综述：中枢神经肽Y在不同程度上调节了暴露于高温环境与未暴露于高温环境的小鸡的体温

《Neuromuscular Disorders》：Central neuropeptide Y differentially regulates body temperature between heat-exposed and non-heat-exposed chicks

　　玛丽亚·查齐奥安尼迪 | 西村晴香 | 穆罕默德·Z·埃尔胡西尼 | 大内良光 | 原口茂臣 | 原口正吾 | 伊丽莎白·R·吉尔伯特 | 马克·A·克莱因 | 约翰·F·科克雷姆 | 克里斯托斯·巴拉斯卡斯 | 高桥英树 | 文吾隆 | 维什瓦吉特·S·乔杜里
日本九州大学生物资源与生物环境科学研究生院动物营养生理学实验室，福冈819-0395

**摘要**
由于暴露在高温环境中而引起的热应激会影响家禽的体温调节和代谢平衡，中枢神经肽通路在这些反应中起着关键作用。中枢注射神经肽Y（NPY）在常温条件下（CT）可以导致雏鸡体温下降，但在高温环境下的体温调节作用仍不清楚。在本研究中，雄性雏鸡被腹腔注射1纳米摩尔（nmol）的NPY，随后分别暴露在常温（CT：30±1°C）、中等温度（MT：35±1°C）或高温（HT：40±1°C）下2小时。我们确认了NPY在常温条件下的降温效果。有趣的是，NPY在高温条件下反而导致了体温升高。此外，在常温和高温条件下，NPY注射均降低了血浆中的葡萄糖浓度。同时，NPY注射后，中脑的多巴胺浓度增加，而3-甲氧基-4-羟基苯基乙醇的代谢速率下降。综上所述，NPY在常温条件下的降温作用转变为高温条件下的升温作用，结合多巴胺能和代谢调节机制，表明儿茶酚胺的代谢可能参与了NPY的差异性体温调节作用。

