基于抗体引导冷冻电镜的神经退行性疾病相关铜/锌超氧化物歧化酶结构分析

《Protein Science》：Structural analysis of Cu/Zn-superoxide dismutase linked to neurodegenerative disease by antibody-guided cryo-EM

　　

摘要 错误折叠蛋白的积累是许多神经退行性疾病的标志。为了在体内表征此类错误折叠物种，构象特异性抗体被广泛使用；然而，对抗体-表位相互作用的了解有限常常阻碍了机制性见解的获得。为了解决这个问题，研究人员确定了单克隆抗体19A9与铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）复合物的冷冻电子显微镜结构。SOD1是一种与犬类退化性脊髓病相关的蛋白，该病与人类肌萎缩侧索硬化相关。生化分析证实，19A9特异性识别单聚体SOD1。结构揭示其结合位点位于天然SOD1中通常用于同源二聚化的界面附近，当蛋白质处于其二聚体形式时，空间位阻阻止了相互作用。脊髓切片免疫荧光染色显示，19A9在DM患病犬的一部分运动神经元中着色，但在无症状对照中则不。19A9-单聚体SOD1复合物的结构表征使得研究人员能够提出，在病理条件下SOD1单聚体可以在体内产生。

研究背景与目的

蛋白质错误折叠是许多神经退行性疾病（如阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等）的一个核心特征。理解蛋白质如何在体内错误折叠并采取致病构象，对于阐明疾病机制和指导治疗策略开发至关重要。其中，铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase, SOD1）的突变与家族性肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）及其犬类模型——退化性脊髓病（degenerative myelopathy, DM）密切相关。天然的SOD1以同源二聚体形式存在，每个亚基结合一个铜离子和一个锌离子，并含有一个保守的分子内二硫键。破坏这种天然结构被认为是体内错误折叠过程的基础。

构象特异性抗体是探测体内错误折叠蛋白质的有力工具，因为它们能够选择性识别非天然结构状态。然而，这些抗体识别表位的结构信息通常缺乏明确的定义，这使得将抗体反应性与体内特定的错误折叠构象联系起来变得困难。为了填补这一知识空白，本研究旨在利用结构生物学方法，阐明一种特异性识别SOD1特定构象（单聚体）的单克隆抗体（19A9）与其抗原之间的相互作用机制，从而更精确地理解SOD1在疾病状态下的构象变化。

研究方法概要

本研究发表在《Protein Science》期刊上，采用了一种结合生物化学、结构生物学和免疫组织化学的多学科方法。关键实验技术包括：1）抗体工程与生化表征：对抗体可变区进行测序，并将其工程化为稳定的Fv-clasp（19A9^Fv-c）和具有C3对称性的三价抗体片段（triabody, 19A9^Tri），通过化学交联和尺寸排阻色谱验证其与不同构象SOD1（野生型二聚体、E40K突变体、人工单聚化突变体F50E/G51E (FG)）的结合特异性。2）冷冻电镜结构解析：制备19A9^Tri与单聚体SOD1^FG的复合物，利用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）在2.95 ?分辨率下解析了复合物的三维结构。3）免疫组织化学分析：使用犬类脊髓组织样本（来自3只患有DM的彭布罗克威尔士柯基犬（SOD1^E40K纯合子）和3只无症状的比格犬（野生型纯合子）），通过免疫荧光共染色（19A9与多克隆抗SOD1抗体）检测病理组织中单聚体SOD1的存在。

研究结果

2.1 针对突变SOD1产生的单克隆抗体的分离及其对单聚体形式的选择性识别

研究人员之前利用致病性E40K突变型SOD1（SOD1^E40K）作为抗原生成了单克隆抗体，并从中选择了克隆19A9进行深入研究。通过化学交联实验发现，19A9的Fv-clasp片段（19A9^Fv-c）能够与处于脱金属（apo）和/或二硫键还原状态的SOD1^WT或SOD1^E40K交联，但不能与处于全金属结合（holo）状态的二聚体交联。相反，对于人工引入F50E/G51E突变以破坏二聚界面、强制形成单聚体的SOD1^FG，无论其金属结合状态如何，19A9^Fv-c都能与之高效交联。尺寸排阻色谱进一步证实，19A9^Fv-c和完整的19A9 IgG均能特异性与单聚体SOD1^FG形成复合物，而与二聚体SOD1^WT无相互作用。

