在高性能液相色谱法分析小分子药物中以甲磺酸和碳酸二甲酯替代具有生态风险的三氟乙酸和乙腈

《Journal of Separation Science》：Replacing Ecologically Risky Trifluoroacetic Acid and Acetonitrile With Methanesulfonic Acid and Dimethyl Carbonate in High-Performance Liquid Chromatography Analyses of Small Molecule Drugs

　　

长期以来，人们已认识到，从长远看，在高效液相色谱（HPLC）中，应替换流动相中的有害成分乙腈（ACN）以及作为离子对试剂的环境关键物质三氟乙酸（TFA）。然而，依赖这些试剂的色谱方法仍被广泛使用。本研究表明，用于小分子药物分析的替代方法（以药物质量控制和药物化学中的实例为例）是容易实现的。首先，研究人员在不改变核心方法的前提下，将绿色分析化学原理应用于欧洲药典茶碱一水合物专论的替代HPLC方法中。在测试的各种条件中，与原始的基于ACN的药典方法相比，使用2%碳酸二甲酯（DMC）提供了等效的分离度，并获得了略微改善的分辨率。在第二种方法中，研究人员提出了一种高度可持续的梯度HPLC方法用于合成产物的常规纯度分析，其用安全、可生物降解且环境友好的甲磺酸（MSA）替代了TFA。此外，对于该梯度方法，乙腈（ACN）亦可被可生物降解且环境友好的碳酸二甲酯（DMC）替代。研究发现，由42份DMC、23份EtOH、35份H2O和0.1份MSA组成的洗脱液成分，等同于含有0.1% TFA的ACN洗脱液。通过采用乙醇（EtOH）作为共溶剂的可重复方案，研究人员能够克服当前HPLC中有机碳酸酯应用面临的主要挑战（即其与水有限的混溶性）。鉴于基于ACN作为洗脱液和TFA作为酸性调节剂的梯度HPLC方法仍被广泛使用，本文提出的方法在推进药物质量控制和药物化学中可持续性的实施方面具有显著潜力。

论文解读：高效液相色谱分析中可持续溶剂的替代研究

1. 研究背景、问题与动机

高效液相色谱（HPLC）是药物质量控制和药物化学研究中不可或缺的分析分离技术。然而，其广泛使用的洗脱液乙腈（ACN）和离子对试剂三氟乙酸（TFA）存在显著的环境与健康风险。ACN具有吸入、摄入和皮肤吸收毒性，且供应受其作为其他行业（如涂料工业）副产物波动的影响。TFA则因其全氟烷基结构而被归为持久性有机污染物（PFAS），化学性质高度惰性，在环境中极难降解，并已在全球水体和环境（如年代葡萄酒中）中被检测到浓度持续升高。此外，TFA对不锈钢HPLC泵和组件具有腐蚀性，增加了设备维护成本。因此，寻找更安全、可生物降解且性能相当的替代溶剂与试剂，是绿色分析化学和可持续制药实践的迫切需求。本研究旨在证明，在不影响分析性能的前提下，可以顺利地从传统ACN/TFA基HPLC方法过渡到使用更可持续的替代物（特别是DMC和MSA）的方法，以推动制药行业分析方法的绿色化进程。

2. 关键技术方法

本研究通过两个核心实验来验证替代方案的可行性。首先，采用等度洗脱方法，以欧洲药典（Ph. Eur.）中茶碱一水合物纯度测试方法为模型，用四种不同替代溶剂体系（2% DMC、3% PC、10%乙醇、4%乙醇/3%异丙醇混合物）完全替换原方法中的7% ACN，同时保持其余缓冲液条件不变。其次，采用梯度洗脱方法，以实验性候选药物Ro 48-8071的纯度分析为模型。此部分研究分为两步：第一步，在不改变ACN洗脱液的前提下，直接将0.1% TFA替换为0.1% MSA；第二步，开发全新的、基于DMC的洗脱液体系，该体系由DMC/EtOH/H₂O（42:23:35）与0.1% MSA（A液）和H₂O/EtOH（80:20）与0.1% MSA（B液）组成，以同时替代ACN和TFA。所有实验使用VWR Hitachi Chromaster LC系统，采用C18色谱柱，并比较了不同方法下的色谱性能、分辨率、保留时间和背压等关键参数。