**1. 引言**
热应激是家禽生产中已知的环境挑战，会影响体温调节、生长表现、 feed摄入以及整体生理调节（Chowdhury等人，2012；Kjellstrom和McMichael，2013；Ito等人，2015；Oladokun和Adewole，2022）。最近的研究通过测量体温、单胺分析以及血浆代谢物和皮质醇水平来探讨新生雏鸡的热应激机制（Chowdhury等人，2015；Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017；Elhussiny等人，2022；Nishimura等人，2022）。大多数研究使用直肠温度作为可靠的体温和热负荷指标，因为高温环境会破坏产热与散热之间的平衡，从而导致体温升高（Siegel和Drury，1968；Chowdhury等人，2012；Prates，2025）。鸟类的体温调节受到下丘脑单胺能神经传递的强烈影响，这一点通过向哺乳动物和雏鸡脑内注射单胺的研究得到证实（Bruinvels，1970；Denbow等人，1983），而且最近的证据也支持单胺在中枢体温调节中的作用（Elhussiny等人，2022）。因此，单胺分析有助于了解体温调节的潜在机制。
除了中枢神经化学调节外，热应激还会引起外周代谢和内分泌变化，包括血浆中的葡萄糖、甘油三酯和电解质等代谢物的变化，反映出热负荷期间能量利用和液体平衡的调整（Eltahan等人，2017；Elhussiny等人，2021）。重要的是，血浆皮质醇可作为应激状态下下丘脑-垂体-肾上腺轴活动的指示物；然而，其在雏鸡中对热应激的反应存在差异且依赖于具体环境（Chowdhury等人，2012；Bahry等人，2017）。神经肽Y（NPY）是最强的促食欲神经肽之一，对调节食物摄入和能量平衡有重要作用（Kuenzel等人，1987；Kuenzel和McMurtry，1988；Furuse等人，1997），并且还具有抗应激作用（Bahry等人，2017；Nishimura等人，2022）。NPY的中枢注射会影响雏鸡的体温、代谢状态和神经内分泌反应（Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017）。特定剂量（375皮摩尔）的NPY在常温条件下可导致雏鸡体温下降（Tachibana等人，2006；Bahry等人，2017）；但在中等温度条件下结果各异（Eltahan等人，2017；Nishimura等人，2022）。据我们所知，尚无关于NPY在高温条件（HT：40±1°C）下对体温调节作用的研究。Nishimura等人（2022）报告称375皮摩尔剂量在常温条件下能降温，但在中等温度下无效果，表明该剂量可能不足以改变高温条件下的体温调节。更高剂量NPY对常温和高温条件下体温调节的影响尚需进一步研究。因此，本研究的目的是探讨增加中枢注射NPY剂量是否会影响中等和高温条件下的体温调节，并研究相关的中脑单胺、血浆代谢物和皮质醇的变化，以阐明NPY在高热应激下引起体温变化的神经内分泌和代谢机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物
实验1和2使用从当地孵化场（日本熊本县Tsuboi孵化场）购买的受精鸡蛋（Julia品种；Gallus gallus domesticus），放置在SHOWA P2008型孵化器（SHOWA Furanki公司，日本埼玉县）中；实验3使用Rcom Maru Deluxe MAX 380孵化器（Autoelex有限公司，韩国），温度设为37.6°C，相对湿度约为60%，每小时自动翻动一次。孵化第19天将鸡蛋移到孵化室，孵化后的雏鸡按每笼20只分组饲养在金属笼子（50×30×33厘米）中，环境温度为常温（CT：30±1°C），并持续照明，自由摄取饲料（Toyohashi饲料有限公司，爱知县；代谢能＞12.55 MJ/kg，蛋白质＞23%）和水分。通过羽毛鉴定在孵化后2天选择雄性雏鸡。我们基于先前的研究（Ito等人，2015；Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017）选择雄性雏鸡。雏鸡最初每笼2只共饲养24小时，然后单独放入塑料笼子（15×28×13厘米）中，在上述相同条件下适应环境。所有三个实验中，雏鸡的体重在各处理组间分布均匀。本研究遵守九州大学和日本法律关于动物实验的规定，特别是《动物福利与管理法》（2019年6月19日第39号法案）。所有方案和程序均获得九州大学机构动物实验委员会的批准（批准号A24-353-4）。
2.2. 药物制备和腹腔注射
本研究中使用的处理方法包括仅含溶剂的对照组和1.0纳米摩尔（nmol）的NPY（猪源，大阪Peptide Institute），溶解在含有0.1% Evans Blue的生理盐水中（Wako Pure Chemical Industries有限公司，大阪）。选择猪源NPY是因为其与鸡的NPY-Y1、-Y4和-Y5受体的亲和性（Lundell等人，2002）。NPY剂量基于Nishimura等人（2024）的研究及我们实验室的初步实验结果。注射前将样品置于冰上。注射方法遵循Davis等人（1979）的方法进行。注射时将每只雏鸡的头部放入一个带有孔洞的丙烯酸装置中，该装置紧贴左侧脑室上方。通过上述孔洞将微量注射器插入左侧脑室。为防止液体溢出，注射器需保持到位10秒。这种注射方法对雏鸡的进食和血浆皮质醇浓度无影响（Furuse等人，1999；Saito等人，2005），因此无需麻醉。实验结束后对雏鸡实施安乐死并取出大脑，确认脑室中是否存在Evans Blue染料。未检测到Evans Blue染料的雏鸡被排除在分析之外。
2.3. 实验设计
**实验1（中等热应激）**：6日龄的雏鸡（每组12只）被放置在温控箱（Panasonic Electric有限公司，日本；型号：Panasonic MIR-254）中，向其腹腔注射10微升生理盐水或1纳米摩尔的NPY（0.004254毫克），并在常温（CT：30±1°C）或中等温度（MT：35±1°C）下保持120分钟，期间仅提供水分。MT条件基于我们之前的研究确定。在注射前0分钟、注射后60分钟和120分钟测量直肠温度。使用精度为±0.1°C的数字温度计（Thermalert TH-5，Physitemp Instruments Inc.，美国）通过肛门将温度计探头插入结肠（直肠）至2厘米深度进行测量（方法与Chowdhury等人，2015；Ito等人，2015；Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017；Nishimura等人，2015；Nishimura等人，2022）相同。120分钟的热暴露后，所有雏鸡均被过量吸入异氟醚（Mylan Inc.，东京）实施安乐死。
**实验2（高温）**：使用与实验1相同的方法；但6日龄的雏鸡（每组12只）暴露在高温（HT：40±1°C）下。安乐死后立即从颈静脉采集血液，放入肝素化试管中，在4°C下以10,000×g离心4分钟获得血浆，随后储存在-80°C下进行血浆代谢物分析。同时收集中脑组织并快速冷冻在液氮中，储存在-80°C下进行单胺分析。
**实验3（仅高温）**：5日龄的雏鸡（每组10只）腹腔注射1纳米摩尔的NPY或生理盐水，仅暴露在高温（HT：40±1°C）下，以确认NPY的中枢体温调节作用。与实验1和2类似，但在注射后禁食120分钟。
2.4. 脑单胺浓度分析
脑单胺浓度（包括肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、3-甲氧基-4-羟基苯基乙醇（MHPG）、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、3,4-二羟基苯基乙酸（DOPAC）、多巴胺（DA）和homovanillic酸（HVA）采用HPLC（HTEC-510；Eicom有限公司，京都，日本）进行测定，方法根据Elhussiny等人（2022）的描述。具体步骤包括对实验2收集的脑样本进行匀浆、冰上孵育脱蛋白、离心去除组织碎片。准备外部标准溶液和流动相，以便通过自动进样器进行灌注和注射。使用150毫米×3毫米的十八烷基硅烷柱（Eicompak SC-5ODS；Eicom，京都，日本）在25°C下分离单胺，并在+0.75V的施加电位下通过Ag/AgCl参比电极检测电流变化（nA），结果通过界面系统（Power Chromver 2.3.2.J：AD Instruments，东京，日本）记录。单胺浓度基于峰值面积计算，单位为pg/mg湿组织。
2.5. 血浆代谢物和皮质醇分析
实验2获得的血浆用于测定葡萄糖、甘油三酯、尿酸、总胆固醇、钙、钠和氯离子浓度（使用Dri-Chem 7000系统，富士医疗系统有限公司，日本）。实验3获得的血浆用于检测皮质醇。使用酶免疫测定 kit（Corticosterone ELISA Kit，Enzo Life Science Inc.，纽约Farmingdale）测定血浆皮质醇，结果以ng/mL表示。该测定方法对相关类固醇（包括孕烯醇酮和β-雌二醇）的交叉反应率低于0.03%。测定的检测限为27.0 pg/mL。
2.6. 统计分析
实验1和2的直肠温度数据采用重复测量三因素方差分析（ANOVA）进行统计分析；实验3的直肠温度数据采用重复测量双因素方差分析（ANOVA），使用StatView 5.0软件（SAS Institute Inc.，美国卡里，NC）。单胺和血浆代谢物的统计分析采用GraphPad Prism 11.0.0软件进行。当检测到显著交互作用时，使用Tukey–Kramer检验进行事后分析。血浆皮质醇浓度采用t检验进行分析。数据以平均值±标准误（SEM）表示。异常值通过Thompson的拒绝检验剔除（P<0.01），剩余数据按Kobayashi和Pillai（2013）的方法进行处理。

