在糖尿病大鼠伤口模型中，对丝光绿蝇（Lucilia sericata）幼虫与Achillea sintenisii提取物组合对伤口愈合活性的组织病理学研究

《Medical and Veterinary Entomology》：Histopathological investigation of wound healing activities of Lucilia sericata Larva and Achillea sintenisii extract combinations in diabetic rat wound model

　　摘要

慢性伤口，尤其是在糖尿病患者中，对全球医疗系统构成了重大的临床和经济负担。为了改善愈合效果，越来越多的辅助疗法被与传统治疗方法相结合使用。利用绿头黑蝇（Lucilia sericata）幼虫的蛆虫清创疗法（Maggot Debridement Therapy, MDT）是一种全球公认的用于治疗难以愈合伤口的方法。这些幼虫分泌具有抗真菌、抗菌和抗炎特性的物质。草药也在慢性伤口护理中发挥作用，多种蓍草属（Achillea）植物传统上被用于医疗目的。本研究调查了将绿头黑蝇幼虫分泌物与蓍草属Achillea sintenisii植物提取物结合制成的药膏与市售创可贴Furacin?在伤口愈合效果上的比较。在患有糖尿病的Wistar白化鼠身上制造了切除性伤口，并将它们分为四组：DF（使用Furacin?）、DM（使用绿头黑蝇分泌物）、DA（使用蓍草属Achillea sintenisii提取物）以及DM+DA（联合使用这两种成分）。在第0天、第4天、第8天和第12天分别评估了伤口面积、收缩率和组织学参数。所有组的伤口面积随时间显著减小（F=511.9，p=0.001），平均值从第0天的11.11平方厘米下降到第4天的7.44平方厘米、第8天的4.93平方厘米以及第12天的2.01平方厘米。各组的收缩率也逐步增加（F=169.3，p=0.001）：第4天时，收缩率分别为DF组20.41%±1.24%、DM组27.67%±0.94%、DA组24.22%±1.20%；第8天时，收缩率升至DF组42.86%±1.11%、DM组63.34%±0.92%、DA组52.97%±0.55%；第12天时，DM+DA组的收缩率达到了92.91%±0.40%，显著高于其他组（DM组84.30%±0.88%、DA组79.43%±0.61%），这表明联合疗法具有明显的协同效应（p<0.05）。组织学评估进一步证实了这些发现，DM+DA组在所有组织修复参数（上皮化、成纤维细胞密度、胶原沉积、血管生成和毛囊再生）上均表现最佳（p<0.05）。综合这些结果，可以确认绿头黑蝇分泌物与蓍草属Achillea sintenisii提取物的结合使用具有比单独使用任一成分或Furacin?更强的协同愈合效果，这可能有助于开发出价格合理、易于获取且有效的自然产品，用于慢性伤口护理。这些发现可能为兽医和人类医学领域的创新治疗方法提供帮助。

