福尔马林引起的疼痛优先激活雄性小鼠中的食欲素神经元

《Neuroscience Letters》：Formalin-induced pain preferentially activates orexin neurons in male mice

　　福泽宗辅 | 武追究刑事责任 | 松井有沙 | 金谷萌子
日本埼玉县埼玉大学科学与工程学院生命科学系

摘要：
在许多功能中，性别差异在食欲素系统中已有充分记录；然而，这些差异是否也延伸到疼痛处理方面，至今研究得还不够充分。因此，我们研究了雄性和雌性在疼痛感知过程中食欲素系统的参与程度是否存在差异，以及这些差异是否反映了结构组织或功能招募的差异。实验使用了雌雄各半的成年C57BL/6N小鼠，雌性小鼠分别在发情前期和发情后期进行测试。将福尔马林注射到后爪中，量化了侧下丘脑食欲素神经元中的c-Fos表达，并测量了腰髓中食欲素A/B纤维的密度以及食欲素受体OX1R/OX2R的mRNA表达。由于食欲素A和B完全共定位，因此可以用食欲素B作为可靠的标志物。不同性别或不同发情阶段之间的食欲素免疫反应阳性神经元总数没有差异，脊髓中的食欲素能神经支配和OX1R/OX2R mRNA水平也相当。相比之下，福尔马林在雄性小鼠中诱导了显著更高比例的c-Fos阳性食欲素神经元，表明在疼痛感知过程中食欲素神经元的招募存在性别偏向，尽管解剖结构相同。这些发现表明，食欲素在疼痛感知中的性别差异不能归因于食欲素神经元数量、脊髓投射或受体表达的结构差异，而源于性别和情境对食欲素神经元功能激活的不同影响。

1. 引言
食欲素（下丘脑分泌素）系统被广泛认为是一个下丘脑网络，能够相互作用调节多种生理功能，包括维持清醒状态、稳定睡眠-觉醒节律、进食行为、能量代谢、情绪和奖励反应以及应激反应[1]。位于侧下丘脑和周围下丘脑的食欲素神经元同时表达食欲素A和B，并向单胺核、边缘结构、丘脑和脊髓背角进行广泛投射，从而影响疼痛感知、觉醒行为和动机行为[1]。近年来，食欲素系统被认为是下行疼痛调节网络的关键枢纽，因为它通过两种亚型的食欲素受体OX1R和OX2R在导水管周围灰质（PAG）、延髓前腹侧部和脊髓背角调节神经活动，在各种急性和慢性疼痛模型中表现出显著的镇痛效果[2]。
相比之下，许多由食欲素调节的生理功能表现出明显的性别差异。例如，雌性小鼠的基础食欲素神经元活性和应激诱导的食欲素神经元活性以及食欲素mRNA水平高于雄性小鼠，同时在多个应激相关区域的OX1R/OX2R表达也更高；这些与性别相关的差异与睡眠-觉醒和昼夜节律调节、进食和能量代谢的变化以及更强的应激和情绪反应有关[3][4][5]。关于食欲素相关睡眠障碍的临床研究表明，由食欲素缺乏引起的嗜睡症在男性中更为普遍，而慢性失眠（与食欲素过度活跃有关）则在女性中更为常见[6]。此外，食欲素信号传导还会随着发情周期的变化而变化。据报道，卵巢激素（特别是雌二醇）的波动会影响几个功能领域中的食欲素神经元活性和食欲素mRNA表达[7][8]。然而，食欲素的镇痛作用的性别差异仍 largely 未知。大多数研究食欲素介导的镇痛作用的研究集中在雄性啮齿动物上，这些研究中在PAG或脊髓中给予食欲素A或食欲素B后始终观察到显著的镇痛效果[2]。相比之下，关于雌性的类似数据很少，目前尚不清楚与疼痛调节相关的食欲素系统性别差异是发生在食欲素神经元的招募水平，还是发生在脊髓中的食欲素神经支配和受体表达水平。
在这项研究中，我们旨在阐明食欲素A和B的作用在性别上的差异。由于卵巢激素可能影响雌性的食欲素信号传导，因此我们在发情前期（雌激素水平高）和发情后期（雌激素水平低）收集组织样本，以评估雌激素水平对食欲素系统激活的影响。具体来说，我们比较了（1）福尔马林注射后雄性和雌性食欲素A/B神经元中的c-Fos表达，（2）食欲素能纤维向脊髓背角的投射密度，以及（3）腰髓中的OX1R和OX2R mRNA表达。这些分析旨在确定性别差异是由于解剖资源的不同，还是由于食欲素系统对福尔马林诱导的疼痛的反应在功能上的差异。

