综述：样品制备与木质素（Lignans）的液相色谱分离

《Journal of Separation Science》：Sample Preparation and Separation of Lignans by Liquid Chromatography

　　

木质素（Lignans）是一类重要的植物化学成分，主要存在于针叶树的树脂中，同时也通过芝麻籽和特级初榨橄榄油等食物进入人体饮食。由于其主要药理特性源于抗氧化活性，且已被证实具有细胞毒性和抗菌作用，因此备受关注。尽管葡萄酒和橄榄油等简单样品可直接分析，但大多数复杂基质样品在分析前需经过液液萃取（LLE）或硅胶柱色谱等广泛的样品制备流程。木质素的检测通常依赖于质谱（MS）或紫外可见分光光度法（UV-Vis），但荧光检测器和库仑电极阵列检测器（CEAD）等其他方法也被证明有效。本综述描述了木质素的典型特征，重点关注其主要药用价值，以及典型的样品制备方法和液相色谱分析技术。

1 引言

木质素属于天然多酚类化合物，由苯丙烷单元二聚而成，常见于针叶树的树脂、树皮和节子中，也分布于多种树种的枝条、叶片、种子和果实中。在人类饮食中，木质素通过芝麻、亚麻等油料种子、橄榄油、富含纤维的食物以及茶、葡萄酒等饮料摄入。富含木质素的饮食已知具有降低心血管疾病和乳腺癌风险的健康益处。由于其雌激素样结构，木质素被归类为植物雌激素（phytoestrogens），具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗真菌特性。市场上已有含木质素富集云杉树脂的药膏和膳食补充剂产品。

对于不同基质中木质素的分析，高效液相色谱（HPLC）是最合适的技术。由于木质素包含极性和半极性分子，它们可以在常规HPLC条件下得到良好分离，且通常无需衍生化处理。本综述概述了木质素的样品制备技术及分析方法，特别是HPLC技术的应用，涵盖其药用效应、样品制备（提取与纯化）以及HPLC固定相、洗脱剂和检测器的选择。

2 木质素

木质素是由苯丙烷通过丙基侧链中心碳原子（8,8'位）偶联形成的二聚体。根据其连接方式和结构特征，可分为新木质素（neolignans）、降木质素（norlignans）和寡聚木质素（oligolignans）。在自然界中，某些异构体常因定向蛋白和酶的引导而过量存在，如(+)-松脂醇（(+)-pinoresinol）、(+)-落叶松脂醇（(+)-lariciresinol）和(?)-罗汉松脂素（(?)-matairesinol）。木质素可根据中心连接结构分为二苯甲基丁内酯醇、二苯并环辛二烯、二苯甲基丁内酯、二苯甲基丁烷、芳基萘、芳基四氢萘、呋喃和呋喃呋喃等亚类。其中，呋喃呋喃木质素是食物和植物中最常见的亚类，其特征骨架为2,6-二芳基-3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷。

木质素在微生物、昆虫、动物和人类中具有广泛的生物活性，包括生长抑制、拒食、抗菌、抗氧化和抗真菌活性。目前，微量木质素及其代谢物在复杂生物基质中的定量分析主要依赖液相色谱-质谱联用（LC-MS），该技术具有高分离选择性和灵敏的化合物特异性检测优势。然而，LC-MS常受基质效应（matrix effects）困扰，导致信号增强或抑制。解决策略包括使用稳定同位素标记标准品（SILSs）进行内标标准化，或采用基质匹配校准曲线。此外，商业化木质素标准品的稀缺和高昂成本也是该领域研究的瓶颈。在植物生命周期中，木质素被认为具有防御功能，如受伤后生成的松脂醇可保护幼虫免受蚁害。哺乳动物摄入植物木质素后，肠道微生物会将其转化为哺乳动物木质素——肠二醇（enterodiol）和肠内酯（enterolactone）。

2.1 木质素的药用效应

虽然木质素以抗氧化能力著称，但在1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除试验中表现不佳，反而在2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）和铁还原抗氧化能力（FRAP）测定中显示出强效抗氧化性。在抗炎方面，木质素主要通过抑制一氧化氮（NO）、前列腺素E₂（PGE₂）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生发挥作用。松树皮木质素（如罗汉松脂素和松脂醇）以及饮食摄入的罗汉松脂素已被证明具有抗炎效果并能降低心血管疾病概率。细胞毒性研究表明，松脂醇对癌细胞具有比健康细胞更强的细胞毒性，且与植物雌激素能力无关。Secoisolariciresinol diglucoside（SDG）及其代谢产物（特别是肠内酯）在乳腺癌细胞研究中也显示出显著的细胞毒性。在抗菌方面，木质素富集的亚麻籽提取物对多种微生物表现出显著效果，稀有丁烷型木质素对某些细菌和真菌有效，而五味子提取物中的五味子素B（schisandrin B）则被鉴定为衣原体诱导微生物的生长抑制剂。

3 样品制备

样品制备是复杂基质中分子定量分析的关键步骤，旨在提高色谱分辨率和选择性，减少基质效应，防止色谱柱堵塞。

3.1 固体样品提取

固体样品在分析前需经过干燥、储存和均质化处理。常用的提取方法包括浸渍法（maceration）、回流法（如索氏提取）、超声辅助提取（UAE）和加速溶剂萃取（ASE）。溶剂的选择至关重要，通常使用甲醇（MeOH）或乙醇（EtOH）的水溶液，且常在提取前进行己烷脱脂处理以去除非极性干扰物。