**3. 结果**
**3.1. 直肠温度的变化**
NPY的中枢注射显著降低了常温条件下的雏鸡直肠温度（F [1, 111] = 5.011，P<0.05），但在中等温度条件下无此效果（图1A）。处理、时间和温度之间的相互作用显著（F [2, 111] = 17.123, P < 0.0001），表明中枢NPY注射导致在60分钟（P < 0.05）和120分钟（P < 0.0001）时，与注射生理盐水的雏鸡相比，雏鸡的直肠温度降低（图1A）。在实验2中，处理、温度和时间（40 ± 1°C）之间也发现了显著的相互作用（F [2, 139] = 8.315, P < 0.001）（图1B），表明在这些变量组合下，直肠温度、处理和时间之间的关系存在差异，特别是在120分钟时（P < 0.0001），注射NPY的雏鸡温度较低。值得注意的是，中枢注射NPY显著地（F [1, 49] = 24.817, P < 0.001）提高了40 ± 1°C高温下的直肠温度（图1C）。还观察到了处理与时间之间的显著相互作用（F [2, 49] = 7.769, P < 0.01），表明与注射生理盐水的雏鸡相比，注射NPY的雏鸡在60分钟（P < 0.001）和120分钟（P < 0.01）时的直肠温度显著升高（图1C）。