引言

皮肤伤口的愈合是一个复杂的生物机制，代表了进化上的优势。由于皮肤作为物理、化学和微生物防御屏障的重要功能，其修复需要多种类型的细胞在一系列步骤中协同工作。在发达国家中，非愈合性皮肤伤口的发病率不断上升，这引发了关于“伤口愈合”这一复杂动态过程的大量研究。虽然小的皮肤伤口可以在几天内愈合，但较大的伤口（如糖尿病溃疡、创伤性伤口、反复发作的伤口或重大手术后的伤口）往往会成为慢性伤口，需要较长时间才能愈合。开发针对这类伤口的治疗方法时，必须全面了解相关细胞机制（Kalan & Brennan, 2019）。糖尿病（DM）是一种高度复杂的疾病，目前影响着约5亿人，预计其发病率未来还会增加，引发全球关注。糖尿病导致的发病率和死亡率上升主要是由于伤口愈合迟缓以及大血管和小血管并发症的发展。高昂的医疗费用、患者生活质量下降所带来的心理社会问题以及截肢的必要性，都迫切需要开发有效的治疗手段。在这方面，科学研究更加关注传统医药产品，因为它们相比现代临床药物具有副作用少、不良反应少、成本低、实用性强且易于获取等优点（Khan & Ahmad, 2019）。植物、植物提取物、从植物中分离出的生物活性成分、矿物质（锌和铜）、动物及其自然资源都是用于对抗这种疾病的传统医药产品。目前市场上有许多标榜为传统医药产品的医疗敷料和外用产品，但由于其不便性、潜在的不良反应风险、治疗效果不佳以及额外的经济负担（尤其是对于慢性伤口而言），这些产品并未得到广泛采用。近年来，补充和整合医学治疗方式在现代医学中受到了关注。其中，蛆虫清创疗法（Maggot Debridement Therapy, MDT/LDT）是一种有效的治疗非愈合性化脓性皮肤软组织、开放性伤口、坏死组织及真菌感染相关症状的方法（Bazaliński et al., 2019）。伤口愈合需要满足四个基本条件：消除持续存在的创伤、控制感染、优化血管化以及有效清除坏死组织（Thomas et al., 2021）。尽管清创过程看似简单，但实际上它是治疗糖尿病伤口的首要和最关键步骤。蛆虫清创疗法的主要作用是彻底清除坏死组织，这对糖尿病患者尤为重要。蛆虫的分泌物含有多种生物活性成分，这些成分在伤口愈合过程中发挥着协同作用。蛆虫分泌的酶（如胶原蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶类似物和胰蛋白酶类似物）、脂肪酶、核酸酶和糖苷酶有助于促进其摄食并实现有效的清创（Bohova et al., 2012; Tombulturk & Kanigur-Sultuybek, 2021）。还有越来越多的证据表明，蛆虫分泌物在伤口愈合过程中具有免疫调节作用（van der Plas et al., 2007）。据报道，中性粒细胞中的弹性蛋白酶可以通过降解细胞外基质来抑制中性粒细胞的迁移，从而缓解慢性伤口中的长期炎症反应（Bohova et al., 2012; van der Plas et al., 2007）。所使用的蛆虫属于绿头黑蝇（Lucilia sericata），这是一种在世界许多地区普遍存在的常见蝇类。MDT的优势在于它能快速高效地清除伤口中的坏死组织和细胞碎片，是一种低成本的治疗方法，易于应用且无需住院治疗。此外，对于患有系统性疾病（如糖尿病）的患者来说，慢性伤口可以通过这种疗法得到治疗和清创，而无需口服或注射抗生素等治疗，为患者和医生都带来了极大便利（Fleischmann, 2004）。草药治疗也是另一种被研究用于慢性伤口愈合的方法（Naik & Harding, 2017）。自古以来，一些药用植物就被用于伤口治疗（Adetutu et al., 2011）。针对不同植物的体内研究表明，它们在处理皮肤疾病（包括切割伤、急性和慢性伤口、烧伤伤口）方面具有良好效果（Firdous & Sautya, 2018; Jain et al., 2009; Mirmalek et al., 2016）。根据世界卫生组织的数据，发展中国家约有80%的人口在初级卫生保健中使用草药治疗（WHO, 2005）。菊科（Asteraceae）植物中的某些种类已被用于民间疗法长达数千年。蓍草属（Achillea）植物以希腊神话中的英雄阿喀琉斯（Achilles）命名，传说中阿喀琉斯曾在特洛伊战争中用蓍草属植物治疗受伤的士兵（Cheers, 1999）。蓍草属植物提取物富含植物化学成分，尤其在皮肤病治疗和伤口护理产品中具有很高的生物活性（Strz?pek-Gomó?ka et al., 2021）。多项体内研究表明，蓍草属植物如A. millefolium L.、A. kellalensis Boiss.、A. biebersteinii Afan.和A. asiatica Serg.具有出色的伤口愈合效果（Akkol et al., 2011; Dorjsembe et al., 2017）。在发展中国家，蓍草属植物如A. fragrantissima（Eissa et al., 2018）、A. millefolium L.（Mohammadhosseini et al., 2017）、A. biebersteinii Afan.、A. nobilis L.（Ghorbani, 2005）和A. asiatica Serg.传统上被用于伤口和炎症性疾病的治疗（Eruygur et al., 2020）。蓍草属A. sintenisii Hub. Mor.是土耳其Sivas省和Erzincan省的特有物种，生长在草原、石灰质斜坡和含石膏的丘陵地带。植物化学研究表明，其黄酮类化合物可以促进胶原合成，加速组织修复，其中主要的促愈合成分包括奎宁酸和绿原酸（Eruygur et al., 2023）。鉴于这些生物活性，研究认为绿头黑蝇幼虫分泌物和蓍草属Achillea sintenisii提取物可能对糖尿病伤口愈合有益。详细探讨这两种植物和动物来源的治疗成分联合使用对慢性伤口愈合的正面或负面影响，可以为相关文献提供参考。研究这两种治疗成分在联合使用时的激活或失活情况、协同效应或拮抗效应对愈合过程的影响具有研究价值。因此，本研究在体内切除性伤口模型中独立及联合使用了无菌绿头黑蝇幼虫分泌物提取物和蓍草属Achillea sintenisii地上部分提取物来探究其效果。

