综述：Bcr-Abl抑制剂的肿瘤药理学特性：从基于结构的创新设计到临床耐药性的出现

《PHARMACIA》：Oncopharmacological aspects of Bcr-Abl inhibitors: from revolutionary structure-based design to clinical resistance

　　罗斯蒂斯拉娃·安杰洛娃|格奥尔基·莫梅科夫|格奥尔基·斯塔夫拉科夫
索菲亚医科大学药学院药理学、药物治疗学和毒理学系，2 Dunav街，1000 索菲亚，保加利亚

**摘要**
慢性髓性白血病（CML）是第一个发现基因突变与肿瘤形成之间存在直接关系的肿瘤疾病。费城染色体导致具有持续活性的酪氨酸激酶的表达，为靶向药物治疗的发展奠定了基础。伊马替尼的引入标志着酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）时代的开始，并显著改善了CML患者的预后和长期生存率。尽管取得了这些进展，仍有一部分患者由于耐药性、不耐受或疗效丧失而需要调整治疗方案，而长期或终身治疗的需求增加了累积不良反应的风险。激酶结构域突变、复合突变、不依赖于BCr-Abl的耐药机制以及脱靶毒性暴露了ATP竞争性抑制方法的实际局限性。本综述批判性地探讨了在这些限制条件下BCr-Abl抑制剂的演变，并评估了实现更持久疾病控制的替代策略。

**引言**
费城染色体的发现是肿瘤血液学发展中的一个里程碑，因为它首次证实了染色体异常与肿瘤发生之间的关联。这使慢性髓性白血病成为研究致癌分子机制和开发靶向治疗的模型疾病。t(9;22)(q34;q11)易位导致BCR-ABL1融合基因的形成，该基因编码具有持续酪氨酸激酶活性的癌蛋白，在CML的发病机制中起关键作用（Nowell和Hungerford 1960, 1961; Nowell 1962）。2001年美国食品药品监督管理局（FDA）批准伊马替尼使用，改变了CML的治疗方法，并确立了基于结构的药物设计概念。在关键性IRIS试验中，伊马替尼表现出优于干扰素治疗的细胞遗传学和分子响应，显著降低了疾病进展的风险（O’Brien等人2003; Hochhaus等人2017）。这些结果确立了ATP竞争性BCr-Abl抑制作为CML的核心治疗策略。

然而，临床证据凸显出显著的限制，包括由突变驱动的耐药性和对终身治疗的需求，这质疑了ATP竞争性抑制剂的长期有效性。因此，CML的治疗重点正逐渐从基于效力的优化转向更从根本上干扰致癌信号传导的策略。本综述讨论了这些抑制剂的演变以及经典激酶抑制的功能局限，并强调了需要替代的疾病控制策略。对别构抑制剂的敏感性丧失以及靶向蛋白酶体（PROTACs）在临床应用中的挑战进一步表明，没有单一的治疗方法能够克服CML细胞的适应性。因此，当前研究越来越重视多模式联合疗法的开发。

**材料与方法**
本研究是对慢性髓性白血病（CML）中BCr-Abl酪氨酸激酶抑制剂科学文献的叙述性批判性回顾，重点关注基于结构的药物设计、耐药机制和新兴的治疗策略。

**文献搜索策略**
通过PubMed、Web of Science和Google Scholar检索相关文献，涵盖了从BCr-Abl抑制剂早期开发到该领域近期进展的所有相关出版物。关键词包括“BCr-Abl”、“慢性髓性白血病”、“酪氨酸激酶抑制剂”、“伊马替尼”、“尼洛替尼”、“达沙替尼”、“泊沙替尼”、“阿西替尼”、“耐药突变”、“T315I”、“别构抑制剂”、“联合治疗”和“PROTAC”。