3. 研究结果与结论

3.1 等度方法（Isocratic Method）结果

研究人员测试了多种ACN替代溶剂，结果显示所有方案均能满足茶碱与可可碱最小分辨率≥2.0的药典要求。其中，使用2% DMC的方案表现最佳，不仅实现了与原ACN方法相近的保留时间，其色谱分辨率甚至略有改善，特别是成功分离了在ACN方法中未能分离的杂质B和D。3% PC、10% EtOH及4% EtOH/3% i-PrOH混合体系也提供了可接受的分离效果，但咖啡因峰存在一定拖尾。所有替代溶剂均导致背压显著高于ACN（DMC: 约166 bar, ACN: <80 bar）。有机碳酸酯（DMC, PC）与水的混溶性有限，需在超声波浴中预混合以获得稳定的流动相，这限制了其在二元梯度在线混合中的应用。DMC因其无毒、可生物降解和高洗脱强度（是ACN的两倍多）而成为有前景的替代品。

3.2 梯度方法（Gradient Method）结果

在保持ACN洗脱液不变的前提下，用0.1% MSA等浓度替换0.1% TFA，对Ro 48-8071及其杂质进行梯度分析。结果显示，两种方法获得的色谱图在目标化合物保留时间和杂质分离度方面几乎完全相同，证明了MSA可以完全替代TFA，且重现性高。MSA作为更强的有机酸（pK_a≈ -1.9），具有与TFA相当的离子对性质，但优势在于其生物降解性、低腐蚀性和更高的安全性（其多种盐形式已被批准为药物）。随后，研究人员开发了基于DMC/EtOH/H₂O/MSA的新型可持续梯度洗脱液体系，以同时替代ACN和TFA。通过优化乙醇作为共溶剂的比例，解决了DMC与水混溶性差的问题。使用与原始ACN/TFA方法相同的梯度程序，新方法获得了与原始方法几乎一致的保留时间和等效的杂质分离效果。这表明，DMC（与EtOH联用）和MSA的组合可以完全替代传统梯度HPLC中的ACN和TFA，而不影响分析性能。

4. 讨论与结论

4.1 研究结论

研究人员成功开发了替代危险及环境有害物质（ACN和TFA）的HPLC方法，使用了更可持续、毒性更低的替代品，实现了等效甚至改进的色谱性能。具体而言，碳酸二甲酯（DMC）和甲磺酸（MSA）被证明是完全可以替代的物质。对于等度方法，含有少量DMC（如2%）的流动相易于实施，但需要超声预处理以促进混合过程。对于更高DMC含量的疏水性流动相，最佳实施方式是使用DMC和EtOH的混合物作为共溶剂，以克服DMC有限的水溶性。研究发现，DMC/EtOH/H₂O（42:23:35）的组成在洗脱强度和色谱性能上等同于100% ACN。该主要有机相可与水相（H₂O/EtOH [80:20]）结合用于梯度洗脱。总体而言，EtOH作为共溶剂的使用，是显著拓宽有机碳酸酯作为流动相组分适用性的关键。作为一种用于离子对的酸性调节剂，有害、具腐蚀性且对环境问题严重的TFA，可以简单直接地被安全、腐蚀性更低且可生物降解的MSA所替代。MSA不仅可以作为TFA的可持续替代品用于传统的基于ACN的梯度方法，更重要的是，也可用于新开发的基于DMC的梯度方法，从而形成一种高度可持续的、适用于广泛测试物质纯度分析的梯度方法。值得注意的是，新开发的梯度系统可以使用与原始基于ACN和TFA的方法相同的A/B梯度斜坡运行，产生几乎相同的保留时间和等效的峰分离效果。鉴于DMC作为洗脱液和MSA作为离子对试剂至少在色谱性能上等效，且基于ACN和TFA的梯度HPLC方法仍在被广泛使用，本文提出的方法在推动药物质量控制和药物化学常规纯度分析中可持续性的实施方面具有巨大潜力。

4.2 总结与展望

本研究系统论证了在HPLC分析中，用DMC替代ACN、用MSA替代TFA的完全可行性。通过巧妙的溶剂配方（如引入EtOH作为共溶剂）和条件优化，新方法在分离度、保留时间等关键色谱参数上达到了与传统方法同等甚至更优的水平。这为药物分析和研发实验室减少有害化学品使用、降低环境足迹、提升操作安全性提供了直接、可操作的解决方案，有力地推动了绿色分析化学在制药工业中的实际应用。