材料与方法

绿头黑蝇（Lucilia sericata）的培养

绿头黑蝇的实验室培养是在安卡拉Y?ld?r?m Beyaz?t大学?ubuk GETAT中心的“蛆虫研究实验室”进行的。该昆虫房配备了通风系统，可以调节光照-黑暗周期、湿度和温度。绿头黑蝇蛹在特制的40×40×40厘米金属笼内7-10天内发育为成虫，笼子周围包裹着薄纱。成虫以20%的糖水为食。鸡肝被放置在培养皿中放入笼内，以促使雌蝇产卵。收集孵化出来的卵，分离后用蒸馏水冲洗以去除杂质和无法存活的卵。为进行灭菌处理，卵依次接受两轮0.05% NaOCl处理，每轮处理过程中使用涡流混合器（2000转/分钟，每次1分钟），然后小心去除漂浮的（无法存活的）卵。灭菌后，将卵划线接种到营养琼脂平板上，并在37°C下过夜培养以监测微生物污染情况。只有无生长迹象的批次才能用于临床实验。使用立体显微镜（Olympus SZX10）观察卵的孵化和幼虫发育情况。

蛆虫分泌物的获取

用于伤口治疗的幼虫通常是接近第一龄末期或第二龄初期的。获取蛆虫分泌物的方法参考了Barnes和Gennard以及Do?andemir的研究（Barnes & Gennard, 2013; Do?andemir, 2010）。将2000-4000只处于适当阶段的无菌幼虫小心收集到50毫升的Falcon试管中。无菌幼虫在含有蒸馏水的试管中于25°C下过夜培养。随后，将这些含有幼虫分泌物的液体转移到离心管中并离心15分钟。离心结束后，会在颗粒层和上层液体之间获得一层液体，通过无菌注射器吸取该液体并过滤（使用0.2微米过滤器），立即使用。

蓍草属Achillea sintenisii的采集与处理

作为药用植物选择的Achillea sintenisii在开花期（2021年6月）从Sivas省Hafik ?ncea?a村东南方向1420米处采集（坐标：37°S 340045–4408104 Hamzao?lu & Ko? 3591）。采集的植物标本被制作成标本并记录在安卡拉大学药学院标本室（标本编号：30920）。样本在阴凉处晾干后储存。

植物提取物的制备与药膏的制作

将晾干的蓍草属Achillea sintenisii地上部分用植物研磨机粉碎。取50克粉末样本，用500毫升甲醇在室温下通过超声波浴提取1小时。提取后，用滤纸过滤混合物，并在45°C、低压下通过旋转蒸发器蒸发至干燥。提取物的重量是通过称量装有提取物的烧瓶重量以及烧瓶的净重，并取两者之差来确定的。过程结束后得到的浓缩提取物被储存于4°C的环境中。这些提取物被储存起来以备后续治疗使用。另外还制备了储备溶液。选取了10克Achillea sintenisii的草本样本，将其溶解在5毫升3%浓度的二甲基亚砜（DMSO）中，然后加入10克基础乳霜中，搅拌均匀后得到膏状产品。

动物实验方案：

该研究在52只体重为200-300克的雄性Wistar Albino大鼠身上进行。大鼠可以自由摄取标准饲料和清水。大鼠被分为4组，每组13只。它们被安置在面积为15平方米的安静实验室内的标准耐热鼠笼中。实验环境中的平均温度为（21±3）°C，并配备了空调。环境湿度保持在45%-50%之间，大鼠每天更换两次饮用水。所有大鼠都处于12小时光照/12小时黑暗的周期中。每组中的每只大鼠都单独饲养在无菌笼子里。所有对大鼠进行的操作均遵循有关动物护理和使用的伦理规则（动物实验地方伦理委员会协议编号：610）。

糖尿病的诱导：

所有大鼠在注射链脲佐菌素（STZ）前需禁食一夜。STZ的给药剂量为60毫克/千克，通过腹腔注射方式给予，使用的是新鲜配制的0.1摩尔浓度柠檬酸盐缓冲液（pH=4.5）。STZ注射2天后，使用血糖仪监测大鼠的血糖水平。血糖水平超过200毫克/分升的大鼠被视为糖尿病患者，被用于后续研究（Schmatz等人，2009年）。在此过程中，28只出现并发症但并不患有糖尿病的大鼠被排除在实验之外，研究继续在剩余的大鼠中进行。此外，在研究的中期和末期还对大鼠的血糖水平进行了监测。