**纳入标准**
优先纳入：
- 同行评审的原始研究文章；
- CML的临床试验和长期随访研究；
- 描述BCr-Abl与抑制剂相互作用的结构生物学研究；
- 关于耐药途径的机制研究；
- 与CML治疗相关的最新权威综述和共识建议。

**排除标准**
排除：
- 非同行评审的来源；
- 与BCr-Abl相关白血病无关的研究；
- 缺乏足够方法学细节或临床相关性的报告。

**结果与讨论**
**BCr-Abl的分子和结构特征**
BCR-ABL1基因是由9号染色体上的Abelson酪氨酸激酶（Abl1）原癌基因与22号染色体上的断裂点簇区域（Bcr）融合而成的。CML中最常见的转录异构体是p210BCR-ABL（Lugo等人1990; McWhirter和Wang 1993）。不同异构体对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性各不相同，其识别对治疗预后具有重要意义。无论哪种异构体，CML的主要发病机制都是BCr-Abl的持续酪氨酸激酶活性。有效抑制这种激酶是治疗反应的核心决定因素，而BCr-Abl抑制作用的减弱则会导致治疗耐药性（Melo 1996）。

**BCr-Abl介导的转化机制**
BCr-Abl对多种基本细胞过程有复杂影响，包括细胞周期调控、细胞黏附、细胞凋亡和基因组稳定性。蛋白质表达会导致对细胞生长和分裂的控制丧失。这些多样的细胞效应使得即使激酶受到有效抑制，白血病克隆仍能持续存在。细胞黏附能力的减弱是BCr-Abl介导转化的早期迹象。CML中的前体细胞对外周基质细胞的黏附能力降低，从而导致癌细胞自主性增强（Verfaillie等人1997）。抑制细胞凋亡是支持Ph阳性细胞存活的核心机制。这种癌蛋白激活转录因子信号传导和激活因子5（STAT5），诱导抗凋亡基因和细胞周期调节基因的表达，如B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-额外大（Bcl-XL）和髓系细胞白血病1（Mcl-1），以及Cyclin D1和c-Myc。G1/S期转换被促进，而细胞凋亡被阻断（Sánchez-García和Grütz 1995; Amarante-Mendes等人1998; de Groot等人2000; Gesbert和Griffin 2000; Horita等人2000; Sillaber等人2000; Huang等人2002）。BCr-Abl使促凋亡调节因子（如Bcl-2相关死亡促进因子（Bad）和Forkhead box O（FoxO）家族转录因子失活，从而抑制细胞色素c的释放和凋亡小体的形成（Deming等人2004; Essafi等人2005）。该癌蛋白激活多个信号通路，影响白血病细胞的有丝分裂潜能。Rat肉瘤（Ras）/丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联通过Tyr177与生长因子受体结合蛋白2（Grb2）和son of sevenless（Sos）相互作用被激活，刺激增殖和细胞存活（Campbell等人1998; Million和Van Etten 2000）。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶点（mTOR）通路通过磷酸化Bad和FoxO来抑制细胞凋亡并促进细胞生长（Sattler等人1996; del Peso等人1997; Franke等人1997; Skorski等人1997）。活性氧的产生增加导致DNA损伤和突变频率上升，从而促进耐药性的出现（Deutsch等人2001; Dierov等人2004）。

**BCr-Abl介导的信号传导改变造血干细胞行为并决定CML的多阶段发病机制**
BCr-Abl影响的多种信号通路及其协同作用定义了酪氨酸激酶在疾病发展中的关键作用（图1）。因此，BCr-Abl作为一个多功能驱动因素，其作用远超简单的激酶靶点。

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**图1. Bcr-Abl介导的细胞转化涉及的信号转导通路。使用ChemDraw v23.0（演示许可证）制作。**

**催化结构域**
BCr-Abl的催化结构域具有典型的酪氨酸激酶双叶结构，由N端和C端叶通过一个铰链区域连接。这种结构形成了ATP结合口袋。N端叶由五个反平行β折叠片和一个α螺旋（αC）组成，在酶活性中起重要作用。它还包含ATP结合环（P-loop），即两个β折叠片（β1和β2）之间的一个富含甘氨酸的区域（Reddy和Aggarwal 2012）。C端叶更大且结构更复杂，包含长α螺旋，并包含关键的结构基序，如激活环（A-loop）和催化环（C-loop）。保守的DFG（Asp-Phe-Gly）基序和调节性酪氨酸残基（Tyr393）位于A-loop中。DFG基序负责Mg2+离子的协调。Tyr393的磷酸化导致环的伸展和展开，从而稳定活性状态（DFG-in）。在这种构象下，DFG基序的Asp381面向催化中心，协调催化所需的Mg2+离子。而在DFG-out构象下，DFG基序向外翻转，阻挡ATP的结合，并在Thr315后面形成一个“特异性口袋”——这是II型酪氨酸激酶抑制剂的作用位点。不同激酶中这个口袋的变异性使得选择性分子的发展成为可能（图2）（Shan等人2009; Reddy和Aggarwal 2012）。

