利拉鲁肽通过NRF2/NLRP3信号通路缓解老年小鼠术后认知功能障碍

《Neuroscience Letters》：Liraglutide alleviates postoperative cognitive impairment via NRF2/NLRP3 signal pathway in aged mice

　　洪孙|谢成|雷道云|刘金明|金彦恒|王春辉|费圆辉|韩超
江苏省宜兴市江苏大学附属医院麻醉科，宜兴214200，中国

**摘要**
术后认知功能障碍（POCD）在老年手术患者中常见，但有效的预防策略尚缺乏。本研究探讨了GLP-1R激动剂利拉鲁肽（LIR）是否能够缓解老年小鼠的POCD，并分析了其潜在机制。老年小鼠在七氟醚麻醉下接受了腹部手术并合并短暂的上肠系膜动脉阻断（一种临床相关的肠缺血-再灌注模型），随后接受了14天的LIR治疗（300 μg/kg/天）。LIR治疗改善了Y迷宫测试和恐惧条件反射测试中的行为表现，降低了小胶质细胞的活化程度，促进了M2型小胶质细胞表型，并保护了突触结构和蛋白质水平。分子分析显示，LIR激活了GLP-1R/NRF2信号通路，减少了活性氧（ROS）的积累，并抑制了NLRP3炎性小体的表达。NRF2抑制剂ML385逆转了这些保护作用。此外，使用PLX5622耗尽小胶质细胞后，手术引起的认知缺陷得到了改善。在缺乏小胶质细胞的情况下，LIR不再提供额外的认知或分子益处，这表明LIR的保护作用高度依赖于小胶质细胞。这些发现表明，GLP-1R/NRF2/NLRP3信号通路调节POCD中的氧化应激和炎症反应，提示LIR具有潜在的治疗价值。