2.2 19A9-单聚体SOD1复合物的结构分析

为了阐明19A9特异性识别单聚体SOD1的结构基础，研究人员将19A9改造为三价抗体形式（19A9^Tri）以利用C3对称性辅助冷冻电镜重构。他们成功解析了19A9^Tri与SOD1^FG复合物的两种构象（A型和B型），其中A型分辨率更高（2.95 ?）。结构显示，三个19A9^Tri分子组装成三角形支架，每个V_H-V_L单元结合一个SOD1^FG分子。A型和B型之间的主要差异在于单个19A9^Tri分子内部V_H与V_L的相对取向，但SOD1^FG与其结合的V_H结构域之间的局部排列是保守的。FG-19A9^Tri复合物的冷冻电镜二维分类代表性图像及三维重建的密度图，清晰显示了三角形抗体支架与结合的SOD1。">

2.3 19A9对单聚体SOD1的特异性识别

结构分析表明，19A9主要通过其重链可变区（V_H）的三个互补决定区（CDR）与SOD1单聚体结合，轻链可变区（V_L）贡献甚微。相互作用的界面涉及多个氢键，其中V_H的Arg104和Tyr105对结合至关重要，将其突变为丙氨酸会完全破坏复合物形成。结构叠加显示，19A9的结合位点位于天然SOD1二聚体界面附近，其V_H结构域会与二聚体中假设的另一个亚基发生空间碰撞，这从分子层面解释了19A9为何选择性结合单聚体而不结合二聚体。H结构域与SOD1^FG之间的相互作用界面，并通过结构叠加直观解释了19A9对单聚体的特异性源于空间位阻。">

2.4 19A9所识别的单聚体SOD1的结构特征

在复合物中，SOD1^FG的整体结构与天然二聚体中的一个亚基高度相似。然而，冷冻电镜密度图显示，距离19A9结合界面较远的区域（如Loop I, Loop III, Loop IV, Loop VII等）密度较弱或缺失，表明这些区域存在较高的结构波动性。这表明19A9所识别的是一种保留了亚基样三维架构但部分区域灵活性增强的单聚体SOD1构象，而非完全展开的线性形式。FG在复合物中结合界面相对稳定、而对侧区域结构柔性较高的不对称特征。">

2.5 DM患病犬脊髓运动神经元中的单聚体SOD1

基于19A9特异性识别单聚体SOD1的结构验证，研究人员对DM患病犬和对照犬的脊髓切片进行了免疫荧光染色。结果显示，多克隆抗SOD1抗体在所有犬的运动神经元中均有强烈信号。相比之下，19A9的信号非常微弱，但通过对图像进行阈值处理后可以辨别，在DM患病犬的一部分（并非全部）运动神经元中观察到了19A9的特异性染色，而在对照犬的运动神经元中则未检测到任何19A9信号。这提示，单聚体SOD1物种以微量水平存在于DM患病犬的部分运动神经元中，但在健康对照中低于检测水平。

讨论与结论

在讨论部分，研究人员将本研究置于更广阔的背景下。他们指出，虽然单聚化被认为有助于SOD1的错误折叠和聚集，但本研究数据尚不能确定19A9所识别的物种是代表这一通路上的中间体还是直接导致神经毒性。然而，免疫组化数据表明，这种折叠的单聚体SOD1与疾病状态相关。E40K突变本身并未显著增强SOD1与19A9的交联，提示其可能通过局部扰动二聚体界面（如促进Cys7的溶剂暴露）来增加单聚化倾向。SOD1的单体-二聚体平衡受金属结合和硫醇-二硫键状态强烈影响，一些ALS相关突变被证明会选择性地 destabilize 单聚体状态或增强二聚体解离。单聚体SOD1可能通过暴露并氧化其界面附近的半胱氨酸残基，破坏蛋白质的疏水核心，从而连接天然二聚体与错误折叠/聚集状态。

研究人员也回顾了其他用于检测非天然SOD1构象的抗体（如SEDI抗体），指出其表位定义不清的局限性。相比之下，本研究通过对19A9-SOD1复合物的高分辨率结构解析，将抗体的功能特异性转化为具体的结构信息。这彰显了结构指导的表位表征在转化构象选择性抗体为可靠工具方面的价值。

研究结论：本研究生成了特异性识别单聚体SOD1的单克隆抗体19A9，并通过冷冻电镜解析了其与单聚体SOD1的复合物结构，揭示了其通过空间位阻机制实现单体特异性的分子基础。免疫荧光染色在退化性脊髓病患病犬的部分脊髓运动神经元中检测到了单聚体SOD1，而在健康对照中未检测到。这些发现表明，在病理条件下，SOD1单聚体可以在体内产生。更广泛地说，这项工作展示了一种用于定义神经退行性疾病中错误折叠蛋白结构基础的多功能方法。