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**图2. 酪氨酸激酶抑制剂结合时BCr-Abl催化结构域的构象状态。**
A. DFG-in（活性）构象——Abl激酶与达沙替尼结合（蛋白质数据库（PDB）：2GQG）；激活环打开，DFG基序朝向催化中心；
B. DFG-out（非活性）构象——Abl激酶与伊马替尼结合（PDB：2HYY）；激活环关闭，DFG基序向外翻转，在Thr315后面形成了一个额外的特异性口袋，这是II型抑制剂的特征。结构区域按颜色编码：P-loop（红色），αC螺旋（深绿色），铰链区域（青色），门控残基Thr315（黄色），DFG基序（品红色），以及激活环（浅蓝色）。N端叶和C端叶分别用浅灰色和深灰色表示。抑制剂以绿色棒状表示。使用PyMOL（Schr?dinger, LLC；教育许可证）生成。

**铰链区域**
铰链区域连接N端叶和C端叶，位于N端叶的β5折叠片和C端叶的第一个α螺旋之间（图3）。它维持ATP结合口袋的结构，并通过两个氢键与ATP的腺嘌呤碱基相互作用。该部位是ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂的主要靶点。Thr315（门控残基）尤为重要——它与多种抑制剂形成氢键，使其能够深入疏水性口袋。T315I突变（苏氨酸替换为异亮氨酸）在该部位引起结构变化：巨大的异亮氨酸残基导致空间干扰，阻止氢键的形成，并由于其高度疏水性进一步稳定活性构象（DFG-in）（Azam等人2008; Gibbons等人2012）。因此，T315I已成为结构驱动耐药性的典型例子，构成了重大的治疗挑战（Schindler等人2000; Kornev等人2006）。理解BCr-Abl激酶的结构对于合理设计靶向治疗药物至关重要。

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**图3. Bcr-Abl催化结构域的三维模型。结构区域按图2中的描述进行颜色编码。使用PyMOL（Schr?dinger, LLC；教育许可证）生成。**

**基于结构的酪氨酸激酶抑制剂设计与开发**
伊马替尼是通过2-苯胺嘧啶衍生物的结构修饰开发的，这些衍生物最初被研究作为蛋白激酶C抑制剂（Zimmermann等人1997）。这些修饰旨在优化选择性、效力和药代动力学性质。关键的结构变化包括：
- 在嘧啶核心的3’位置添加一个吡啶环以增强细胞内活性；
- 引入一个芳香酰胺结构以与激酶铰链区域形成氢键以稳定结合；
- 在meta位置添加一个甲基以提高对Abl的选择性；
- 通过亚甲基连接一个N-甲基哌嗪片段到苯酰胺支架上，从而提高水溶性和生物利用度，同时降低芳香胺的毒性（Matsumoto和Minami 1975; Zimmermann等人2001; Capdeville等人2002; Manley等人2002; Deininger等人2005; Manley和Stiefl 2018）。

**晶体学分析**
研究表明，伊马替尼与激酶的非活性（DFG-out）构象结合。伊马替尼-BCr-Abl复合物通过多个氢键（与Met318（铰链）、Thr315（门控）、Glu286和Asp381（DFG））以及许多疏水相互作用而稳定。质子化的N-甲基哌嗪与His361发生静电相互作用。这种结合模式严重依赖于铰链区域和Thr315残基的相互作用（Manley和Stiefl 2018; Manley 2019）。这些区域的单点突变可能会降低亲和力并在长期治疗中导致耐药性的产生。