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  浸渍法：操作简便，通常在室温或加热条件下将粉末样品浸入有机溶剂中搅拌。适用于树木和食品样品，但耗时较长且选择性较差。
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  渗滤法（Percolation）：适用于大规模工业提取，溶剂流经样品床层，但耗时数天且无法加热加速。
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  回流提取：如索氏提取，利用沸腾溶剂冷凝回流，节省溶剂且效率高，常用于先用己烷脱脂后再用极性溶剂提取目标物。
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  超声辅助提取（UAE）：利用超声波空化作用破坏基质，加速提取。与深共熔溶剂（DES）结合使用时，可通过大孔树脂进一步分离木质素。
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  先进提取技术：包括加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助提取（MAE）和超临界流体萃取（SFE）。ASE在高压高温下进行，可减少时间和溶剂用量；MAE利用微波均匀加热，效率高于传统方法；SFE使用超临界CO₂作为绿色溶剂；水热提取（HTE）则利用加压热水作为环境友好型溶剂。

3.2 提取样品的纯化

提取后的样品含有大量基质成分，需通过水解和液液萃取（LLE）或固相萃取（SPE）进行纯化。

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  水解：常用蜗牛消化液（Helix pomatia）中的β-葡糖苷酶和硫酸酯酶进行酶解，或在酸性/碱性条件下水解以释放结合态木质素。需注意酸水解可能产生人工产物（如anhydrosecoisolariciresinol）。
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  液液萃取（LLE）：水解后，蒸发有机溶剂，剩余水相用乙酸乙酯（EA）或己烷等非极性溶剂萃取，使中等极性的木质素转移至有机相。
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  色谱纯化：包括硅胶柱色谱（silica CC）和固相萃取（SPE）。硅胶柱利用正相梯度洗脱分离极性差异；反相C18-SPE则用于捕获非极性化合物。对于复杂样品，常需结合尺寸排阻色谱（如Sephadex LH-20）和制备型液相色谱（prep-LC）以获得高纯度单体。某些情况下，如用于谱图分析的样品，可仅过滤后直接进样，但不适用于定量分析。

3.3 液体样品的提取

液体样品通常无需传统有机萃取，但常需LLE或SPE净化。

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  油脂与饮料：橄榄油分析通常将油溶于己烷后用甲醇/水溶液进行LLE，或使用二醇键合SPE（diol-bonded SPE）保留极性成分。葡萄酒样品若采用质谱检测可稀释过滤后进样，若采用库仑阵列检测则需经C18-SPE、酶解和离子交换色谱处理。
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  生物流体样品：主要关注哺乳动物木质素（肠内酯和肠二醇）。血浆和尿液样品通常采用β-葡糖苷酶水解，随后进行C18-SPE或LLE结合离子交换色谱（如QAE-Sephadex）以去除干扰物，最后通过LC-MS或LC-CEAD进行分析。研究发现，人体血浆和尿液中肠木脂素的浓度通常高于未转化的植物木质素。

4 基于HPLC的木质素分析

4.1 固定相与洗脱剂

HPLC是分析生物基质中木质素的首选方法，因其样品前处理相对简单且系统耐用性强。由于样品复杂性，通常采用梯度洗脱，流动相由水和有机溶剂（如乙腈ACN或甲醇MeOH）组成，并添加甲酸或乙酸调节pH。

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  固定相：最常用的是反相硅胶柱（C8或C18），依据疏水性保留化合物。对于手性分析（如对映体过量研究），则使用基于蛋白质、糖或环糊精的手性柱。二维液相色谱（LC × LC）被用于分离共洗脱的复杂木质素组分，显著提高峰容量。
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  洗脱模式：制备型LC多采用等度洗脱以保持收集时间稳定；分析型LC则普遍采用梯度洗脱以适应不同极性化合物的分离。

4.2 检测器

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  紫外可见光谱（UV/Vis）：最常用波长为280 nm，配合二极管阵列检测器（DAD）可同时监测多个波长。主要用于定性鉴别和辅助MS表征，灵敏度相对较低。
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  荧光检测（FLD）：基于木质素的芳香环结构，具有高选择性和灵敏度，尤其适用于橄榄油和亚麻籽中木质素的定量，检出限低于UV/Vis。
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  质谱（MS）：是木质素定量的主流检测器，通过总离子流色谱图（TIC）和提取离子流色谱图（EIC）实现复杂基质中化合物的准确识别与定量。串联质谱（MS/MS）可提供碎片信息用于未知物鉴定。
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  库仑电极阵列检测（CEAD）：一种高灵敏度检测方法，检出限可达pg级。通过在特定电压（如松脂醇为420 mV）下检测电活性物质，已成功应用于葡萄酒、尿液和血浆中木质素的痕量分析。

5 结论

本综述概述了木质素的分离与分析方法。木质素的提取主要依赖传统的含水醇溶液浸渍法，而微波、超声或加压等先进技术虽能缩短提取时间，但后续纯化步骤依然繁琐。纯化通常始于水解步骤，随后通过LLE、反相SPE和硅胶闪蒸色谱实现目标分子的分离。LC是木质素分析的核心技术，相较于需要衍生化的气相色谱（GC），LC在处理复杂样品时更具优势。未来的研究应致力于开发更多氘代木质素内标材料以提高定量准确性，并随着对天然产物健康益处的关注增加，推动该领域的持续发展。