切割伤口模型：

大鼠通过腹腔或肌肉注射10毫克/千克的xylazine HCl（Rompun，拜耳公司，土耳其）和50毫克/千克的ketamine HCl（Ketalar，Warner Lambert Pharmaceuticals Industry and Trade Inc.，伊斯坦布尔）进行麻醉。每组大鼠都被置于仰卧位，随后使用剃须刀剃除背部头皮，但不会损伤皮肤；在即将形成伤口的区域进行常规的无菌处理。伤口区域先用70%酒精擦拭，然后用聚维酮碘溶液清洁，遵循无菌操作规程。用笔标出直径为1.5-2厘米的圆形区域，然后使用直径为6毫米的活检针（Acu-Punch）和手术剪在所有四组大鼠的背部皮肤上制造全层圆形切割伤口，包括皮肤、皮下结缔组织和“panniculus carnosus”层。为了观察不同组别伤口愈合情况的差异，在大鼠背部皮肤的中线、头侧和尾侧区域制造了全层伤口。

实验处理：

在实验期间，必须精确计算每组大鼠的用药剂量。研究的主要目标有两个：首先是在实验过程中消除副作用的风险；其次是在实验结束时准确评估治疗效果。为了实现这一目标，需要进行精确的换算计算，以确定局部应用的治疗剂的确切剂量。第一组实验动物（n=6）的伤口区域每天涂抹一次0.2克Furacin?商业医疗膏；第二组实验动物（n=6）的伤口区域每天用浸有200微升幼虫分泌物的外科海绵处理一次，持续12天；第三组实验动物（n=6）的伤口区域每天涂抹一次由0.2克Achillea sintenisii提取物制成的DA膏；第四组实验动物（n=6）的伤口区域每天先涂抹200微升幼虫分泌物，然后涂抹由0.2克Achillea sintenisii提取物制成的DA膏，持续12天。

伤口愈合的监测和组织样本的收集：

在实验的第0天、第4天和第8天对伤口进行了随访。第12天，使用直径为6毫米的活检针采集伤口活检样本，并将样本保存在10%的中性福尔马林溶液中。所有四组大鼠的伤口愈合情况均在距离15厘米的高度用相机拍摄记录。之后，使用AutoCAD程序对伤口区域进行了评估。伤口收缩度通过伤口面积的减少百分比来计算。

相关伤口样本的制备及组织病理学评估工作在安卡拉Y?ld?r?m Beyaz?t大学的中央研究实验室和应用研究中心进行。伤口组织样本首先在10%的中性福尔马林中固定1周，然后用自来水冲洗10小时，并进行常规的组织切片处理。随后，样本经过不同浓度乙醇（70°、80°、90°、96°和100°）和二甲苯系列处理以增加透明度，最后将样本包埋在石蜡块中。使用显微镜（Leica RM2245）从石蜡块中切取6微米的切片，用苏木精和伊红（H&E）染色，在研究显微镜（Olympus? BX51）下观察，并拍照记录组织学变化，包括成纤维细胞、上皮化、血管生成和毛囊的存在情况，评分标准分别为0（无）、1（少量）、2（轻微）、3（中度）和4（显著）。

数据分析：

伤口愈合百分比的数据通过单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。p<0.05的值被认为具有统计学意义。

结果：

总体及宏观结果：

本研究仅在糖尿病大鼠上进行。所有糖尿病大鼠均表现出多饮、多尿、多食、体重减轻、虚弱和嗜睡等症状。在实验第12天，对DF组、DM组、DA组和DM+DA组的头侧、中线和尾侧伤口的愈合情况进行评估后发现，头侧伤口的愈合速度最快且效果最明显。在对四组大鼠背部区域进行手术处理后，仅在DM组的第5天观察到1例感染。没有出现血肿、渗出液积聚、皮下脓肿形成或伤口裂开等并发症。各组之间以及同一组内不同时间点的伤口宏观测量结果存在统计显著差异（图1，p<0.05）。