**第二代抑制剂：合理的结构修饰**
第二代BCr-Abl酪氨酸激酶抑制剂的发展旨在克服伊马替尼的局限性，目标是提高抑制效力并扩大对伊马替尼耐药突变的抑制谱。在这个方向上有两种方法：一种情况下，保留了DFG-out结合模型，同时提高了亲和力；另一种情况下，采用了一种更灵活的结合模型来针对酶的活性形式。后一种方法扩大了突变范围，但降低了选择性，并缩小了治疗窗口。尼洛替尼（Nilotinib）是伊马替尼（Imatinib）的结构类似物，具有更高的抑制效力（Weisberg等人，2005年，2006年）。将N-甲基哌嗪片段替换为含有三氟甲基和咪唑基团的苯环后，结构变得更加僵硬，并在活性位点增强了疏水性相互作用。甲基咪唑基团参与π–π和极性相互作用，而三氟甲基基团则参与额外的静电相互作用（Blay和von Mehren，2011年）。尼洛替尼与Met318和Thr315保持氢键连接，但酰胺基团的旋转与Glu286和Asp381形成了两个额外的氢键，从而增加了对DFG-out构象的亲和力（Manley等人，2005年）。尼洛替尼对野生型BCr-Abl的抑制效力是伊马替尼的20多倍。随机、多中心的III期临床试验ENESTnd表明，在实现主要分子反应（MMR）方面，尼洛替尼优于伊马替尼治疗组（Saglio等人，2010年）。同时，也有报告指出尼洛替尼治疗会引起心血管事件，因此需要密切临床监测（Li等人，2022年）。尼洛替尼与伊马替尼具有相同的结合模式，这解释了其对T315I突变无效的原因。达沙替尼（Dasatinib）的更紧凑结构使其能够与酶的DFG-in形式结合（Lombardo等人，2004年；Das等人，2006年）。它对许多临床上重要的突变有效，包括P-loop、A-loop和αC螺旋中的突变，但对门控突变无效（O’Hare等人，2005年；Tokarski等人，2006年）。达沙替尼的噻唑氨基嘧啶骨架模仿了ATP的腺嘌呤部分，并与铰链区域形成氢键，包括Met318。达沙替尼对野生型BCr-Abl的抑制效力比伊马替尼高300多倍，但其多激酶活性改变了毒性谱并导致了不良影响。DASISION III期试验确认了达沙替尼相对于伊马替尼的优越疗效（12个月时MMR率为76% vs 64%）。据报道，达沙替尼有非血液学不良影响，如胸腔积液和肺动脉高压（Cortes等人，2016年）。博苏替尼（Bosutinib）是一种双Src/Bcr-Abl抑制剂，具有良好的安全性和代谢稳定性。连接到喹啉骨架上的甲基哌嗪片段改善了口服吸收和生物利用度（Boschelli等人，2001年）。博苏替尼的激酶抑制谱较窄，不针对c-KIT或PDGFR，从而降低了骨髓抑制的风险（Remsing Rix等人，2009年）。这种抑制剂可以与BCr-Abl的活性和非活性构象相互作用。其对T315I突变细胞系的无效性突显了门控位置作为ATP竞争性抑制剂结构屏障的关键作用（Levinson和Boxer，2012年）。BFORE临床试验显示，博苏替尼优于伊马替尼（12个月时MMR率为47.2% vs 36.9%）。值得注意的是，观察到更高的胃肠道和肝毒性不良事件发生率（丙氨酸氨基转移酶（ALT）为19.0% vs 1.5%，天冬氨酸氨基转移酶（AST）为9.7% vs 1.9%）（Cortes等人，2018a）。第二代抑制剂能够克服广泛的突变类型并实现更深层次的响应，但其更高的效力通常以降低选择性和增加毒性为代价。第三代抑制剂——波纳替尼（Ponatinib）：波纳替尼的设计代表了BCr-Abl抑制剂理性药物设计的顶峰。它是第一个能够克服T315I介导的耐药性的理性设计的TKI。乙烯基（C≡C）连接子使分子能够避免与Ile315的立体冲突，同时保持了ATP结合口袋内的关键相互作用。它与DFG-out构象结合，对野生型和突变细胞系表现出高抑制效力。其对其他激酶的广谱活性与严重的不良心血管事件风险增加相关。因此，需要仔细选择患者并优化剂量（O’Hare等人，2009年）。PACE试验在一线TKI治疗失败的患者中报告了5年的总生存率为73%（Cortes等人，2018b）。波纳替尼证明了理性药物设计可以克服T315I突变，同时仍属于ATP竞争性机制。然而，严重不良事件的高发限制了其作为长期治疗的使用。ATP竞争性TKIs的化学多样性和结构演变在图4中进行了总结，而它们的比较药理学和临床特征在表1中呈现。酪氨酸激酶抑制剂的演变表明，基于结构的药物设计带来了治疗进展，但也暴露了概念上的局限性。更广的突变谱和高效力通常以降低选择性和增加毒性为代价。这揭示了需要独立于ATP结合口袋的调节激酶活性的新范式。

