基于多配体聚糖（Syndecan）的遗传方法实现小细胞外囊泡表面纳米抗体包被

《Journal of Extracellular Biology》：A Syndecan-Based Genetic Approach to Coat the Surface of Small Extracellular Vesicles With Nanobodies

　　

小细胞外囊泡（sEVs）是一种极具前景的靶向治疗递送载体，但目前其表面功能化的策略仍然有限。在此，研究人员提出了一种可靠且简便的遗传学方法，能够实现对sEV表面的定制化修饰，并支持受体细胞对sEV的增强摄取。该策略基于将靶向部分融合至多配体聚糖-1（SDC1）的C端片段（CTF）——一种天然富集于sEV中的肽段。结合包括单囊泡分析在内的多种分析方法，研究人员证实该策略能够使高达20%的分泌sEVs被纳米抗体（Nbs）修饰。在使用浓缩条件培养基进行的定量生物发光测定中，研究人员证明，用抗表皮生长因子受体（EGFR）Nb包被sEV可支持EGFR表达细胞对sEV的增强摄取。这一新策略为赋予sEV表面明确的靶向特性提供了稳健且模块化的解决方案，以支持进一步的sEV-based治疗应用。

论文解读：基于多配体聚糖的遗传方法实现小细胞外囊泡表面纳米抗体包被

研究背景与立项依据

细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有类型细胞释放的膜性细胞器，根据其异质性可分为小细胞外囊泡（sEVs，直径通常为50–150 nm）和大细胞外囊泡（lEVs，直径通常为200–1000 nm）。由于EVs具有低免疫原性，并能递送蛋白质、RNA和脂质以改变受体细胞的状态，因此被视为极具潜力的药物递送载体。尽管基于天然间充质基质细胞来源的EVs已在慢性肾病等疾病的治疗中进入临床试验，且经过修饰的EVs（如展示特定表面分子或装载治疗性货物）也在胰腺癌等治疗中展现出潜力，但该领域仍面临重大挑战。目前的改性EV疗法受限于低效的货物装载效率以及为实现预期治疗效果所需的大量EVs。因此，设计能够改善EVs向病变细胞靶向递送的可靠策略是当前研究的核心需求。

本研究建立在既往研究基础之上，已知多配体聚糖（SDCs）通过与syntenin的直接相互作用参与sEV的生物发生，其中SDC1的蛋白水解切割后的膜相关C端片段（CTF）是sEV的主要成分。此外，在上皮细胞中，SDC1-CTF比四跨膜蛋白更能预测sEV的数量，并且已被证明可作为EV表面修饰的排序介质。鉴于此，研究人员旨在评估将SDC1-CTF与纳米抗体（Nbs）等靶向部分融合后，是否能够实现sEVs的定制化表面包被，并测试这种包被是否能促进靶细胞对sEV的摄取（结合和/或内化）。

关键技术方法

本研究采用了多种关键技术手段：首先，通过Gateway克隆技术构建了一系列嵌合体质粒，包括将不同靶向分子（如抗Nef Nb、抗EGFR Nb）与SDC1-CTF及其他对照结构（如PDGFR-TM、PTGFRN）融合。其次，利用差速超速离心法（dUC）、尺寸排阻色谱法（SEC）及浓缩条件培养基（CCM）法分离和富集sEVs。为了验证sEV的表面包被情况及量化包被效率，研究人员综合运用了单囊泡分析技术，包括直接随机光学重建显微镜（dSTORM）、CytoFLEX Nano流式分析及微流控电阻脉冲传感结合荧光检测（MRPS-coupled fluorescence）。最后，通过将Nanoluciferase（NL）与syntenin融合蛋白装载入sEVs，建立了定量生物发光测定法，以评估sEVs在受体细胞中的摄取情况。