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**图1.** 在控制性中性温度（CT；30 ± 1°C）、中等环境温度（MT；35 ± 1°C；A）和高温（HT；40 ± 1°C；B）下，注射生理盐水或1 nmol NPY后0、60和120分钟雏鸡的直肠温度，以及仅在HT（40 ± 1°C）下注射生理盐水或1 nmol NPY后0、60和120分钟的直肠温度。D面板显示了注射生理盐水或1 nmol NYP后120分钟的血浆皮质酮浓度。数值为每组10-12只雏鸡的平均值±标准误差（SEM）。*、**、***、**** 分别表示组间差异显著，对应于P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001。

**3.2. 血浆皮质酮和代谢物**
中枢注射NPY对40 ± 1°C高温下的血浆皮质酮浓度没有显著影响（F [7, 7] = 1.904, P = 0.5486），与注射生理盐水的雏鸡相比（图1D）。血浆葡萄糖浓度在HT下显著升高（F [1, 36] = 21.81, P < 0.0001），而在CT和HT下注射NPY后显著降低（F [1, 36] = 5.856, P < 0.05）（见表1）。此外，暴露于HT还增加了血浆钠（F [1, 35] = 12.79, P < 0.05）和氯化物（F [1, 34] = 56.96, P < 0.0001）浓度；然而，降低了三酰甘油（F [1, 35] = 8.499, P < 0.01）和钙（F [1, 34] = 43.00, P < 0.0001）浓度（表1）。温度或处理对血浆尿酸、总胆固醇和钾没有显著影响（补充表1）。

**表1.** 在HT暴露下，通过脑室内注射高剂量NPY（1 nmol）的雏鸡的血浆代谢物浓度。
| 代谢物 | 生理盐水 | NPY | CT | HT | CT | HT | NPY×HT |
|-------|------|------|-------|-------|-------|-------|
| 葡萄糖（mg/dl） | 255.3 ± 7.3 | 281.9 ± 12.3 | 221.6 | 274.4 | 5 | 274.4 |
| | ± 7.3 | ± 12.3 | ± 4.0 | ± 4.0 | ± 9.1 | ± 9.1 |
| | P < 0.05 | P < 0.0001 | | | |
| 三酰甘油（mg/dl） | 41.44 ± 2.86 | 37.11 ± 2.95 | 41.45 | 34.91 | ± 2.2 | ± 2.2 |
| | ± 2.86 | ± 2.95 | ± 1.8 | ± 1.8 | ± 2.2 | P < 0.01 |
| | | | | | |
| 钙（mEq/l） | 11.78 ± 0.14 | 10.66 ± 0.25 | 11.49 | 10.56 | ± 0.25 | ± 0.25 |
| | ± 0.14 | ± 0.25 | ± 0.16 | ± 0.25 | | P < 0.0001 |
| | | | | | |
| 钠（mEq/l） | 141.44 ± 0.56 | 141.78 ± 0.46 | 139.90 | 142.09 | ± 0.46 | ± 0.46 |
| | ± 0.56 | ± 0.46 | ± 0.31 | ± 0.46 | | P < 0.05 |
| | | | | | |
| 氯化物（mEq/l） | 95.44 ± 0.90 | 99.89 ± 1.35 | 94.55 | 102.18 | ± 0.81 | ± 0.81 |
| | ± 0.90 | ± 1.35 | ± 0.70 | ± 0.81 | | P < 0.0001 |
| | | | | | |

**每组使用的雏鸡数量为8-11只。数值为平均值±标准误差。**
CT：控制性中性温度（30 ± 1°C）；HT：高温（40 ± 1°C）；NPY：神经肽Y。

**3.3. 单胺类物质**
中枢NPY注射显著增加了CT和HT下中脑中的多巴胺（DA）浓度（F [1, 33] = 6.854, P < 0.05）（图2A）；而MHPG/NE比率下降（F [1, 31] = 4.164, P < 0.05）（图2B）。CT和HT下DOPAC、NE、E、MHPG、HVA、5-HT和5-HIAA及其比率（5-HIAA/5-HT和DOPAC/DA）的浓度未受NPY影响（补充表2）。

