由SdhC亚基遗传分化赋予亚洲镰刀菌对SDHI杀菌剂的固有抗性

《Molecular Plant Pathology》：Genetic Differentiation in the SdhC Subunit Confers Intrinsic Resistance to SDHI Fungicides in Fusarium asiaticum

　　

由SdhC亚基遗传分化赋予亚洲镰刀菌对SDHI杀菌剂的固有抗性 摘要：由亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）引起的赤霉病（FHB）是中国小麦的重要病害，导致减产并使籽粒受到脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）污染。由于缺乏高抗小麦品种，化学防治仍是管理赤霉病的主要方法。本研究在亚洲镰刀菌中鉴定了两个同源的SDHC基因，即FaSDHC1和FaSDHC2。FaSDHC2的缺失损害了真菌的产孢、毒力和DON产生，而FaSDHC1的缺失则增加了DON的产生。研究发现这两个基因均调控对SDHI（琥珀酸脱氢酶抑制剂）杀菌剂的敏感性——ΔFaSDHC1表现出敏感性降低，而ΔFaSDHC2则表现出敏感性增加。为了探索SdhC亚基在亚洲镰刀菌中对SDHI杀菌剂敏感性的调控作用，研究人员通过化学驯化从ΔFaSDHC2中获得了11个抗啶酰菌胺（boscalid）突变体。遗传分析鉴定出六种突变基因型，包括在镰刀菌属中先前报道的两种（FaSdhB-H248Y和FaSdhD-E166K）以及在镰刀菌属中首次报道的四种新突变（FaSdhC1-H144Y、FaSdhC1-H144N、FaSdhD-H122Y和FaSdhD-D133N）。定点突变验证和敏感性测定表明，携带FaSdhC1-H144Y/N、FaSdhD-H122Y、FaSdhD-D133N或FaSdhD-E166K的突变体对多种SDHI杀菌剂（啶酰菌胺、氟吡菌酰胺（fluopyram）、联苯吡菌胺（pydiflumetofen）、异丙吡菌胺（isopyrazam）和苯并烯氟菌唑（benzovindiflupyr））表现出抗性。相比之下，FaSdhB-H248Y突变体对其他SDHI杀菌剂表现出抗性，但对氟吡菌酰胺仍保持敏感。本研究阐明了SdhC遗传分化对亚洲镰刀菌SDHI杀菌剂敏感性的重要调控作用，证实了SDH复合物中特定亚基的变异赋予了亚洲镰刀菌对SDHI杀菌剂的抗性。这些发现增进了对SDHI杀菌剂抗性机制的理解，并为开发FaSdhC特异性抑制剂及抗性管理策略提供了基础。

论文解读：亚洲镰刀菌SdhC亚基遗传分化调控SDHI杀菌剂抗性机制研究

研究背景与意义

由亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）引起的小麦赤霉病（FHB）在中国乃至全球范围内严重威胁谷物生产，不仅导致产量大幅下降，还会产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）为主的真菌毒素，污染粮食并危害人类健康。目前，由于缺乏适合大面积种植的高抗赤霉病小麦品种，化学防治仍是主要的防控手段。然而，长期单一使用苯并咪唑类和甾醇脱甲基抑制剂（DMI）类杀菌剂已导致田间耐药菌株的出现，显著降低了防治效果。琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）作为一类具有独特作用机制的新型杀菌剂，近年来在市场上显示出巨大潜力。SDHI通过抑制真菌线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶（SDH，复合物II）发挥作用，破坏能量代谢从而抑制真菌生长。尽管SDHI对多种病原菌有效，但由于结构差异，目前仅少数品种登记用于防治赤霉病。此外，随着SDHI的广泛应用，病原菌对其产生抗性的风险日益增加。因此，阐明亚洲镰刀菌对SDHI的抗性分子机制，对于监测抗性发展、制定有效的抗性管理策略及优化新药剂配方至关重要。值得注意的是，SDH复合物由SdhA、SdhB、SdhC和SdhD四个核心亚基组成，其中SdhC亚基在许多植物病原真菌中并非由单基因编码，而是表现出功能分化（如SdhC1, SdhC2），这种分化可能意味着其旁系同源物在真菌生物学中具有不同功能，进而影响抗性进化。鉴于此，研究人员系统开展了本研究，相关成果发表在《Molecular Plant Pathology》上。

关键技术方法

研究人员主要通过以下关键技术方法开展研究：首先，利用同源重组策略构建了亚洲镰刀菌中FaSDHC1和FaSDHC2的靶向基因敲除突变体，并利用Southern blot进行验证；其次，以高敏菌株ΔFaSDHC2-9为亲本，通过化学驯化（fungicide taming）筛选并获得了稳定的抗啶酰菌胺突变体；第三，利用测序技术对突变体的靶标基因（SDHB, SDHC1, SDHD）进行克隆与序列分析，鉴定抗性相关基因型；第四，采用定点突变技术构建特定氨基酸替换的突变体以验证抗性机制；第五，利用AlphaFold服务器进行同源建模，结合GROMACS软件包进行分子动力学模拟，分析不同SDH复合物与SDHI杀菌剂的结合稳定性；最后，通过一系列表型测定实验评估菌株的菌丝生长、产孢量、毒力及DON生物合成能力。

研究结果

2.1 亚洲镰刀菌中FaSdhC1和FaSdhC2的鉴定与敲除

研究人员通过BLAST分析和系统发育树构建，在亚洲镰刀菌中鉴定出两个同源的SdhC亚基基因，分别命名为FaSDHC1和FaSDHC2。序列分析显示两者相似性仅为42.11%，且FaSdhC2与其他真菌的同源性较低。通过同源重组成功获得ΔFaSDHC1和ΔFaSDHC2突变体，但未能获得双突变体，表明同时缺失可能致死。

