究人员确定miR-21在缺血脑中急剧下降。通过生物工程化改造过表达RVG-Lamp2b肽和miR-21-5p的BMSCs，成功开发了RVG-miR21-sEVs。在对RVG-miR21-sEVs进行表征后，结果显示RVG修饰的sEVs对神经元具有高亲和力，并且在小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAo）模型中，给予RVG-miR21-sEVs显示出优越的神经功能康复效果和脑梗死减少作用。此外，RVG-miR21-sEVs治疗抑制了氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤后的神经元自噬、线粒体功能障碍和凋亡。通过双荧光素酶报告基因实验、FISH技术和miR-21抑制剂及模拟物转染，研究人员验证了miR-21的靶点是PTEN，机制研究表明miR-21通过靶向PTEN/Akt/mTOR通路来拮抗因过度自噬导致的神经元损伤。
论文解读：RVG修饰的BMSC-sEVs装载miR-21通过靶向PTEN/Akt/mTOR通路减轻脑缺血后神经元损伤
研究背景与立项依据
缺血性卒中（IS）是全球主要的致死和致残原因，现有治疗手段如静脉溶栓和机械取栓受限于严格的时间窗和适应症，导致多数患者无法获得有效干预。因此，探索新型治疗策略及其机制迫在眉睫。自噬是细胞清除受损成分的重要过程，在脑缺血（IS）中扮演“双刃剑”角色：生理水平的自噬有助于恢复，但过度自噬则诱导神经元凋亡。尽管已知mTOR通路主导自噬调控，但其上游信号在IS后过度自噬中的作用尚不完全清楚。磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）作为PI3K/Akt通路的抑制剂，具有调节mTOR依赖性自噬的潜力，但其在IS后自噬调控中的具体机制存在争议。
小细胞外囊泡（sEVs）作为天然纳米载体，能够穿越血脑屏障（BBB）并递送生物活性分子，其中BMSC来源的sEVs在IS治疗中显示出潜力。然而，系统性给药的天然sEVs仅有不到0.5%能进入大脑，且内部有益miRNA的丰度较低，严重限制了其疗效。狂犬病毒糖蛋白（RVG）因其对神经元表面乙酰胆碱受体（AchR）的高亲和力，常被用于修饰sEVs以实现脑靶向递送。同时，前期数据库分析及研究表明，miR-21-5p在卒中患者体内显著下调，且具有抗凋亡、抗炎及潜在的PTEN调控功能。鉴于此，本研究旨在通过生物工程化手段构建RVG修饰且装载miR-21的BMSC-sEVs，旨在解决sEVs脑靶向性差及 cargo 丰度低的问题，并深入探究其通过PTEN/Akt/mTOR通路改善IS后神经元过度自噬损伤的机制。该研究成果已发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。
主要关键技术方法
研究人员首先通过GEO数据库分析确定了IS患者中差异表达的miRNA。利用慢病毒共转染技术在BMSCs中导入RVG-Lamp2b质粒和miR-21-5p过表达质粒，制备生物工程化sEVs。采用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白质印迹（Western Blotting）对sEVs进行物理化学表征。通过氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型处理SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元，结合CCK-8、流式细胞术、免疫荧光和GFP-mCherry-LC3B自噬流检测评估细胞活力及自噬水平。利用短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAo）小鼠模型，通过改良神经功能缺损评分（mNSS）、握力测试、转棒实验、步态分析及TTC染色评估体内治疗效果。采用双荧光素酶报告基因实验和荧光原位杂交（FISH）验证miR-21-5p与PTEN的结合关系，并通过Western Blotting检测PTEN/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达变化。
研究结果
3.1 MiR-21-5p在卒中患者血浆及IS小鼠脑中下调且在BMSCs-sEVs中富集