幼虫分泌物和Achillea sintenisii甲醇提取物对伤口愈合的影响：

在第0天、第4天和第12天，DF组、DM组、DA组和DM+DA组之间的伤口测量结果存在统计显著差异（p=0.01）。第12天时，DF组和DA组的伤口平均测量结果与DM组和DM+DA组的平均测量结果相比也有显著差异，其中DF组和DA组的平均测量结果更高（表1）。

伤口面积和收缩率的比较：

使用毫米纸将切割伤口的表面积转换为数值数据，在第0天、第4天和第12天进行了计算，并根据第0天的数据确定了各组的愈合率。各组之间的伤口面积（cm2）无统计学显著差异（p=0.284），但在收缩率（%）方面存在显著差异（p=0.009）。DF组的收缩率低于DM组、DA组和DM+DA组（图2，表2）。

不同时间点各组伤口面积和收缩率的比较：

使用ANOVA统计分析了各组间伤口面积（cm2）和收缩率（%）的差异。DF组在第0天的平均面积为1.87±0.28厘米2，DM组为1.84±0.11厘米2，DA组为1.81±0.12厘米2，DM+DA组为1.87±0.12厘米2（表1）。DF组在第12天的收缩率为45.02%，显著高于DM组的26.44%和DM+DA组的40.58%。

结论：

* 注：A、B、C、D表示同一列中不同字母表示的均值之间存在显著差异（p<0.05）；a、b、c、d表示同一行中不同字母表示的均值之间存在显著差异（p<0.05）。
* Kruskal–Wallis统计显著性水平用于分析四个组在不同时间点的测量结果差异；Friedman检验用于分析同一组内不同时间点的测量结果差异。在每个组内，第0天、第4天和第12天的测量结果存在显著差异（p=0.01）。第0天的平均值最高，第12天的平均值最低，且平均值从第0天到第12天逐渐下降（表1）。
** 结果表明，不同时间点各组之间的伤口面积（cm2）存在显著差异（p<0.001）。第0天的伤口面积明显高于第4天和第12天；第4天的伤口面积也显著高于第8天和第12天；第8天的伤口面积显著高于第12天。此外，各组的收缩率也存在显著差异（p<0.001）。正如预期的那样，随着时间的推移，同一组中的伤口面积逐渐缩小，收缩率也有所增加。在第12天结束时，发现伤口面积从小到大的顺序为DM+DA、DM、DA、DF（见图1和图4）。图4可以在图形查看器中打开。

在不同天数之间，各组之间的收缩率变化百分比图。组织病理学结果

在所有组中，通过组织病理学检查分析了伤口区域的上皮化、纤维血管结缔组织形成、胶原蛋白沉积、血管生成以及毛囊发育（见图5）。图5可以在图形查看器中打开。

（a）第12天结束时DF组的组织学发现，放大100倍。（b）第12天结束时DM组的组织学发现，放大100倍。（c）第12天结束时DA组的组织学发现，放大100倍。（d）第12天结束时DM+DA组的组织学发现，放大100倍。e为上皮细胞；f为成纤维细胞；hd为皮下组织；k为胶原蛋白；kd为血管；kf为毛囊；kt为角蛋白。第12天治疗组评估的组织病理学水平详见表4。当从上皮化、纤维血管结缔组织增殖和胶原蛋白沉积方面进行评估时，到第12天时 all 组之间都观察到了统计学上的显著差异（p < 0.05）。

表4. 伤口愈合水平的组织学评估。

| 组别 | 上皮化 | 成纤维细胞 | 胶原蛋白 | 血管生成 | 毛囊 |
|------|-----------------|------------------|-------------------|-------------------|
| DM | 2.41 ± 0.08a | 2.90 ± 0.11a | 2.73 ± 0.06a | 0.69 ± 0.08a |
| DA | 2.73 ± 0.11c | 3.35 ± 0.07c | 2.86 ± 0.04b | 0.85 ± 0.05b |
| DM+DA | 2.58 ± 0.04b | 3.12 ± 0.1b | 2.94 ± 0.03c | 1.07 ± 0.14c |