2. 材料与方法
2.1. 动物
雌雄C57BL/6N小鼠（12–20岁；Sankyo Labo Service Corporation Inc.，东京，日本）在受控条件下饲养（25°C，12小时光照/12小时黑暗周期，光照时间从早上8:00到晚上8:00），可自由摄取CE-2饲料（CLEA Japan Inc.，东京，日本）和饮用水。使用发情前期和发情后期的雌性小鼠，并通过阴道涂片监测其发情周期。所有实验动物程序均遵循埼玉大学关于实验动物护理和使用的指南。
2.2. 实验设计
对雄性和雌性小鼠分别在发情前期和发情后期进行了四组实验，以研究性别差异和发情周期对基础状态和福尔马林诱导疼痛条件下食欲素能信号传导的影响。选择发情前期和发情后期是因为它们分别代表相对较高的和较低的循环雌二醇水平，从而可以在发情周期内比较极端情况。首先，为了评估疼痛相关行为，对雄性和雌性小鼠进行了福尔马林测试，并量化舔舐反应，以评估性别差异和发情周期对疼痛感知行为的影响。其次，为了研究侧下丘脑区域（LHA）中食欲素神经元的福尔马林诱导激活，比较了发情前期和发情后期雄性和雌性小鼠的c-Fos表达，福尔马林注射后90分钟。第三，为了评估福尔马林给药后脊髓中的食欲素能神经支配，比较了发情前期和发情后期雄性和雌性小鼠的食欲素能纤维密度。第四，为了评估基础状态下的食欲素受体表达，使用未接受福尔马林治疗的发情前期和发情后期雄性和雌性小鼠，量化了腰髓中的OX1R和OX2R mRNA水平。所有组织取样，包括福尔马林给药后的大脑和脊髓取样以及基础条件下的脊髓mRNA分析，均在下午3:00至6:00之间进行。这些实验组使我们能够评估性别差异以及发情周期对食欲素神经元激活、脊髓神经支配和受体表达的影响。
2.3. 福尔马林测试
在测试前，小鼠被适应一个透明的亚克力腔室（直径9厘米，高度10.5厘米）20分钟。为了能够从多个角度观察行为，使用两个网络摄像头记录腔室的前视图和底视图。使用27号针头将福尔马林溶液（1.8%盐水，20 μL）注射到左或右后爪的足底表面。注射后，连续监测并记录60分钟内的舔舐行为。在注射后的60分钟内，以5分钟的间隔量化舔舐行为的累积时间。为了分析，将反应最初分为第一阶段（0–10分钟）和第二阶段（10–60分钟）[9]，分别对应于福尔马林反应的急性期和炎症期。我们进一步根据先前报告的协议[10]将第二阶段细分为早期（10–30分钟）、中期（30–45分钟）和晚期（45–60分钟）。本实验共使用了6只雄性小鼠、5只发情前期小鼠和4只发情后期小鼠。
2.4. 福尔马林注射用于组织学分析
福尔马林注射的方法如福尔马林测试部分所述，除非另有说明。使用异氟烷（2%）麻醉雄性小鼠（n=6）、发情前期小鼠（n=6）和发情后期小鼠（n=6），并在左后爪进行皮下注射福尔马林（20 μL，1.8%）。为了减少处理相关的压力，实验前每天对小鼠进行约2分钟的温和处理，每只小鼠至少处理五次。由于根据取样当天的发情周期对雌性小鼠进行处理，因此每次处理的次数略有不同。福尔马林注射在同一饲养室内进行，以避免小鼠暴露于新环境中。福尔马林注射后，小鼠立即放回其原笼子，笼子一直放在饲养室内直至灌注固定。
2.5. 免疫荧光
福尔马林注射后90分钟，所有小鼠通过腹腔注射咪达唑仑（4 mg/kg；Sandoz K.K.）、美托咪定（0.3 mg/kg；Domitor，Nippon Zenyaku Kogyo）和丁丙诺啡（5 mg/kg；Vetorphale，Meiji Seika Pharma）混合物深度麻醉。这个时间点通常用于c-Fos免疫组化，主要反映与福尔马林反应的第二阶段（炎症期）相关的神经元激活。随后，通过心脏灌注4%福尔马林固定小鼠的大脑和腰髓扩张组织。组织在4°C的新鲜4%福尔马林中过夜固定，然后在20%和30%蔗糖溶液中冷冻保护两天。