研究结果

3.1 基于SDC1-CTF的sEV表面包被策略

研究人员首先构建了一种包含SDC1信号肽、myc标记的Nb、CD4近膜域（JMD）以及SDC1-CTF的嵌合蛋白。Western blot分析显示，使用含有脯氨酸（P）的CD4-JMD能有效促进全长嵌合体在sEV中的分泌，避免了蛋白水解产生的截短产物。随后，研究人员将该策略与基于血小板衍生生长因子受体跨膜域（PDGFR-TM）及前列腺素F2受体负调节因子（PTGFRN）的策略进行了比较。结果表明，PDGFR-TM策略效果较差，而SDC1-CTF与PTGFRN策略在支持Nb向sEV分选的效率上表现相似。然而，进一步通过建立稳定表达的多克隆细胞群体发现，PTGFRN嵌合体在裂解物和EV组分中均产生了意外的高分子量信号，提示可能存在聚集风险；相比之下，SDC1-CTF策略不仅表现出相似的sEV分选效率，且具有更严格的sEV特异性，未观察到异常信号。纳米颗粒追踪分析（NTA）也证实该策略不影响EV的浓度和粒径分布。

3.2 单囊泡分析方法验证与纳米抗体包被定量

研究人员制备了均一表达无myc表记的SDC1-CTF Nef嵌合体（cNef）的HEK293克隆，并通过免疫荧光证实了嵌合体的正确拓扑结构。利用血清饥饿和超滤浓缩获得浓缩条件培养基sEVs（CCM sEVs），并采用三种单囊泡分析技术进行表征。纳米流式分析显示约6%的抗Nef CCM sEVs颗粒被Nb包被；超分辨率显微镜（ONI）分析显示，扣除Mock对照的背景噪音后，约有20%的四跨膜蛋白阳性sEVs含有抗Nef Nb；MRPS荧光联用技术测得约10%（±1%）的颗粒为Nb阳性。这些数据综合表明，在无血清条件下，SDC1-CTF嵌合体能够实现对相当一部分比例（6%–20%）的sEVs进行纳米抗体包被。

3.3 抗EGFR Nb包被增强EGFR表达细胞的sEV摄取

为了实现sEV摄取的定量，研究人员将NL与syntenin融合以实现高效装载。剂量反应曲线显示，Panc-1细胞对NL-syntenin负载的CCM sEVs的摄取呈饱和性。随后，研究人员构建了分泌抗EGFR Nb包被sEVs的HEK293克隆（cEGFR）。通过生物发光测定，研究人员比较了非包被、抗Nef包被及抗EGFR包被的sEVs在Panc-1细胞中的摄取情况。结果显示，在饱和剂量（200:1 生产细胞/受体细胞）下，抗EGFR包被的sEVs在240分钟内的平均摄取量是未包被或抗Nef包被sEVs的三倍。这表明通过SDC1-CTF融合实现的抗EGFR Nb包被能有效提高sEVs在EGFR表达细胞中的靶向摄取效率。

结论与意义

本研究开发并验证了一种利用由sEV标记物SDC1的胞质和跨膜域组成的嵌合蛋白来包被sEV表面的新策略，该嵌合体融合了免疫受体CD4的近膜蛋白酶抗性肽。研究表明，该嵌合体不仅能像先前描述的PTGFRN靶向策略一样高效地将功能性Nb分选至sEV，而且避免了PTGFRN可能产生的潜在聚集体问题，显示出更好的质量控制优势。通过单囊泡荧光分析和生物发光测定，研究人员证实该策略可实现高达20%的sEVs被功能性Nb修饰，并能显著增强syntenin负载的sEVs的摄取。

值得注意的是，该策略对sEV的大小或浓度无明显影响，且其主要改变在于sEV的组成。尽管不同单囊泡分析技术得出的包被百分比存在差异，但这可能与检测原理及抗体标记效率有关。通过NL-syntenin融合蛋白的装载，研究人员实现了对sEV摄取的定量测量，并客观验证了Nb包被带来的益处——抗EGFR包被使sEVs在Panc-1细胞中的摄取增加了三倍。这提示抗EGFR可能支持sEVs的一种受体介导的进入途径。

综上所述，SDC1-CTF嵌合体是一种用于工程化定制包被sEVs的有用遗传工具。与先前描述的策略相比，它提供了一个紧凑且蛋白酶抗性的设计，确保了纳米抗体的展示。该研究为sEV-based疗法的表面工程化提供了新的思路和模块化解决方案，具有重要的临床应用转化潜力。