**1. 引言**
POCD是老年患者麻醉和手术后的常见并发症，其特征是记忆和执行功能受损[1][2]。随着人口老龄化，寻找有效的POCD干预措施显得尤为重要[3]。海马区的神经炎症（主要由小胶质细胞介导）在POCD发病机制中起着关键作用[4][5]。这种炎症反应与氧化应激密切相关，过量的ROS会触发NLRP3炎性小体释放促炎细胞因子（如IL-1β和IL-6）[6][7]。转录因子NRF2在氧化应激期间调节抗氧化基因的表达[8]，其激活已被证明可以在多种神经模型中抑制NLRP3信号通路[9][10][11]。GLP-1R信号通路促进NRF2的核转运，表明GLP-1R–NRF2–NLRP3通路参与氧化还原和炎症控制。利拉鲁肽（LIR）作为一种GLP-1R激动剂，用于治疗2型糖尿病，具有神经保护作用[12][13]，但其对急性手术引起的认知障碍的有效性尚不明确。本研究旨在确定LIR是否能够减轻老年小鼠的POCD，并阐明NRF2/NLRP3通路和小胶质细胞的参与机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物和实验设计
所有动物实验均获得东南大学中大医院实验动物伦理委员会的批准（许可证编号20220225044）。18个月大的雄性C57BL/6小鼠在标准条件下饲养，自由进食和饮水。分为三个实验组：对照组（CON）、CON + LIR组、手术组（SUR）和SUR + LIR组（每组12只）。LIR（300 μg/kg；HY-P0014，MCE，美国）或生理盐水从术前7天开始每天皮下注射一次，持续到术后7天（共14天）[14]。
2.2 NRF2抑制剂的作用
SUR组、SUR + LIR组和SUR + LIR + ML385组（每组12只）。ML385（30 mg/kg；846557–71-9，Aladdin，美国）在手术后每天腹腔注射一次，共7天[15]。
2.3 小胶质细胞耗竭
小鼠被喂食PLX5622（HY-114153C，MCE，美国）饲料14天；实验组包括SUR组、SUR + PLX5622组和SUR + PLX5622 + LIR组（每组12只）[16]。
2.4 行为测试
行为测试从术后第8天开始依次进行：开放场测试（OFT）在术后第8天进行，Y迷宫测试在术后第9天进行，恐惧条件反射测试在术后第10至12天进行。所有小鼠在行为评估完成后于术后第12天被安乐死，用于组织学和生化分析。
2.5 手术模型
小鼠接受七氟醚麻醉，并进行腹部手术并合并短暂的上肠系膜动脉阻断以诱导全身炎症。腹部消毒后，在中线处切开3厘米的切口，暴露约10厘米的小肠并轻轻操作1分钟，然后阻断上肠系膜动脉20分钟。切口用可吸收缝线分层闭合。
2.6 行为测试
使用50 × 50厘米的开放场测试（OFT）评估运动活动，持续5分钟。
使用Y迷宫测试（YMT）评估空间工作记忆，小鼠自由探索迷宫8分钟，自发交替次数计算方式为：交替次数（%）= [实际交替次数 / (总进入臂次数 - 2)] × 100%。
恐惧条件反射测试采用音调-电击配对方案，3000赫兹（3000 Hz）、70分贝的音调与2毫安（1 mA）的电击同时进行。24小时后在原始测试环境中进行情境记忆测试，持续5分钟。2小时后在新的环境中通过180秒的音调测试进行线索记忆测试。
2.7 免疫荧光染色（IF）
脑冠状切片（25 μm）用抗IBA1（1:400，Proteintech）和抗CD206（1:400，Proteintech）染色，随后使用Alexa Fluor标记的二次抗体。
2.8 高尔基染色
使用HITO Golgi–Cox OptimStain PreKit进行高尔基-Cox染色。使用ImageJ量化CA1锥体神经元二级和三级顶端树突上的树突棘密度（棘状突起/μm）。
2.9 西部印迹
海马组织用Ripa缓冲液和蛋白酶/磷酸酶抑制剂匀浆，分离核/细胞质组分。蛋白质通过SDS–PAGE分离后转移到PVDF膜上，检测GLP-1R、NLRP3、NRF2、pro-caspase-1、IL-1β、IL-6、PSD95和突触蛋白。β-actin和组蛋白H3作为加载对照。
2.10 酶联免疫吸附测定（ELISA）
根据制造商说明，使用小鼠特异性ELISA试剂盒（Wuhan SaituoSen）检测海马IL-1β和IL-6水平。
2.11 ROS水平测定
使用DCFH-DA（2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯）细胞ROS检测试剂盒检测海马ROS水平。新鲜海马组织在冰冷的PBS中匀浆后，以1000g离心10分钟获取上清液。上清液在37°C下与10 μM DCFH-DA共孵育30分钟。使用微孔板读数仪测量荧光强度（激发/发射波长=488/525 nm）。ROS水平根据BCA测定法转换为总蛋白浓度，并表示为每毫克蛋白的相对荧光单位（RFU/mg蛋白）。
2.12 统计分析
数据以平均值±标准误（SEM）表示。多组比较采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和Tukey事后检验（post hoc test）。P < 0.05被认为是统计学上显著的。

**3. 结果**
3.1 利拉鲁肽改善手术引起的认知缺陷
LIR不影响体重或血糖（补充材料1）。OFT中的运动活动在各组间无显著差异（图1A）。手术损害了空间工作记忆，Y迷宫中的自发交替次数从CON组的73.6 ± 3.5%降至SUR组的52.3 ± 4.1%。LIR预处理减轻了这种缺陷（图1D）。同样，LIR增加了线索恐惧和情境恐惧条件反射测试中的冻结时间（图1B,C），表明其与联想记忆的改善有关。

**3.2 利拉鲁肽促进小胶质细胞M2型极化和保护突触完整性**
免疫荧光显示SUR + LIR组中IBA1+小胶质细胞密度降低，CD206+/IBA1+细胞增加（图1E）。LIR降低了海马IL-6和IL-1β的水平（西部印迹和ELISA；图1F,G）。高尔基染色显示LIR限制了CA1神经元中与手术相关的树突棘丢失（图1H），并恢复了PSD95和突触蛋白的表达（图1I）。
3.3 利拉鲁肽激活GLP-1R/NRF2信号通路并抑制NLRP3炎性小体
手术降低了海马GLP-1R的表达，LIR逆转了这一变化（图1J）。LIR减少了手术引起的ROS积累（图1K）并增加了NRF2的核转运（图1M）。相应地，LIR处理的小鼠中NLRP3和pro-caspase-1水平降低（图1L）。
**图1. 利拉鲁肽改善手术引起的认知障碍，并调节老年小鼠的小胶质细胞极化、突触完整性和GLP-1R/NRF2/NLRP3信号通路**
3.4 NRF2抑制剂逆转LIR的保护作用
ML385消除了LIR在Y迷宫和恐惧条件反射测试中的改善作用（图2A–D）。ML385还阻止了CD206+/IBA1+细胞的增加（图2E），逆转了树突棘和突触蛋白的保护作用（图2F,G），并恢复了促炎细胞因子的水平（图2H）。在分子水平上，ML385减少了NRF2的核转运（图2I），维持了ROS的积累（图2J），并逆转了NLRP3/pro-caspase-1信号的抑制（图2K）。