使用冰冻切片机（Leica CM1860，Leica Biosystems，Nussloch，德国）将大脑和腰髓扩张组织的冠状切片切成40 μm厚。大脑切片分四组处理，脊髓切片分六组处理。一组大脑切片和一组脊髓切片分别用于三重免疫荧光染色，以检测食欲素A、食欲素B和c-Fos的神经元激活情况。切片用0.05 M磷酸盐缓冲液（PBST）中的0.1% Tween-20洗涤三次，并在室温下用含有1%牛血清白蛋白和0.4% Triton X-100的封闭缓冲液中孵育1小时。随后在4°C下用以下一级抗体孵育切片：对于大脑切片，使用小鼠抗食欲素A单克隆抗体（1:1,000；SC-80263，Santa Cruz Biotech，德克萨斯州达拉斯）、兔抗食欲素B单克隆抗体（1:1,000；ab255293，Abcam，英国剑桥）和豚鼠抗c-Fos单克隆抗体（1:20,000；226 308，Synaptic Systems，德国哥廷根）。对于脊髓切片，使用小鼠抗食欲素A单克隆抗体、兔抗食欲素B单克隆抗体和豚鼠抗Calbindin D-28 K多克隆抗体（1:500；MSFR100430；Frontier Institute，日本北海道）。洗涤后，在室温下用以下二级抗体孵育切片：Alexa Fluor 555驴抗小鼠（1:500，A32773；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、Alexa Fluor 647驴抗兔（1:500，711–605-152；Jackson ImmunoResearch，美国宾夕法尼亚州西格罗夫）和Alexa Fluor 488驴抗豚鼠（1:500，706–545-148；Jackson ImmunoResearch）。
2.6. 定量RT-PCR
雄性小鼠（n=6）、发情前期小鼠（n=6）和发情后期小鼠（n=6）通过腹腔注射咪达唑仑、美托咪定和丁丙诺啡混合物深度麻醉。解剖腰髓扩张组织，并立即置于1 mL RNAiso Plus（Takara Bio Inc.，日本滋贺）中，储存在-20°C。样品均质化、涡旋后在室温下孵育5分钟。加入氯仿（200 μL），随后涡旋并在室温下孵育5分钟。样品在4°C下以13,500 × g离心15分钟，然后转移400 μL水相到新管中。加入异丙醇（400 μL），涡旋并在室温下孵育5分钟。次日，样品在4°C下以13,500 × g离心15分钟。弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀物，然后空气干燥至透明，再悬浮在20 μL蒸馏水中。总RNA（0.5 μg）用于cDNA合成。RNA溶液在65°C下孵育5分钟，然后立即置于冰上。通过加入2 μL 4 × DN Master Mix with gDNA Remover（FSQ-301，TOYOBO，日本大阪）进行DNase处理，并在37°C下孵育5分钟。反转录是通过加入2 μL的5 × RT Master Mix II（FSQ-301，TOYOBO）进行的，混合后分别在37°C下孵育15分钟、50°C下孵育5分钟、98°C下孵育5分钟，最后保持在4°C。合成的cDNA储存在4°C。实时PCR使用Thermal Cycler Dice Real Time System III（TP-800，Takara Bio Inc.）和THUNDERBIRD Next SYBR qPCR Mix（TOYOBO）进行，引物如下：小鼠GAPDH：正向引物5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，反向引物5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′；小鼠OX1R：正向引物5′-ACGGCTAAGATGCTGATGGT-3′，反向引物5′-AGAAGGTGAAGCAGGCGTAG-3′；小鼠OX2R：正向引物5′-ACGGACTATGACGACGAGGA-3′，反向引物5′-GATGAGAGCCACAACGAACA-3′。为了确定合适的管家基因，使用RefFinder（https://www.ciidirsinaloa.com.mx/RefFinder-master/）评估了三个管家基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶[Gapdh]、β-actin[Actb]和环磷酰胺A[Ppia]）。以Gapdh进行 normalization。初始模板变性在95°C下进行30秒，PCR循环包括40次95°C下的5秒和60°C下的30秒。每个mRNA的相对丰度通过ΔΔCt方法计算，并以管家基因进行归一化，然后校准到雄性组的平均归一化表达水平。

