霍乱弧菌IV型菌毛异质六聚体ATP酶PilU的结构状态分析

《Protein Science》：Analysis of the heterogenous structural states of the hexameric ATPase PilU of the type IV pili from Vibrio cholerae

　　

摘要 IV型菌毛（T4P）通过延伸和收缩循环介导表面运动、宿主相互作用及DNA摄取。虽然主要的收缩ATP酶PilT已被广泛表征，但其同源蛋白PilU尽管被证实为依赖PilT的收缩ATP酶，但仍缺乏深入理解。在此，研究人员通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）和X射线晶体学技术解析了六种PilU结构。这些结构揭示了一种同源六聚体组装体，其通过亚基C端催化结构域与相邻亚基N端PAS样结构域之间的相互作用得以稳定。即使在无核苷酸结合的情况下，PilU也呈现出多种构象状态，表现出开放和闭合界面的不同组合。与PilT的比较突出了可能导致PilU ATP酶活性较弱及其功能依赖于PilT的结构特征。总之，这些发现为理解PilU在T4P收缩机制中的作用提供了结构框架。

研究背景与立项依据

IV型菌毛（Type IV pili, T4P）是存在于许多细菌和古菌表面的动态丝状附属物，在细菌黏附、运动、生物膜形成、DNA转化及宿主相互作用中发挥关键作用。T4P由保守的分泌系统组装成螺旋状纤维，并由专用的胞质ATP酶驱动其快速组装与延伸。在霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等致病物种中，一类称为IVa型菌毛（T4aP）的亚类能够进行反向组装以实现收缩，这一过程对于宿主定植、免疫逃逸、表面黏附及DNA摄取至关重要。在T4aP的收缩过程中，PilT作为主要的收缩ATP酶，能够驱动菌毛旋转以移除菌毛底部的菌毛素亚基。然而，在许多T4P的基因操纵子中，除了PilT外，还编码第三种ATP酶——PilU。尽管生化与遗传学证据表明PilU是一种依赖PilT的收缩ATP酶，能够促进菌毛收缩，但其具体的分子机制尚不明确，且此前仅有来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的一种低分辨率晶体结构可供参考。因此，为了阐明PilU的架构、核苷酸状态及其与PilT和T4aP系统的潜在机制关系，研究人员决定对霍乱弧菌El Tor E7946株的PilU进行深入的冷冻电镜和X射线晶体学研究。

研究方法概述

研究人员从霍乱弧菌El Tor E7946株克隆了PilU基因（残基2–368），并在大肠杆菌BL21(DE3)-Magic细胞中表达纯化获得重组蛋白。针对冷冻电镜研究，研究人员制备了apo状态以及分别添加ATP和ADP的PilU样品，并利用Titan Krios G1显微镜和K3 Summit探测器采集数据，通过CryoSPARC软件进行颗粒挑选、二维分类、三维分类及重构，最终解析了四种不同的PilU构象（Forms 1–4）。同时，研究人员还通过X射线晶体学手段，在硫酸铵和硝酸钠等结晶条件下获得了两种晶体形式（Forms 5–6），并利用LS-CAT光源收集衍射数据，通过分子置换法完成了结构解析。此外，研究还结合了AlphaFold2建模、多序列比对、表面静电分析以及PRODIGY服务器计算结合能等方法辅助结构分析与功能预测。

研究结果

3.1 PilU六聚体呈现多种构象

研究人员成功解析了霍乱弧菌PilU的四种冷冻电镜结构和两种X射线晶体结构，所有结构均形成具有不同构象的同源六聚体环（Forms 1–6）。这些结构分别采用了C1、C2和C3对称性。每个PilU亚基均包含经典的PAS样N端结构域（NTD）和催化C端结构域（CTD），且各形式间的亚基构象差异较小（Cα RMSD 0.3–3.5 ?），构象变化主要由连接子介导的两个结构域的相对位置变化引起。与近缘同源蛋白PilT相比，尽管整体折叠相似，但在研究人员测试的apo、ATP及ADP状态下，均未在活性位点观察到核苷酸或Mg²⁺密度，这与PilT结构中常能观察到核苷酸结合的情况形成鲜明对比。

3.2 开放与闭合界面由相邻亚基间显著的域旋转产生

通过分析相邻亚基间关键残基（T218_N–H227_N+1和 T218_N–L266_N+1）的Cα距离，研究人员将PilU亚基间的界面状态划分为开放（O）、中间（X）和闭合（C）三种类型。研究发现，PilU的最闭合状态出现在Form 6的链C与D之间，而最开放状态出现在Form 3的链B与C之间。从闭合到开放状态的转变需要CTD_N旋转37°并平移19.5 ?。与PilT和PilB相比，PilU的构象变化幅度较为温和，且其最开放和最闭合状态分布在不同的结构中，而非像PilT那样在同一结构中同时存在极端构象。接触分析表明，闭合状态主要由CTD_N与NTD_N+1、CTD_N与CTD_N+1以及NTD_N与NTD_N+1之间的氢键、盐桥和疏水作用维持。

3.3 基于结构相似性提出的六聚体环状运动轨迹

通过计算六种PilU构象两两之间的最小Cα RMSD，研究人员构建了连接所有观测状态的假定轨迹。结果显示Form 1和Form 5与其他结构的差异最大（RMSD ~5.5–9 ?），而Form 2、3、4和6之间则更为相似（RMSD 1.6–4 ?）。最短的路径顺序被确定为Form 1 → 4 → 3 → 2 → 6 → 5，总路径长度RMSD和为21.6 ?。值得注意的是，Form 5虽然在晶体结构中呈现，但由于其所有界面均为中间态（X）且表现出接近C6对称性的特征，可能是一种仅在晶格接触或结晶条件下稳定的特殊构象。

讨论与结论

本研究揭示了PilU与PilT在结构上的高度相似性，两者均表现出显著的构象异质性。然而，与PilT不同的是，本研究中所有PilU结构均处于apo状态，未能捕获到核苷酸结合构象，这与其体外表现出微弱ATP酶活性相一致。研究人员推测，PilU本身缺乏有效催化ATP水解所需的开放和闭合界面的最佳排列，因此需要与PilT的直接相互作用来获得适当的构象状态。AlphaFold模型进一步预测了PilU的CTD与两个相邻PilT亚基的NTD相互作用，这种相互作用将限制PilU的运动自由度，使其运动与PilT同步，从而实现由两个ATP酶共同驱动或仅在PilT失活时由PilU单独驱动的高效菌毛收缩。这项研究为理解PilU在T4P收缩机制中的辅助作用提供了重要的结构框架。