2.2 FaSdhC2参与调控产孢、毒力和DON生物合成

表型分析显示，ΔFaSDHC2突变体的菌丝生长速率与野生型无显著差异，但其产孢能力、小麦苗枯病接种后的致病性（毒力）以及DON毒素产量均显著降低。相反，ΔFaSDHC1突变体仅表现出DON产量的增加，不影响其他致病性状。这表明FaSdhC2在调控产孢、毒力和DON合成中起关键作用，而FaSdhC1主要调节DON生物合成。

2.3 FaSdhC1和FaSdhC2调控对SDHI杀菌剂的敏感性

敏感性测定结果表明，ΔFaSDHC1突变体对啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和联苯吡菌胺的敏感性显著降低（EC₅₀升高），表现为抗性表型；而ΔFaSDHC2突变体对上述三种药剂的敏感性显著增加（EC₅₀降低），表现为高敏表型。这揭示了FaSdhC1和FaSdhC2在调控SDHI敏感性上具有相反的调节作用，FaSdhC1似为负调控因子，FaSdhC2为正调控因子。

2.4 源自ΔFaSDHC2突变体的抗啶酰菌胺突变体的产生与抗性稳定性

利用ΔFaSDHC2-9作为亲本菌株进行驯化筛选，获得了11个稳定的抗啶酰菌胺突变体。经连续传代培养证实，这些突变体的抗性因子（RF）保持稳定，表明其抗性性状可稳定遗传。

2.5 抗性突变基因型的鉴定与分析

对11个抗性突变体的靶标基因测序分析，鉴定出6种突变基因型。其中包括在镰刀菌属中已报道的FaSdhB-H248Y和FaSdhD-E166K，以及在镰刀菌属中首次发现的四种新突变：FaSdhC1-H144Y、FaSdhC1-H144N、FaSdhD-H122Y和FaSdhD-D133N。

2.6 源自ΔFaSDHC2的抗啶酰菌胺突变体的生物适合度

生物适合度评估显示，所有抗性突变体的产孢能力均显著下降。部分突变体（如含FaSdhC1-H144N突变的菌株）还表现出菌丝生长和DON合成的减弱，表明获得抗性可能伴随着一定的适合度代价。

2.7 抗性基因型的 cross-resistance 模式

交叉抗性分析表明，携带FaSdhC1-H144Y/N、FaSdhD-H122Y、FaSdhD-D133N或FaSdhD-E166K基因型的突变体对氟吡菌酰胺、联苯吡菌胺、异丙吡菌胺和苯并烯氟菌唑等多种SDHI杀菌剂均表现出抗性，且对所有测试的QoI类杀菌剂（如吡唑醚菌酯）保持敏感。而携带FaSdhB-H248Y基因型的突变体则对氟吡菌酰胺保持敏感，但对其他SDHI杀菌剂表现出抗性，显示出独特的抗性谱。

2.8 定点突变体生物适合度与杀菌剂敏感性的验证

通过构建定点突变体进一步验证了上述基因型与表型的因果关系。结果与驯化筛选的突变体一致，再次证实了不同突变导致的特异性交叉抗性模式及生物适合度变化。

2.9 FaSdhC1或FaSdhC2缺失对SDH酶活性及SDHI杀菌剂结合稳定性的影响

酶活性测定显示，ΔFaSDHC1突变体的SDH活性增加，而ΔFaSDHC2突变体的SDH活性降低。分子动力学模拟结果表明，含有FaSdhC1的复合物（Complex I）与啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的结合自由能更低，结合更稳定；而含有FaSdhC2的复合物（Complex II）结合稳定性较差。这从物理化学角度解释了为何缺失FaSdhC2会导致菌株对SDHI敏感性增加。

讨论与结论

本研究系统阐明了SdhC亚基分化在调控亚洲镰刀菌对SDHI杀菌剂敏感性中的关键作用。研究发现，亚洲镰刀菌中存在两个功能分化的SdhC亚基（FaSdhC1和FaSdhC2），它们对SDHI敏感性具有相反的调控功能：FaSdhC1的存在降低了基础敏感性（即缺失后敏感性降低），而FaSdhC2的存在增加了基础敏感性（即缺失后敏感性增加）。分子动力学模拟揭示，这种差异源于两种亚基构成的SDH复合物（Complex I vs Complex II）与杀菌剂结合稳定性的不同。研究提出，野生型菌株中FaSdhC2的存在实际上提高了其对SDHI的基础耐受阈值，从而掩盖了其他亚基可能发生的突变。通过在ΔFaSDHC2背景下筛选，研究人员成功突破了这一阈值限制，鉴定出包括四种新突变在内的六种抗性相关基因型。这些突变不仅导致了广泛的抗药性，还伴随着不同的生物适合度代价。该研究不仅加深了对SDHI杀菌剂抗性机制的理解，更重要的是提出了一种创新的病害治理策略：开发针对FaSdhC2亚基的特异性抑制剂，并将其与现有SDHI杀菌剂联合使用。这种组合策略有望通过降低真菌的基础抗性阈值、扩大抗性筛选突变谱以及迫使病原菌通过更高成本的适应途径进化，从而实现协同增效，延缓田间抗性的发展。这为未来新型杀菌剂的研发及赤霉病的可持续治理提供了重要的理论基础。