通过对GEO数据库四个数据集的分析，研究人员发现hsa-miR-21-5p是IS患者血清中共享的下调miRNA之一。RT-qPCR证实了tMCAo小鼠脑内miR-21a-5p表达显著下降。对BMSC-sEVs进行miRNA测序显示，miR-21-5p是其含量最高的miRNA（占比62.253%），显著高于miR-24-3p和miR-92a-3p，这提示miR-21-5p可能在IS治疗中发挥关键作用。
3.2 生物工程化sEVs的制备与表征
研究人员成功构建了共表达RVG-Lamp2b和miR-21-5p的生物工程化BMSCs，并从中分离出RVG-miR21-sEVs。TEM显示各组sEVs均呈典型的杯状结构，NTA表明生物工程化未显著改变sEVs的平均粒径（约150-200 nm）和zeta电位（约-8 mV）。RT-qPCR证实miR-21-5p在RVG-miR21-BMSCs及其sEVs中成功过表达。稳定性实验显示，miR-21在sEVs内对RNase A具有抗性，且血清孵育未显著改变sEVs粒径，表明其具有良好的核酸稳定性和血清稳定性。Western Blotting检测到HA标签及sEVs标志物（TSG-101, Alix, CD9）的表达，验证了工程化sEVs的成功制备。
3.3 RVG修饰的sEVs显示出对缺血神经元的高亲和力
体外共培养模型显示，DiI标记的RVG-sEVs和RVG-miR21-sEVs能高效穿过脑内皮细胞单层并被下层原代皮层神经元摄取。体内成像结果显示，静脉注射DiR标记的RVG-sEVs和RVG-miR21-sEVs在tMCAo小鼠脑内的滞留量显著高于对照组，且随时间延长（48和72小时）仍维持较高浓度，证明RVG修饰有效增强了sEVs对缺血脑组织的靶向亲和力。
3.4 RVG-miR21-sEVs治疗减少脑梗死并改善IS小鼠的神经功能缺损
在tMCAo小鼠模型中，给予200 μg RVG-miR21-sEVs治疗显著减少了24小时后的脑梗死体积，改善了脑组织病理损伤（H&E和Nissl染色）及脑血流灌注。长期行为学测试表明，RVG-miR21-sEVs治疗组在mNSS评分、握力测试、转棒实验及步态分析方面均表现出优于其他组的神经功能恢复效果，且在14天内持续有效，表明其具有长期的神经修复潜力。
3.5 RVG-miR21-sEVs保护神经元免受过度自噬损伤并维持线粒体功能
体外实验确定40 μg RVG-miR21-sEVs为最佳治疗剂量。GFP-mCherry-LC3B自噬流检测显示，RVG-miR21-sEVs显著减少了OGD/R刺激后的自噬溶酶体数量，且该效应可被雷帕霉素阻断。同时，RVG-miR21-sEVs降低了细胞内ROS水平，提升了ATP生成量和线粒体膜电位（MitoTracker Deep Red荧光强度），增加了功能性线粒体比例。在原代皮层神经元中，RVG-miR21-sEVs促进了神经元形态复杂性（Sholl分析）及轴突生长。此外，该治疗还减少了体内外模型的神经元凋亡，且未引起明显的器官毒性、溶血或促炎反应。
3.6 RVG-miR21-sEVs通过miR-21靶向PTEN/Akt/mTOR轴减轻神经元自噬损伤
通过miRTarBase预测及双荧光素酶报告基因实验证实，miR-21-5p可直接结合PTEN的3‘UTR。FISH显示miR-21-5p与PTEN在细胞内共定位。在OGD/R处理的SH-SY5Y细胞和tMCAo小鼠脑组织中，RVG-miR21-sEVs治疗显著下调了LC3B-II和PTEN的表达，同时上调了SQSTM1、p-Akt和p-mTOR的水平。免疫荧光进一步显示其降低了缺血皮层中PTEN和LC3B的荧光强度。重要的是，转染miR-21抑制剂可逆转RVG-miR21-sEVs对自噬流的抑制作用及对PTEN、LC3B-II表达的调控，证明了该治疗机制依赖于miR-21/PTEN/自噬通路。
结论与讨论
本研究成功开发了具有脑靶向功能的RVG-miR21-sEVs。通过体内外实验证实，该工程化sEVs能有效穿越BBB，递送miR-21至缺血脑组织，通过抑制PTEN/Akt/mTOR通路下游的过度自噬，减轻神经元损伤和凋亡，从而显著改善缺血性卒中后的神经功能预后。该研究不仅提供了一种增强BMSC-sEVs治疗IS疗效的新策略，即结合脑靶向修饰与特定miRNA负载，还首次阐明了miR-21-5p通过靶向PTEN调控自噬在脑卒中保护中的药理机制。尽管研究在年轻小鼠模型中取得了积极成果，但作者也指出，未来仍需解决大规模标准化生产、潜在免疫原性评估以及在老年合并症模型中的疗效验证等问题，以推动该疗法的临床转化。