2.7. 图像分析
荧光图像使用荧光显微镜（BZ-9000；Keyence，大阪，日本）捕获。LHA的冠状切片范围从Bregma -0.94到-2.06 mm，每只小鼠分析大约六个切片。脊髓切片每只小鼠分析四个切片。在显微镜下从右侧脑切片的荧光图像中手动计数每个蛋白质免疫反应的神经元数量。计算了食欲素阳性神经元的总数以及共表达c-Fos的食欲素阳性神经元的比例。使用ImageJ软件（NIH，贝塞斯达，MD，美国）量化了腰髓左浅层背角的食欲素A和食欲素B的荧光强度。根据calbindin免疫反应性定义了浅层背角。为了最小化背景噪声，应用了适当的阈值进行图像二值化，并测量了每个定义区域内的总荧光强度。所有切片在相同的染色条件下同时处理，并且所有实验组的共聚焦成像参数（激光功率、探测器增益、偏移量和针孔大小）保持不变。

2.8. 统计分析
数据以平均值和标准误差（SEM）表示。使用GraphPad Prism 10软件（GraphPad Software Inc.，波士顿，MA，美国）进行统计分析。进行了单因素方差分析和Tukey的多重比较检验。p < 0.05时认为差异具有统计学意义。

3. 结果
3.1. 正式醇诱导的疼痛行为中的性别差异
我们首先在雄性小鼠和发情前期及发情后期的雌性小鼠中使用了正式醇测试来评估疼痛反应。舔舐行为的时间过程分析在任何时间点都没有发现组间显著差异（每个时间点的单因素ANOVA，所有p > 0.05；图1A）。一致地，当量化第一阶段（0-10分钟）和第二阶段（10-60分钟）的舔舐持续时间时，没有观察到显著的性别差异或发情周期依赖性效应（第一阶段：F(2, 12) = 1.065，p = 0.375，η2 = 0.151；第二阶段：F(2, 12) = 0.582，p = 0.574，η2 = 0.088；图1B，C）。然而，将第二阶段进一步细分为早期（10-30分钟）、中期（30-45分钟）和晚期（45-60分钟）后，仅在第二阶段的早期发现了显著的组间效应（F(2, 12) = 6.390，p = 0.013，η2 = 0.516；图1D）。事后分析显示，发情前期和发情后期的雌性小鼠的舔舐持续时间显著长于雄性小鼠（雄性与发情前期雌性：p = 0.042，Cohen’s d = 1.68；雄性与发情后期雌性：p = 0.019，Cohen’s d = 2.08），而两组雌性之间没有显著差异（p = 0.823，Cohen’s d = 0.40）。相比之下，在第二阶段的中期或晚期没有检测到显著的组间差异（中期：F(2, 12) = 0.561，p = 0.585，η2 = 0.085；晚期：F(2, 12) = 0.747，p = 0.494，η2 = 0.111；图1E，F）。这些结果表明，在第二阶段反应的早期，正式醇诱导的疼痛行为中的性别差异是短暂的，雌性显示出比雄性更强的疼痛相关行为，无论处于哪个发情周期阶段。

3.2. LHA神经元中食欲素A和食欲素B的共定位
我们对食欲素A、食欲素B和c-Fos进行了三重免疫染色。在LHA中，食欲素A和B完全共定位在同一神经元群体内。由于这两种肽标记了一组相同的神经元，因此在后续的c-Fos共定位分析中使用了食欲素B作为食欲素标记物（图2）。

