Thioredoxin-1的过度表达能够缓解吗啡在BV-2细胞和小鼠腹侧被盖区诱导的神经炎症

《Neurochemistry International》：Overexpression of Thioredoxin-1 alleviates morphine-induced neuroinflammation in BV-2 cells and the ventral tegmental area of mice

　　

陆志鹏|杨龙|李翔|张乐|白杰

中国昆明理工大学医学院分子神经生物学实验室

摘要

吗啡的临床应用受到耐受性和成瘾性发展的限制。这些过程与小胶质细胞的神经炎症反应有关。硫氧还蛋白-1（Trx-1）是一种具有神经保护作用的关键内源性抗氧化剂，我们之前的研究表明，Trx-1的过表达可以阻断吗啡诱导的条件性位置偏好（CPP）。然而，Trx-1在吗啡诱导的小胶质细胞炎症反应中的作用仍不清楚。在这里，我们研究了Trx-1过表达对吗啡诱导的小胶质细胞促炎变化的影响及其潜在机制，既在BV-2小胶质细胞系中也在小鼠的腹侧被盖区（VTA）中进行了研究。体外实验表明，吗啡处理增加了BV-2细胞内的活性氧（ROS），上调了与小胶质细胞反应性相关的标记物（IBA-1和MHC-II），激活了NF-κB通路（通过增加p-IκBα和核p65的转位来证明），并提升了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的水平，同时降低了抗炎细胞因子IL-10的水平。通过腺病毒转导过表达Trx-1可以逆转所有这些由吗啡引起的效应。在体内实验中，使用CPP范式，我们确认Trx-1转基因（TG）小鼠的吗啡CPP被阻断。对这些小鼠的VTA进行生化分析发现，Trx-1的过表达同样减弱了由吗啡诱导的IBA-1、MHC-II和促炎细胞因子的上调，这与体外结果一致。机制上，共免疫沉淀实验显示Trx-1与μ-阿片受体（MOR）之间存在内源性相互作用。Trx-1的过表达显著增强了这种相互作用，并与MOR表达的增加相关。这些结果表明，Trx-1通过结合MOR并减少小胶质细胞中的ROS驱动的NF-κB激活来抑制吗啡诱导的神经炎症。这一机制使Trx-1成为提高阿片类药物成瘾临床安全性和有效性的潜在治疗靶点。

引言

由于吗啡的强大镇痛作用，它仍然是临床疼痛管理的基石，这种作用主要是通过μ-阿片受体（MOR）介导的。在MOR敲除小鼠中，吗啡的镇痛作用消失，这强调了该受体的关键作用（Matthes等，1996年）。然而，吗啡的长期临床应用受到镇痛耐受性和成瘾风险的严重阻碍。越来越多的证据表明，神经炎症是导致这些不良后果的关键病理机制（Cai等，2016年；Eidson等，2017年；Li等，2019年）。

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，在这一过程中起着核心作用。在生理条件下，小胶质细胞持续监测其周围环境，并与神经元动态互动以调节突触功能（Choi等，2020年；Watkins等，2005年）。吗啡暴露会破坏这种稳态。吗啡与小胶质细胞上的MOR结合会触发细胞内活性氧（ROS）的增加，破坏氧化还原平衡（Cai等，2016年）。这种氧化应激促进了向促炎小胶质细胞表型的转变，其特征是形态变化——从高度分支的、警戒的形态转变为变形虫状，并上调表面标记物，如离子钙结合适配分子1（IBA-1）和主要组织相容性复合体II类（MHC-II）（Eidson和Murphy，2013a；Eidson等，2017年；Gao等，2023年；Paolicelli等，2022年）。同时，这些细胞释放出更多的促炎细胞因子，包括白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-6。这些细胞因子可以直接增强神经元的兴奋性，并促进中枢敏化，从而抵消吗啡的镇痛作用并促进耐受性的产生（Li等，2019年；Eidson和Murphy，2013b）。因此，调节小胶质细胞的炎症反应已成为保持吗啡镇痛效果的潜在治疗策略。