注意：数值为每组6只大鼠的平均值±标准差。p < 0.05表示具有显著性。同一行上不同字母表示平均值之间存在显著差异。观察到所有组都开始了重新上皮化过程，其中DM+DA组（第4组）的统计得分最高，其次是DM组（第2组）。DM+DA组（第4组）和DM组（第2组）之间存在统计学上的相似性。在这两组中，都观察到再生的上皮层由更多的细胞组成，并且再生的上皮向真皮层形成了乳头状延伸（见图5b,d）。另一方面，观察到巨噬细胞并没有随着这两个组炎症阶段的减弱而减少成纤维细胞的数量；相反，增殖的成纤维细胞（纤维血管结缔组织形成者）成熟得更早。与DF组（第1组）和DA组（第3组）相比，DM组（第2组）和DM+DA组（第4组）的成纤维细胞水平显著增加。发现DM+DA组（第4组）的胶原蛋白生成控制得更好，统计得分显著（见图5d，表4，p < 0.05）。DM+DA组（第4组）的血管生成得分也显著，因为在真皮层观察到了新血管的增殖（见图5，表4，p < 0.05）。在血管生成和毛囊方面，DF组（第1组）和DA组（第3组）之间没有观察到显著差异（见图5a,c，表4，p < 0.05）。DM组的数值在这些组中统计上更高（见图5b，表4，p < 0.05）。在DM+DA组（第4组），从新形成的表皮延伸出的萎缩毛囊的数值也显著高于其他治疗组（见图5d，表4，p < 0.05）。当从上皮化、成纤维细胞和胶原蛋白方面进行评估时，观察到第12天结束时所有组之间存在差异。在所有参数中，DM+DA组的数值最高（见表4）。