**3.5 小胶质细胞耗竭消除了LIR的额外益处**
PLX5622实现了超过95%的小胶质细胞耗竭（图3E）。值得注意的是，仅耗竭小胶质细胞（SUR + PLX5622）显著改善了空间工作记忆（图3D）和线索恐惧记忆（图3C），尽管情境恐惧记忆的改善未达到统计学显著性（图3B，ns）。此外，耗竭小胶质细胞还显著降低了炎症介质（图3F）。在小胶质细胞耗竭的小鼠中，LIR不再提供额外的认知或分子益处（图3A–G），这表明小胶质细胞是LIR保护作用所必需的细胞成分。

**3.6 讨论**
本研究表明，激活GLP-1R可以保护老年小鼠免受类似POCD的认知障碍。围手术期给予LIR可成功减轻手术引起的行为缺陷。组织和生化分析显示，LIR减少了海马炎症，促进了M2型小胶质细胞状态，并保护了突触结构。氧化应激和NLRP3炎性小体的激活被认为是POCD发病机制的贡献因素[17][18]。具体来说，LIR促进了NRF2的核转运，降低了ROS水平，并下调了NLRP3和pro-caspase-1。NRF2抑制剂ML385逆转了这些分子、突触和行为上的改善，证实了NRF2信号通路在LIR介导的神经保护中的必要性。
进一步的研究使用PLX5622确定了具体的细胞靶标。耗竭小胶质细胞可改善术后结果并单独降低炎症；然而，LIR在这些小鼠中未提供额外益处，表明小胶质细胞是LIR诱导的保护作用的主要介导者。
鉴于老年患者中POCD的高发率以及缺乏预防药物，LIR由于其已建立的安全性档案，成为临床再利用的可行候选药物[18][19]。为了增强实验模型的临床相关性，我们采用了结合20分钟肠系膜动脉阻断的探索性腹部手术。这种轻度的肠缺血-再灌注损伤更好模拟了老年患者严重腹部手术伴随组织低灌注和全身炎症反应的临床情况。
本研究存在一些局限性：首先，未包括单独使用ML385处理的手术组。尽管ML385消除了LIR的保护作用，但验证其独立效果将增强我们的证据。其次，PLX5622单独使用即可将认知功能恢复到接近基线水平，导致行为表现达到上限。虽然这支持小胶质细胞是LIR的主要介导者，但我们不能完全排除其他细胞类型的次要贡献。未来需要使用细胞类型特异的敲除模型进行研究。第三，我们对caspase-1的评估基于其48 kDa的前体（pro-caspase-1）；虽然这证明了炎性小体的抑制和表达，但评估其切割后的活性形式（p20）将提供更深入的机制见解。最终，仅使用了雄性小鼠，并且观察期被限制在手术后的12天内；长期结果和性别差异尚未得到研究。总之，LIR通过NRF2通路抑制ROS诱导的NLRP3炎症小体激活，主要发生在小胶质细胞中，从而减轻了老年小鼠术后的认知衰退。这些结果突显了GLP-1R激动剂在管理手术引起的神经炎症方面的潜力。

声明
作者贡献声明
Hong Sun：数据分析、概念化。
Xue Cheng：数据分析、概念化。
Daoyun Lei：资金获取、概念化。
Jinming Liu：实验研究、数据分析。
Yanheng Jin：监督、软件支持。
Chunhui Wang：软件支持。
Yuanhui Fei：验证、监督。
Chao Han：资源提供、项目管理、方法论制定。

伦理审批
所有动物实验均获得了东南大学附属钟大医院实验动物伦理委员会的批准（许可证编号20220225044），并且严格遵循《实验动物护理和使用指南》进行。

资助
本研究得到了江苏省卫生健康委员会（项目编号M2021069）、无锡市科学技术协会软科学研究项目（项目编号KX–23–C056）以及无锡市卫生健康委员会青年科研项目（项目编号Q202471、Q202372）的支持。