3.3. 食欲素神经元中c-Fos激活的性别差异
我们量化了雄性、发情前期雌性和发情后期雌性中的食欲素神经元数量，并确定了共表达c-Fos的神经元比例。单因素ANOVA显示，食欲素免疫反应神经元总数没有显著的组间差异（F(2, 15) = 0.567，p = 0.579，η2 = 0.070；图3A，B）。相反，单因素ANOVA显示，表达c-Fos的食欲素神经元比例有显著的组间差异（F(2, 15) = 9.293，p = 0.0024，η2 = 0.553；图3A，C）。事后分析显示，雄性小鼠中表达c-Fos的食欲素神经元比例显著高于发情前期雌性（p = 0.0085，Cohen’s d = 2.02）和发情后期雌性（p = 0.0036，Cohen’s d = 2.27）。相比之下，两组雌性之间没有差异（p = 0.9064，Cohen’s d = 0.24）。

3.4. 腰髓中食欲素A和食欲素B免疫反应纤维的强度没有性别差异
在分析腰髓I/II层中食欲素A免疫反应纤维时，单因素ANOVA显示了显著的组间效应（F(2, 15) = 3.876，p = 0.044，η2 = 0.341；图4A，B）。然而，事后比较没有检测到任何组间显著差异（雄性与发情前期雌性：p = 0.083，Cohen’s d = 1.34；雄性与发情后期雌性：p = 0.986，Cohen’s d = 0.09；发情前期雌性与发情后期雌性：p = 0.0613，d = 1.44）。对于食欲素B免疫反应纤维，单因素ANOVA没有显示显著的组间效应（F(2, 15) = 1.951，p = 0.177，η2 = 0.207；图4A，C）。

3.5. 腰髓中OX1R和OX2R mRNA水平没有性别差异
我们量化了雄性、发情前期雌性和发情后期雌性腰骶脊髓中的OX1R和OX2R mRNA表达。单因素ANOVA显示OX1R mRNA水平没有显著的组间差异（F(2, 15) = 0.322，p = 0.730，η2 = 0.041；图5A）。同样，OX2R mRNA表达在组间也没有显著差异（F(2, 15) = 0.112，p = 0.895，η2 = 0.015；图5B）。

4. 讨论
4.1. 正式醇诱导的疼痛行为中的性别差异
在本研究中，使用传统的第一阶段和第二阶段分类分析疼痛行为时，没有检测到显著的性别差异。然而，更详细的时间分析显示，在第二阶段的早期（10-30分钟）确实存在显著的性别差异，在该阶段无论发情周期如何，雌性的疼痛行为都比雄性更强。这一结果与之前的研究结果不完全一致，之前的研究一致认为正式醇测试中的性别差异主要在第二阶段被报道[11]，[12]，[13]，[14]；然而，重要的是，更细致的时间分析显示，在第二阶段的早期确实存在显著的性别差异，这被认为是观察到的c-Fos表达性别差异的时间窗口。性别差异最一致地出现在第二阶段，这反映了炎症过程和中枢敏化，不仅涉及脊髓回路，还涉及更广泛的脊髓上区域。将食欲素A注射到脊髓上区域（如海马CA1）可以抑制第二阶段的反应[15]，这表明在炎症阶段，当招募更复杂的神经网络时，性别依赖的疼痛处理调节可能变得更加明显。相比之下，第一阶段主要由外周疼痛输入驱动，涉及脊髓背角和PAG的相对简单的下行通路。然而，鞘内给药食欲素A已被证明可以抑制第一阶段和第二阶段的反应[16]。综合这些发现表明，食欲素系统可以在多个水平上调节疼痛处理，包括脊髓和脊髓上回路。因此，本研究中观察到的食欲素神经元激活的性别差异可能至少部分反映了炎症反应早期阶段的疼痛处理差异。