**讨论与结论**

糖尿病伤口是一个重要的临床问题，由于慢性炎症、血管生成受损和细胞增殖减少等病理过程，伤口愈合过程会延迟。糖尿病患者使用一些基于植物和动物的治疗来源作为“生物方法”来治疗他们的伤口。然而，目前没有足够的研究证据表明这些治疗方法大多数能促进糖尿病伤口的愈合。在这项研究中，从组织病理学角度调查了Lucilia sericata蛆虫分泌物和Achillea sintenisii提取物组合对糖尿病大鼠伤口愈合的影响。根据获得的结果，用植物提取物和蛆虫分泌物处理的实验组比未处理组表现出更快的伤口愈合过程，表明这种组合以协同效应促进了伤口愈合过程。这项研究提供了重要的发现，支持了当前关于使用天然来源的治疗剂治疗慢性伤口的文献。近年来，由于抗生素耐药性的增加和传统治疗方法的局限性，蛆虫清创疗法和植物疗法等替代方法在科学界获得了相当大的关注。我们的研究结果阐明了这些治疗方法对伤口愈合细胞机制的影响，从而填补了现有文献中的空白，并为未来的研究开辟了新的视角。此外，这项研究结合了传统知识和现代科学方法，有潜力为转化医学领域的发展贡献基于证据的、安全且经济有效的治疗方案。人们对蛆虫（幼虫）疗法的临床益处的认识不断提高，这推动了在糖尿病、静脉溃疡和慢性压疮等难治性伤口治疗中的应用向基于证据的目标性应用转变，同时也减少了这些伤口中的细菌负担。Lucilia sericata蛆虫及其分泌物促进伤口愈合的特性已经被认识了一段时间。蛆虫可以通过分泌/排泄蛋白酶来刺激伤口愈合。研究表明，这些蛋白酶在体内和体外都具有抗菌、抗真菌、抗炎、血管生成、促进增殖、止血和组织再生的作用。据提出，这些作用通过启动伤口区域的细胞信号级联反应来加速伤口愈合过程。在L. sericata分泌物中发现的蛋白酶包括金属蛋白酶（如胶原酶）和丝氨酸蛋白酶，以及类似胰蛋白酶和胰凝乳素酶的酶。胶原酶属于基质金属蛋白酶（MMP）家族，通过参与细胞外基质（ECM）的重组来影响伤口愈合。胶原酶通过分解组织为较小分子并提高吞噬活性和氧合来催化化学过程，从而加速伤口愈合。因此，蛆虫在分泌物中分泌的氨和盐分使伤口环境碱化，有利于胶原酶的活性。丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶通过蛋白酶消化作用帮助伤口愈合，并通过分解细胞外基质（ECM）蛋白来清除死亡和感染的组织。糖尿病伤口中最严重的问题之一是坏死组织为细菌提供了适宜的繁殖环境，阻碍了伤口愈合。因此，在治疗糖尿病伤口时，必须持续清除坏死组织和伤口深处的腔洞，直到形成肉芽组织。与其他清创方法相比，蛆虫疗法是一个更优选的治疗选择，因为它通过类似显微手术的方式清创伤口，同时不破坏健康组织，且疼痛较少（Gazi等人，2019年）。多项临床和实验研究表明，在蛆虫分泌物处理中，坏死组织的清创得到加速，细菌负荷减少，组织再生得到促进（Nigam等人，2006年；Sherman等人，2000年）。据报道，与现有技术相比，使用分泌物治疗显示出更有效和更快的抗菌效果。在一项研究中，首次从蛆虫的肠道和组织中分离出一种名为lucifensin的分子，研究人员指出这种分子可以作为治疗耐抗生素伤口的有效局部用药。然而，也强调表明抗细菌效果的随机研究数量有限（Tombulturk & Kanigur-Sultuybek，2021年）。虽然最初认为伤口愈合完全是通过清创效应实现的，但现在知道伤口愈合影响所有四个重叠的生理阶段（Mumcuo?lu，2013年）。特别是，蛆虫分泌物的分子水平效应影响了对伤口愈合至关重要的三个基本过程：炎症、血管生成和细胞迁移/增殖。关于蛆虫分泌物中促进生长因子成分的有序结构及其对组织损伤的再生反应的研究正在不断增加。免疫细胞通过分泌细胞因子和生长因子来控制炎症。在慢性伤口中，这种平衡被打破，促炎性巨噬细胞占主导地位。另一方面，抗炎性巨噬细胞通过产生IL-10、bFGF和VEGF来支持细胞增殖和血管形成。一项使用蛆虫分泌物的体外研究表明，这些分泌物以剂量依赖的方式抑制了促炎性细胞因子（TNF-α、IL-12p40）并增加了抗炎性IL-10的产生（Tombulturk & Kanigur-Sultuybek，2021年）。在我们的研究中，观察到用蛆虫分泌物处理的组上皮化加速，炎症细胞浸润减少。van der Plas等人（2007年）在评估蛆虫分泌物对人中性粒细胞功能活动的影响时发现，蛆虫分泌物治疗阻断了慢性伤口中的多种中性粒细胞炎症促进反应。我们的评估表明，蛆虫治疗组中的上皮化加速，炎症细胞浸润减少。van der Plas等人（2007年）的研究发现，蛆虫分泌物通过促进中性粒细胞向病变区域的招募来防止炎症。表皮细胞在迁移过程中通过吞噬碎片、组织残余物、异物和阻碍其路径的伤口结痂来促进移动，这一发现支持了蛆虫分泌物的抗炎和组织再生特性。在体外条件下进行的研究调查了蛆虫分泌物对人类新生成纤维细胞培养的代谢效应。经过5天和10天的培养期后，用分泌物处理的成纤维细胞中的细胞器结构（特定超微结构成分）和代谢活动显著增加。研究人员提出，这种增加可以归因于细胞外基质（ECM）成分的合成增加，特别是胶原蛋白（Polakovicova等人，2015年）。根据我们的体内实验观察和宏观结果，从第4天开始，应用蛆虫分泌物的处理组中肉芽组织形成明显增加，同时成纤维细胞数量也随之增加，伴随血管生成。我们的发现与体外和体内研究的发现高度一致。这些结果强烈证明了排泄/分泌疗法在慢性伤口修复中的快速有效性。最近的综合研究集中在蛆虫排泄/分泌物（ES）上，包括有益酶的分离和表征，这些酶可用于伤口愈合的局部应用，以及这些酶的分子机制。