**讨论**
本研究研究了中枢NPY对雏鸡体温的影响。接受1 nmol NPY并暴露于HT（40 ± 1°C）的雏鸡表现出体温升高，而在MT（35 ± 1°C）下没有显著效果；而在CT（30 ± 1°C）下，NPY表现出体温降低的效果。在给予脑室内注射NPY（1 nmol）的雏鸡中，HT下直肠温度显著升高，而在MT下则没有（见图1C），这表明中枢NPY对体温调节的影响可能在中等和高热负荷情况下有所不同。相比之下，NPY在CT下的降温效果保持一致，即使剂量高于先前的研究（Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017；Nishimura等人，2022）。这种模式似乎反映了哺乳动物的观察结果，即中枢NPY在低温下导致降温，在高温下则导致升温（Bouali等人，1995）。早期研究表明，在高温条件下，单胺能系统可能会有不同的反应，包括NPY的降温和升温效果（Bruinvels，1970）。本研究中，在CT和HT下发现了与NPY相关的脑内DA浓度升高。Denbow等人（1983）报告称，中枢DA注射可以防止体温下降。因此，本研究中观察到的NPY中枢注射后DA浓度升高可能减弱了NPY在CT下的降温效果，并可能促进了HT下的升温效果。NE与MHPG的比率表明NE的转化减少；这表明NE在中脑中的储存增加而不是转化为MHPG。先前的研究报告称，脑内NE的增加可以降低雏鸡的体温（Denbow等人，1983；Elhussiny等人，2022）。然而，Bruinvels（1970）指出，在大鼠中，较高的脑内NE剂量可以将低温引起的降温效果逆转为升温。因此，中枢NPY注射可能在CT下具有降温效果；并且也可能在HT下促进升温。最近，Elhussiny等人（2025）报告称，中枢牛磺酸注射（Elhussiny等人，2022）可以增加脑内去甲肾上腺素代谢，从而诱导更快的散热行为，包括喘气和翅膀下垂。需要进一步研究喘气和翅膀下垂的行为，并深入分析热应激标志物（如脑中的热休克蛋白）的mRNA和蛋白质表达，以确定NPY依赖的HT升温是否增强了散热行为。

在分析的血浆代谢物中，只有葡萄糖在CT和HT条件下显著降低。HT下血浆葡萄糖增加，可能反映了应激引起的代谢反应（Chowdhury等人，2012）；但在CT和HT下注射1 nmol NPY后，血浆葡萄糖降低；进一步支持中枢NPY可以通过减轻应激来促进合成代谢活动（Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017）。HT下血浆电解质浓度显著改变，血浆钙显著降低，钠和氯化物增加。这些变化与对热负荷的生理反应一致（Deswal和Chohan，1981；Lin等人，2006；Elhussiny等人，2021）。在本研究中，HT下中枢NPY并未显著改变血浆皮质酮浓度。与先前关于皮质酮对热应激反应的报告（Chowdhury等人，2012；Bahry等人，2017；Eltahan等人，2017）相反，目前的发现表明，尽管NPY在高温下引起升温，但它并未刺激雏鸡的应激反应。因此，NPY在HT下引起的升温可能不会对雏鸡造成应激。

**结论**
本研究显示，中枢高剂量的NPY在暴露于高温的雏鸡中引起升温，这种反应可能不是应激反应，因为血浆皮质酮没有变化。脑内DA浓度升高和MHPG/NE转化率降低进一步表明，单胺代谢可能以环境温度依赖的方式参与NPY依赖的体温调节。

**作者贡献声明**
Maria Chatziioannidi：撰写——原始草稿、调查、正式分析、数据管理、撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。
Haruka Nishimura：调查、正式分析、数据管理、可视化、方法学。
Mohamed Z. Elhussiny：撰写——审阅与编辑、调查、正式分析、数据管理。
Yoshimitsu Ouchi：撰写——审阅与编辑。
Shogo Haraguchi：撰写——审阅与编辑、资金获取。
Elizabeth R. Gilbert：撰写——审阅与编辑。
Mark A. Cline：撰写——审阅与编辑。
John F. Cockrem：撰写——审阅与编辑。
Christos Βalaskas：撰写——审阅与编辑。
Eiki Takahashi：撰写——审阅与编辑。
Takashi Bungo：撰写——审阅与编辑。
Vishwajit S. Chowdhury：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。

**作者协议**
作者声明本文是原创的，尚未提交给其他期刊，也未考虑在其他地方发表。所有作者均已阅读并批准提交的最终版本的手稿。