4.2. LHA神经元中食欲素A和食欲素B的共定位
本研究发现，LHA神经元中食欲素A和食欲素B完全共定位，这与先前的研究[17]一致，这些研究表明单个前体肽在前下丘脑神经元内被加工成这两种肽。后续的解剖学研究证实，LHA中几乎所有食欲素免疫反应神经元都包含这两种肽，而仅含食欲素A或仅含食欲素B的亚型很少见。最近，追踪和光遗传学研究在绘制它们的投射和探究其功能作用时将“食欲素神经元”视为一个统一的群体[18]，[19]。我们的结果支持这些发现，并验证了在后续的c-Fos共定位分析中使用食欲素B作为食欲素神经元代表的合理性。

4.3. 正式醇诱导的疼痛感知过程中食欲素神经元的性别特异性招募
与一些报道雌性中食欲素神经元数量或基础活性更高的大鼠研究[20]，[21]，[22]相反，我们没有检测到不同发情阶段LHA中食欲素免疫反应神经元总数的性别差异。这与显示下丘脑细胞计数仅有微小差异或甚至偏向雄性的小鼠研究[3]，[23]一致。特别是在大鼠和一些人类群体中，雌性通常表现出更高的食欲素mRNA水平，并且在几种实验范式中，面对心理或社会压力时，食欲素神经元的招募更为明显，这导致了一种普遍的观点，即食欲素系统在应激领域的活性存在性别偏好[3]，[5]。考虑到疼痛具有强烈的情绪和应激相关成分，人们可能预测甲醛刺激也会优先招募雌性的食欲素神经元。然而，我们的数据并不支持这一预测；尽管食欲素神经元的数量相当，但在甲醛刺激后，表达c-Fos的食欲素神经元在雄性中的比例高于雌性，这表明在痛觉感知过程中食欲素神经元的招募存在性别差异，并非简单地反映了心理压力下的情况，而可能反映了食欲素系统在特定情境下的激活情况。由于我们只研究了发情前期和发情后期，我们的结论仅限于这两个阶段。然而，高雌激素和低雌激素条件之间没有差异，这表明在甲醛诱导的痛觉感知过程中，食欲素招募的大规模雌激素依赖性调节不太可能存在。在痛觉感知过程中出现性别偏好的原因可能是多方面的。一种可能的解释是，以应激为主导的实验范式更倾向于激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴信号通路[3]，[5]，[24]，而在我们的实验方案中，痛觉输入和下行单胺能通路可能是激活食欲素神经元的主要驱动力[24]，[25]。如果这些单胺能突触在雄性中的强度更大，那么即使在两性之间食欲素神经元的总数相似，痛觉刺激也更可能优先激活雄性的食欲素神经元。另一种可能性是，功能不同的食欲素神经元亚群在两性之间有差异。食欲素神经元是异质性的，其定义基于投射目标和共表达的神经肽[18]，[26]。在压力条件下，包括离子通道表达和自发放电率在内的内在属性在雌性中通常更高[27]，加上来自HPA轴相关通路与下行单胺能痛觉通路的传入驱动不同，这可能导致这些亚群在雄性和雌性中扮演不同的功能角色。在这种情况下，雌性可能更倾向于招募投射到应激相关目标的食欲素神经元，而雄性则更有效地激活投射到痛觉调节区域的食欲素神经元。因此，尽管两性之间的食欲素神经元数量和脊髓OX1R/OX2R表达相当，但投射定义的食欲素神经元亚群的招募差异可能解释了在痛觉处理过程中食欲素能通路的差异性参与。综上所述，这些考虑支持了这样的观点：食欲素神经元本身并不具有“性别偏好”，而是应激类型决定了它们的招募模式、所涉及的传入回路以及将食欲素活性与情绪或痛觉挑战联系起来的投射和性别特异性细胞特性。由于我们的c-Fos分析没有区分投射定义或肽定义的食欲素亚群，因此尚不清楚在每种情况下哪些亚群被优先激活。此外，由于这项研究依赖于c-Fos免疫反应性，这些发现应被视为关联性的而非因果性的。未来的研究需要使用特定细胞类型的方法和直接操控食欲素系统（例如，药理学或光遗传学方法）来阐明这些神经元的功能和因果作用。此外，本研究的另一个局限性是缺乏注射对照组，这限制了我们完全分离注射相关压力或机械刺激对观察到的神经活动的潜在影响。不过，我们之前已经证明生理盐水注射不会引起与甲醛测试相关的特征性痛觉行为[11]。甲醛诱导的行为反应与LHA c-Fos激活的时间对应关系支持了我们的解释，即观察到的c-Fos诱导反映了与疼痛相关的神经活动。