硫氧还蛋白-1（Trx-1）是一种12-kDa的蛋白质，具有强效的抗氧化和氧化还原调节功能。作为Trx系统的主要成分，该系统还包括NADPH和硫氧还蛋白还原酶，Trx-1通过其保守的活性位点（-Cys32-Gly-Pro-Cys35-）来减少氧化的蛋白质硫醇，从而维持细胞内的氧化还原平衡（Zhang等，2017年；Lu和Holmgren，2014年）。除了直接清除ROS外，Trx-1还参与调节多种细胞过程，包括基因表达、信号转导和细胞凋亡（Zhang等，2023年；Bai等，2021年）。它的神经保护作用已有充分记录；例如，在阿尔茨海默病模型中，Trx-1的过表达可以促进线粒体生物发生，保护神经元免受甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）引起的损伤，并减轻局灶性缺血性脑损伤（Jia等，2023年；Takagi等，1999年；Zhang等，2018年）。最近的研究还发现Trx系统是先天免疫的一个内在检查点，Trx-1作为NLRP1炎性体的抑制剂（Zhang等，2023年）。

我们之前的研究建立了Trx-1与吗啡行为效应之间的联系。我们发现吗啡在神经元细胞系（PC12和SH-SY5Y）和体内中枢神经系统中诱导Trx-1的表达（Luo等，2012a，Luo等，2012b）。此外，用香叶基香叶基丙酮药理诱导Trx-1可以保护小鼠免受吗啡诱导的奖励反应，而Trx-1转基因（TG）小鼠不会对吗啡或甲基苯丙胺产生条件性位置偏好（CPP）（Luo等，2012a，Luo等，2012b；Guo等，2018年；Huang等，2018年；Li等，2018年）。尽管与阿片类奖励有明显的关联，但Trx-1在吗啡诱导的小胶质细胞炎症反应中的具体作用尚未得到研究。

鉴于Trx-1的抗氧化和免疫调节功能，我们假设它可能作为吗啡诱导的小胶质细胞促炎变化的内源性调节因子。在这项研究中，我们旨在确定Trx-1的过表达是否可以在体外和体内抑制吗啡诱导的小胶质细胞表型和神经炎症的变化，并阐明其潜在的分子机制。使用BV-2小胶质细胞系和Trx-1 TG小鼠的腹侧被盖区（VTA）在吗啡CPP模型中，我们研究了Trx-1对ROS产生、NF-κB通路激活、炎症细胞因子表达及其与MOR潜在相互作用的影响。

节片段

药物和试剂

BV-2细胞来自中国昆明动物研究所。盐酸吗啡来自中国沈阳第一制药厂（东北制药集团）。抗Trx-1（14999-1-AP）和β-actin（66009-I-lg）抗体购自Proteintech（Proteintech集团，美国）。抗IBA-1（ab178846）、Lamin B1（ab16048）、MHC-Ⅱ（ab180779）、IL-1β（ab9722）、IL-6（ab7737）、IL-10（ab133575，ab310329）、TNF-α（ab215188）抗体也来自Proteintech。

Trx-1的过表达阻断了小鼠的吗啡诱导的条件性位置偏好

为了确认Trx-1在阿片类奖励中的行为相关性，我们首先使用图1A所示的时间表评估了Trx-1过表达对吗啡诱导的CPP的影响，使用了WT和Trx-1 TG小鼠。选择20 mg/kg的剂量是因为它在C57BL/6小鼠中能够诱导强烈的CPP而不会引起明显的镇静作用（Luo等，2012a，Luo等，2012b；Li等，2018年）。双因素方差分析显示吗啡处理有显著的主效应（F_1,36 = 17.79，p < 0.001）。

讨论

在生理条件下，小胶质细胞持续监测其微环境，动态地伸展和收回突起以监测神经元功能和突触活动（Choi等，2020年；Watkins等，2005年）。吗啡暴露会破坏这种稳态，促进向促炎表型的转变，其特征是形态变化、与其反应性相关的标记物上调以及促炎细胞因子的产生增加（Cai等，2016年）。

CRediT作者贡献声明

陆志鹏：撰写——原始草案、方法学、形式分析、数据管理、概念化。杨龙：方法学、形式分析、数据管理。李翔：方法学、形式分析、数据管理。张乐：方法学、形式分析、数据管理。白杰：监督、资源协调、项目管理、资金获取、概念化。

伦理声明

所有适用的国际、国家和/或机构关于动物护理和使用的指南均得到遵守。所有研究程序均符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准以及1964年赫尔辛基宣言及其后续修订案或类似的伦理标准。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可向相应作者请求获得。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：U2002220、82371271）、昆明理工大学医学神经生物学重点实验室的资助，以及云南省氧化应激与防御创新团队的资助（编号：202305AS350011）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

不适用。