《Neuroscience》：The role of DTL in maintaining survival of cochlear hair cell and hearing function
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杨敏浩|艾静如|高等|刘浩波|周宏宇|魏浩|薛家哲|朱兴琦|毕正红|卢军泽|钟子航|胡扬楠|廖梦辉|程成南京医科大学公共卫生学院，南京 211166，中国摘要进行性感觉神经性听力损失主要是由耳蜗毛细胞（HCs）的逐渐退化引起的；然而，其详细的分子机制尚未完全明了。本研究聚焦于无齿
杨敏浩|艾静如|高等|刘浩波|周宏宇|魏浩|薛家哲|朱兴琦|毕正红|卢军泽|钟子航|胡扬楠|廖梦辉|程成
南京医科大学公共卫生学院，南京 211166，中国
摘要
进行性感觉神经性听力损失主要是由耳蜗毛细胞（HCs）的逐渐退化引起的；然而，其详细的分子机制尚未完全明了。本研究聚焦于无齿状突的E3泛素蛋白连接酶同源物（DTL）。尽管DTL始终存在于耳蜗毛细胞中，但其在听觉中的具体作用尚不清楚。DTL是CRL4复合体的核心底物识别亚基，该复合体对于维持基因组稳定性至关重要。为了探讨DTL如何影响听觉，我们构建了一种敲除Dtl基因的小鼠模型。听觉脑干反应测试表明，DTL的缺失会导致进行性听力损失。具体来说，出生后第30天（P30），高频听阈开始出现变化，并在P60时发展到所有测试频率的严重听阈升高，同时波I的振幅显著下降。DTL的缺乏主要导致外毛细胞的进行性丢失，而内毛细胞保持完整。总体而言，我们的发现表明DTL通过维持细胞核稳态对毛细胞的存活至关重要，为治疗进行性听力损失提供了一个有前景的目标。
引言
听觉系统依赖于耳蜗毛细胞（HCs）将声音的机械振动转换为神经信号（Jia等，2020；Liu等，2019；Wiwatpanit等，2018）。外毛细胞（OHCs）充当耳蜗的放大器（Shera和Altoe，2023；Song和Santos-Sacchi，2013）；它们侧膜中的动力蛋白prestin的电压依赖性电活动可以增强基底膜的振动，从而赋予听觉高敏感性和频率选择性（Ashmore，2019；Bavi等，2021）。内毛细胞（IHCs）作为主要的信号转导单元（Sendin等，2014）。它们通过带状突触将信号传递给螺旋神经节神经元（Meyer等，2009；Pangrsic等，2010；Petitpre等，2022）。值得注意的是，哺乳动物的耳蜗毛细胞在出生后不久就完成分化（Elkon等，2015；You等，2022），并终生保持其功能。毛细胞面临着持续的挑战，如高代谢需求、反复的机械应力以及耳蜗内的特殊离子环境，这些都使其DNA和蛋白质容易受到损伤（Moore等，2023）。因此，它们需要利用复杂的细胞机制来抵抗代谢负担、氧化应激和声音过度暴露（Milewski等，2017）。
泛素-蛋白酶体系统（UPS）是质量控制和信号转导的核心网络（Christianson等，2023；Hu等，2023；Segref等，2011）。在该系统中，E3泛素连接酶决定了哪些特定蛋白质会被标记为降解对象（Matyskiela等，2016）。作为Cullin-RING E3连接酶的一个关键亚类（Yang等，2020），CUL4-DDB1复合体利用多种底物识别适配器来靶向广泛的蛋白质（Raisch等，2023）。通过这一机制，它控制着多种必要的细胞途径，例如DNA修复、细胞周期进展、染色质重塑和基因转录（Lee和Zhou，2007；White等，2021）。该复合体的一个关键组成部分是无齿状突的E3泛素蛋白连接酶同源物（DTL，也称为Cdt2），它作为核心底物识别亚基（Cui等，2019）。如果DTL缺失，其主要底物将以异常方式积累，包括CDT1（其降解会阻止DNA复制）、p21（一种周期依赖性激酶CDK的抑制剂）以及SET8（一种修饰组蛋白以影响基因活性的酶）（Benamar等，2016；Havens和Walter，2009；Ratnayeke等，2023；Sansam等，2006；Wang等，2015；Zhang等，2016）。因此，DTL的失调与基因组不稳定、肿瘤发生和癌症进展等问题密切相关。
尽管人们对DTL在增殖细胞中的功能进行了大量研究，但其 在非分裂细胞中的作用仍不清楚，尤其是在像耳蜗毛细胞这样需要大量能量的感觉细胞中。我们的研究发现，DTL在毛细胞中持续表达。这种表达模式表明，DTL可能对维持毛细胞在最终分化后的完整性至关重要。因此，我们提出假设：DTL介导的依赖泛素的蛋白降解对于维持毛细胞稳态、抵御应激引起的损伤以及确保正常的听觉功能至关重要。为了验证这一假设，我们专门在小鼠毛细胞中进行了Dtl基因的条件性敲除；这一操作为我们提供了一种在活体动物中研究其功能的方法。随后，我们系统地评估了DTL缺失带来的生理、细胞和分子层面的影响。因此，本研究探讨了Dtl基因在听觉中的作用，从而加深了我们对蛋白质稳态调节如何影响感觉细胞神经退行的理解。
章节片段
动物
在本研究中，我们使用了携带Dtl基因条件性敲除的小鼠及其对照组小鼠。雄性和雌性小鼠的使用数量大致相等，以避免性别相关偏差，在分析的参数中未观察到性别依赖性差异。我们的整个实验过程事先经过了南京医科大学附属鼓楼医院动物伦理委员会的审查和批准（批准号2025AE01152）。
从发育到成年期间耳蜗中DTL的表达
为了确定DTL蛋白在听觉系统中的定位和时间表达情况，我们通过免疫组化技术检测了不同年龄的野生型C57BL/6J小鼠的耳蜗组织。
在出生后第0天（P0）的完整mount样本中，DTL信号定位于机械感受性毛细胞（Fig. 1a）。与毛细胞标记物Myosin 7a共染显示DTL位于细胞核内（Fig. 1a）。这表明即使在早期发育阶段，DTL在OHCs和IHCs中也有丰富的表达。
讨论
本研究采用了一种特定的毛细胞条件性敲除模型，结合了系统的听觉测试和形态学分析。我们的工作首次提供了体内证据，证明DTL对维持哺乳动物毛细胞和听觉功能至关重要。我们的数据显示，DTL的缺失会破坏细胞核的稳定环境，从而选择性地触发OHCs的逐渐死亡和丢失。最终，这会导致严重的
CRediT作者贡献声明
杨敏浩：撰写 – 原始草稿，可视化，软件操作，实验研究，数据分析，概念构思。艾静如：撰写 – 原始草稿，可视化，软件操作，实验研究，数据分析，概念构思。高等：撰写 – 原始草稿，可视化，软件操作，实验研究，数据分析，概念构思。刘浩波：撰写 – 原始草稿，可视化，软件操作，实验研究，数据分析，
致谢
本研究得到了以下机构的资助：国家自然科学基金（编号82401375、82401376、82371157、82571324、82201303）、国家重点研发计划（编号2024YFC2511100/2024YFC2511103、2025YFC3408803）、江苏省科学技术青年科技人才扶持项目（编号JSTJ-2025-295）、江苏省自然科学基金（编号BK20230052）、四川省科技计划（编号2026NSFSC1526）以及青年科技创新计划。