4.4. 脊髓食欲素A/B神经支配及潜在的激素影响
食欲素A免疫反应纤维在多个投射目标中分布密集，包括下丘脑、中脑和脊髓，而食欲素B纤维则相对较少[28]。然而，在脊髓中，这两种肽的分布有重叠，尤其是在I层和X层[29]，[30]。在我们的研究中，腰背角的神经支配与这些报告一致，食欲素A和食欲素B的分布模式相似。尽管我们没有检测到LHA中食欲素阳性神经元数量随发情周期的变化，但在发情前期雌性的腰背角中食欲素A纤维的强度 tend to 更高。鉴于免疫荧光强度反映的是轴突和末梢中的肽含量而非释放量，这种模式可能与肽合成、轴突运输或释放概率的周期依赖性变化相符。例如，据报道发情前期雌性的雌二醇水平升高会调节前食欲素和OX1R的表达[8]。然而，我们无法确定增加的纤维信号是反映了肽生产的增加还是释放的减少，这个问题需要通过未来的研究直接测量食欲素释放或电生理读数来解答。

4.5. 脊髓食欲素受体基因表达无性别差异
在本研究中，我们量化了雄性、发情前期雌性和发情后期雌性小鼠腰骶脊髓中OX1R和OX2R的mRNA表达，未发现任何显著的组间差异。据我们所知，几乎没有任何先前的研究直接比较了雄性和雌性之间的脊髓OX1R/OX2R表达，而大多数关于食欲素受体性别差异的研究都集中在下丘脑和其他脑区 rather than 脊髓[3]，[17]。因此，我们的数据提供了初步证据，至少在C57BL/6N小鼠的腰骶脊髓中，OX1R和OX2R的基线转录潜力在两性和不同发情阶段大致相当。然而，mRNA水平并不一定反映受体的功能性可用性，因为OX1R和OX2R是G蛋白偶联受体，它们会经历快速的转运和调节[27]。在许多G蛋白偶联受体系统中，即使mRNA水平相对稳定，受体蛋白水平和下游信号传导也可能在几分钟到几小时的时间内发生变化。因此，不能排除受体功能（如急性受体转运、翻译后调节或对内源性释放的食欲素的下游信号传导）在性别上的差异。此外，本研究的另一个局限性是样本量相对较小（每组n=6），这可能限制了我们检测脊髓纤维密度或受体mRNA表达细微差异的能力。总体而言，我们的发现表明，食欲素介导的镇痛效果的性别差异不能归因于下行通路的解剖结构差异，因为LHA中的食欲素神经元数量、脊髓中的食欲素能纤维密度以及腰髓中OX1R/OX2R的基线mRNA表达在两组之间没有差异。相反，我们观察到的主要差异是雄性中食欲素神经元的招募更多，这反映在甲醛刺激后c-Fos诱导程度更高。因此，抗痛效果的性别差异似乎源于食欲素神经元上游激活和肽释放动态的功能差异，而不是解剖结构或受体可用性的差异。

5. 重要性声明
甲醛诱导的痛觉在雄性中更强烈地招募了食欲素神经元，尽管雄性和雌性的脊髓食欲素受体mRNA表达水平和食欲素纤维密度相似。

**作者贡献声明**
福泽聪介：写作 – 审稿与编辑，写作 – 初始草稿，可视化，验证，调查，正式分析，数据管理。
付雅辅：写作 – 审稿与编辑，数据管理。
松尾莉莎：写作 – 审稿与编辑，写作 – 初始草稿，监督，资源管理，项目协调，资金筹集，正式分析，概念构思。

**资助**
本研究得到了日本学术振兴会（日本学术振兴会补助金项目，资助编号25K00277（金谷惠子）的支持。本研究还得到了Fordays自力更生支持协会（金谷惠子）的支持。