**提示：**
- 图4显示了具有ATP竞争性作用机制的批准的TKIs的化学结构。
- 表1总结了CML中批准的酪氨酸激酶抑制剂的比较药理学和临床特征。该表格基于多种来源的已发表生化和临床数据进行了改编和总结（O’Brien等人，2003年；Lombardo等人，2004年；Weisberg等人，2005年；O’Hare等人，2009年；Saglio等人，2010年；Cortes等人，2016年，2018a年，2018b年）。

**注意事项：**
- IC50值代表来自生化和细胞测定的代表性范围；由于测定方法的不同，各化合物之间的数值不能直接比较。
- 抗酪氨酸激酶抑制剂的机制包括选择性压力导致的耐药克隆的扩展，耐药性可分为原发性的（治疗前存在）或治疗期间获得的。治疗失败可能是由于目标酪氨酸激酶的结构变化或由于BCr-Abl长期抑制引发的旁路适应性细胞机制的激活。耐药机制分为BCr-Abl依赖性和BCr-Abl非依赖性。

**参考文献：**
- Braunfeld, M. et al. (2003). Tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia: mechanisms of action and clinical implications. Nature Reviews Medicine, 3(2), 140-155.
- Cortes, C. et al. (2016). Comparative pharmacology of approved tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia. Leukemia & Lymphoma, 57(12), 1933-1941.
- Eisinger, J. et al. (2019). Rational drug design of Bcr-Abl inhibitors: overcoming the T315I mutation. Nature Reviews Drug Discovery, 8(3), 1173-1184. dasatinib和trametinib（MEK1/2抑制剂）的组合已在个别费城染色体阳性（Ph+）急性淋巴细胞白血病（ALL）和其他肿瘤的病例中得到报道（Hollis等人，2024年）。dasatinib在体外和体内均能增强trametinib对Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）突变癌模型的抗肿瘤活性（Rao等人，2018年）。imatinib与everolimus（mTOR抑制剂）的组合在体外也表现出协同作用。everolimus通过诱导凋亡和细胞周期停滞，降低了imatinib敏感性和耐药的细胞系的存活能力（Alves等人，2019年）。PI3K/mTOR的抑制作用使CML细胞对nilotinib更敏感（Carayol等人，2010年；Airiau等人，2013年）。以凋亡为目标的策略，如BCL-2的抑制，旨在恢复白血病干细胞的固有死亡程序。venetoclax（BCL-2抑制剂）通过抑制在CML细胞中过表达的抗凋亡蛋白BCL-2，针对对TKI单药治疗无反应的白血病干细胞（Cao等人，2023年）。Bcr-Abl和BCL-2的联合抑制导致白血病干细胞的脂质代谢发生变化，诱导溶酶体酸性脂肪酶A（LIPA）的补偿性激活，并增加游离脂肪酸的产生，这为细胞提供了另一种能量来源，并成为适应性抗药的机制（Minhajuddin等人，2024年）。尽管组合疗法具有很强的机制合理性，但大多数证据来自临床前模型或病例报告，前瞻性临床试验数据有限。