分子和蛋白质组学研究表明，L. sericata幼虫分泌物含有三种主要成分：蛋白酶、小抗菌肽和生长因子（Tombulturk & Kanigur-Sultuybek，2021年）。已鉴定的血管生成素-1、胶原酶-1（MMP-1）和胰凝乳素酶-1是已知可以通过清创和组织再生促进伤口愈合的蛋白酶（Alipour等人，2019年，2020年）。L. sericata蛆虫分泌物的重组生产在创新和非侵入性治疗慢性溃疡方面具有重要意义，因为它们与病理过程无关。考虑到胶原酶在医疗应用中的广泛潜力，首次开发了一种方法，将该酶的基因克隆到SF9昆虫细胞系中（Alipour等人，2019年），以表达和纯化这种酶。这些发现将有助于未来设计安全且多功能的重组药物。此外，从唾液腺中获得的分泌物被认为是开发新型重组蛋白的理想候选来源，这些重组蛋白可用于治疗压疮、烧伤、骨髓炎、糖尿病足溃疡、囊性纤维化和其他慢性伤口。同样，药用植物也能促进伤口愈合过程，这主要归功于它们的抗菌、抗炎和抗氧化特性（Builders & Builders，2016）。历史上，传统药用植物一直被以多种组合形式用于治疗皮肤疾病和皮肤病问题，如伤口、损伤、割伤、烧伤、脱发和湿疹（Li等人，2022；Zeng等人，2022）。Achillea sintenisii是一种属于菊科的本土植物，在传统医学中因其促进伤口愈合和抗炎作用而受到认可。该植物含有黄酮类、酚类和萜类等生物活性化合物，具有抗氧化和抗菌活性（Akkol等人，2011；Konyalio?lu等人，2005）。最近的研究确定绿原酸和奎宁酸是参与伤口愈合的主要成分（Eruygur等人，2023）。胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的主要成分之一，在重建受损组织方面起着关键作用。成纤维细胞对胶原蛋白的积累至关重要（Suvik & Effendy，2012）。在早期的增殖阶段，成纤维细胞的活性包括响应巨噬细胞信号而进行细胞复制和向伤口区域的迁移。在愈合过程的第3天，感知伤口区域张力的成纤维细胞会调节大量胶原蛋白的合成和重塑，从而决定受伤组织的愈合情况（Panwar等人，2013）。我们从第4天开始的研究结果表明，A. sintenisii提取物显著促进了成纤维细胞的生成。这些结果揭示了A. sintenisii在组织修复过程中的支持作用。在本研究中观察到，单独使用L. sericata蛆虫分泌物和A. sintenisii提取物都能激活伤口愈合。值得注意的是，它们的组合在速度和效果上都能更早地激活伤口愈合，表明存在协同效应。所获得的微观和宏观数据与Gazi等人（2019）和Nigam等人（2022）的体内研究结果一致，这些研究证明了蛆虫分泌物在糖尿病慢性伤口中的愈合潜力（Gazi等人，2019；Nigam等人，2022），同时也与Akkol等人（2011）、Uyar等人（2017）和Almuhanna等人（2023）的研究结果一致，这些研究证实了Achillea属植物提取物在糖尿病慢性伤口中的愈合活性（Akkol等人，2011；Almuhanna等人，2023；Uyar等人，2017）。组织病理学发现表明，这两种生物剂的组合能够加速上皮形成、增加成纤维细胞增殖、增强胶原蛋白合成、重塑基质，并显著减少炎症细胞浸润。这些发现与其他关于蛆虫分泌物和A. sintenisii提取物在伤口修复过程中作用的研究结果一致。例如，有报道称蛆虫疗法可以加速肉芽组织形成并改善伤口区域的胶原蛋白组织结构（Pritchard & Nigam，2013）。同样，由于其宝贵的药理活性，A. sintenisii提取物也被认为在与氧化应激、透明质酸酶抑制、胶原蛋白合成或炎症相关的各种病理状况中具有治疗潜力（Anlas等人，2023）。这表明，蛆虫分泌物的清创和抗菌作用，结合植物提取物的抗氧化和组织再生特性，可能更有效地支持伤口愈合过程。总之，本研究评估的伤口愈合过程显示，用L. sericata蛆虫分泌物和/或A. sintenisii提取物处理的实验鼠的伤口愈合时间比使用常用伤口愈合剂Furacin处理的实验鼠更短。此外，同时使用蛆虫和A. sintenisii提取物处理的组别显示出了更好的上皮再生、胶原蛋白形成和纤维血管组织增殖。最终，L. sericata蛆虫分泌物和A. sintenisii提取物的组合可能是一种有效的糖尿病伤口愈合策略。这是文献中首篇探讨动物和植物治疗剂联合用于慢性糖尿病伤口愈合活性的研究报告。然而，仍需要更大规模和长期的研究来进行临床应用。此外，阐明这种组合的分子机制有助于优化治疗方案。

作者贡献：
Nevra Polat：撰写初稿；审稿和编辑；方法学；数据分析。
Salih Mollahalilo?lu：数据可视化；实验设计。
Murat Ko?：方法学；实验设计；数据可视化；审稿和编辑。

致谢：
本研究没有特别需要致谢的内容。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

伦理声明：
本实验研究遵循了当地伦理委员会的指导原则。所有对动物进行的操作均符合关于动物护理和使用的伦理规定（动物实验地方伦理委员会协议编号：610）。

知情同意：
所有作者同意将本文发表在本期刊上。

数据可用性声明：
用于准备本手稿的原始数据可在Dryad数据库中获取，链接为：https://doi.org/10.5061/dryad.b2rbnzsv8（Polat等人，2025）。