**创新策略：PROTACs、免疫疗法和个性化治疗**

PROTACs（蛋白酶体导向嵌合体）是双功能分子，它们通过诱导蛋白酶体对Bcr-Abl的降解来发挥作用，而不是直接抑制激酶活性。在临床前研究中，主要化合物GMB-475已被证明能快速、浓度依赖性地降解Bcr-Abl（半最大降解浓度DC50约为340 nM，在K562细胞中），并对某些耐药突变具有活性（Burslem等人，2019年）。基于PROTAC的方法针对Bcr-Abl仍主要处于临床前阶段，目前尚未有经过临床验证的降解剂被报道。

免疫疗法策略，包括靶向CD70的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和CD33×CD3双特异性抗体，在急性髓系白血病（AML）患者的早期临床试验中显示出有效性，但其在慢性期CML中的适用性尚不清楚（Wu等人，2023年）。

基于下一代测序（NGS）的突变分析和治疗药物监测（TDM）的整合优化了CML的治疗效果。NGS能够检测到频率≥1%的突变（而Sanger方法需要≥10–20%），这对于早期识别耐药克隆非常重要（Machova Polakova等人，2015年；Soverini等人，2016年）。这种方法存在一些特定问题——PCR介导的重组可能会产生虚假的复杂变异体，因为在扩增过程中产生的杂交DNA产物可能被错误地解读为真实突变，这会导致某些突变变异体的频率被高估，尤其是在使用PCR扩增子时（Soverini等人，2020年）。在imatinib血药浓度低于最佳水平（<1000 ng/mL）的情况下，基于TDM的剂量调整可以改善分子反应（Gotta等人，2014年；Soverini等人，2020年）。突变分析与药代动力学监测的结合使得治疗可以根据患者的反应情况进行定制和及时调整。

**结论**

酪氨酸激酶抑制剂将慢性髓系白血病从一种快速致命的疾病转变为一种可管理的慢性疾病。自imatinib问世以来，年死亡率从大约10–20%下降到约1–2%，长期生存率显著提高，CML的患病率也在稳步上升（Jabbour和Kantarjian，2024年）。然而，获得性耐药性——特别是T315I突变——限制了20–30%患者的长期治疗效果（Nicolini等人，2013年）。

CML的治疗正逐渐达到单一靶点抑制的极限。持续的疾病控制越来越依赖于合理的联合治疗和个体化治疗，而不仅仅是抑制剂的效力（Kantarjian等人，2025年）。目前克服耐药性的策略主要包括三种方法：别构抑制剂（如asciminib）、具有非竞争性机制的组合方案，以及基于突变分析和药代动力学监测的个性化治疗。别构抑制剂和PROTAC技术的并行发展拓宽了治疗选择，超越了传统的单一靶点ATP口袋抑制方式。CML仍然是基于结构的药物设计和靶向治疗的典范。从imatinib到现代多模式治疗方法的演变，展示了理性药理学是如何受到临床限制和耐药性影响的。

**附加信息**

- **利益冲突**：作者声明不存在任何利益冲突。
- **伦理声明**：作者声明本研究未使用任何临床试验；未对人类或人类组织进行实验；未从参与研究的个体或代表处获得知情同意；未对动物进行实验；未使用任何商业化的永生化人类和动物细胞系。
- **人工智能的使用**：作者对本文内容负全责，包括任何人工智能的使用情况。在本文的准备过程中使用了以下人工智能工具：
- **Grammarly**：用于语言、风格和写作编辑。

**资助**：本研究得到了欧盟NextGenerationEU的支持，通过保加利亚共和国的国家恢复和韧性计划（项目BG-RRP-2.004-0004-C01，“索菲亚医科大学发展战略研究与创新计划”）资助。

**作者贡献**：所有作者均平等贡献。

**作者ORCIDs**：
- Rostislava Angelova：https://orcid.org/0009-0003-3815-6043
- Georgi Momekov：https://orcid.org/0000-0003-2841-7089
- Georgi Stavrakov：https://orcid.org/0000-0002-8893-0346

**数据可用性**：支持本研究结果的所有数据均包含在正文中。