急性升高花生四烯乙醇胺（AEA）与2-花生四烯酸甘油（2-AG）水平在注意缺陷/多动障碍动物模型中性别和品系依赖性地调节防御行为

《Pharmacology Biochemistry and Behavior》：Acute elevation of anandamide and 2-AG levels modulates defensive behavior in a sex- and strain-dependent manner in an animal model of attention-deficit/hyperactivity disorder

　　

摘要 注意缺陷/多动障碍（ADHD）与风险行为倾向升高相关。核心症状与特征（如冲动、多动和冒险行为）源于前额叶-纹状体环路的功能障碍。内源性大麻素系统（ECS）可调节前额叶-纹状体动力学和单胺能信号传导。自发性高血压大鼠（SHRs）和Wistar Kyoto（WKY）大鼠品系对是ADHD的成熟模型。内源性大麻素2-花生四烯酸甘油（2-AG）和花生四烯乙醇胺（AEA）通过精细调节参与威胁检测和反应的神经环路来影响防御行为。本研究探讨了在开放场地和高架十字迷宫任务中，通过抑制降解酶来增强2-AG和AEA水平如何塑造防御行为。研究人员还调查了在执行功能相关脑区（包括前额叶皮质（PFC）、纹状体（STR）和海马（HP））中，大麻素1型受体（CB1R）、大麻素2型受体（CB2R）、脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）和单酰甘油脂肪酶（MAGL）蛋白含量的品系和性别相关差异。MAGL抑制剂增强了WKY大鼠的风险评估行为。当内源性大麻素配体水平升高时，雌性大鼠表现出减少的伸展-趋近姿势（SAP）。具体而言，在SHR品系中，雄性大鼠在使用FAAH抑制剂后头探次数（HD）增加，而雌性大鼠表现出相反的模式。SHR雌性大鼠在给予AEA转运抑制剂后表现出HD增加。基础蛋白含量分析显示，在纹状体中，雌性SHRs的FAAH和MAGL水平高于雌性WKY大鼠，而雄性SHRs的CB2R水平较低。在海马中，雌性SHRs的CB2R含量高于WKYs。与雄性相比，WKY和SHR雌性大鼠的PFC CB1R含量均较低。在SHRs中，与雄性相比，雌性在纹状体和海马中表现出更高的FAAH水平，而在海马中CB2R水平较低。这些发现表明，通过抑制降解途径增加2-AG和AEA，以品系和性别依赖的方式调节防御行为。PFC、STR和HP内蛋白质表达的差异与行为结果一致，为防御行为的品系和性别特异性模式提供了分子层面的见解。

一、研究背景与目的

注意缺陷/多动障碍（ADHD）是一种常见的神经发育障碍，其核心症状包括冲动、多动和注意缺陷，并且与风险行为倾向升高密切相关。这些行为障碍的神经生物学基础被认为是前额叶-纹状体环路的功能障碍，该环路对执行功能（特别是抑制控制）至关重要。内源性大麻素系统（ECS）是神经调质系统的重要组成部分，包含内源性配体[如2-花生四烯酸甘油（2-AG）和花生四烯乙醇胺（AEA）]、其合成与降解酶[如单酰甘油脂肪酶（MAGL）和脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）]以及受体（CB₁R和CB₂R）。ECS可调节前额叶-纹状体通路和单胺能信号，从而影响与威胁应对相关的防御行为。

在临床前研究中，自发性高血压大鼠（SHRs）是研究ADHD神经生物学的常用动物模型，与对照品系Wistar Kyoto（WKY）大鼠相比，SHRs表现出类似ADHD的行为和更高的冒险行为。先前研究表明，直接激活大麻素受体可影响SHRs的多动和冲动行为，且SHRs在青春期时ECS相关基因的mRNA表达升高。然而，通过抑制降解途径来提升内源性大麻素（2-AG和AEA）水平，如何影响ADHD模型中的防御行为，尤其是在性别和品系间的差异，尚不清楚。此外，ECS蛋白表达在ADHD相关脑区（如前额叶皮质、纹状体、海马）是否存在性别和品系特异性差异，也缺乏系统研究。

因此，本研究旨在探究急性提升2-AG和AEA水平，是否会在ADHD动物模型中，以性别和品系依赖的方式，调节基于趋近-回避冲突范式的防御行为，并检测相关脑区中ECS关键蛋白的表达差异，以期为ADHD的性别特异性病理机制及ECS的调控作用提供新的见解。此项研究发表于《Pharmacology Biochemistry and Behavior》期刊。

二、主要研究方法概述

研究使用青春期（出生后约50天）的雄性和雌性WKY大鼠与SHRs。动物被随机分为治疗组，分别腹腔注射溶剂（vehicle）、MAGL抑制剂JZL-184（8或16 mg/kg）、FAAH抑制剂URB597（0.3或1 mg/kg）或AEA转运抑制剂AM404（1或5 mg/kg）。给药20分钟后，动物依次接受开放场地（OF，10分钟）和高架十字迷宫（EPM，5分钟）测试，以评估其自发活动、冒险行为及风险评估行为（如总运动距离、进入中心区次数与潜伏期、开放臂进入次数与时间、伸展-趋近姿势（SAP）和头探（HD）次数等）。行为学数据通过视频分析系统（ANY-maze）采集。行为测试结束后，立即取脑并分离前额叶皮质、纹状体和海马组织。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测这些脑区中CB₁R、CB₂R、FAAH和MAGL的蛋白表达水平，以α-微管蛋白作为内参。数据统计分析采用三因素方差分析（品系×性别×处理）及事后检验，显著性水平设为p< 0.05。

三、研究结果

3.1. 自发活动

在开放场地和高架十字迷宫中，SHRs的总运动距离、平均速度和封闭臂进入次数均显著高于WKY大鼠，表明SHRs存在过度活动。雌性大鼠（无论品系）的活动水平高于同品系雄性。给予16 mg/kg的JZL-184（MAGL抑制剂）可降低动物的总体自发活动（与溶剂组相比）。

3.2. 风险评估/焦虑样行为

在开放场地中，SHRs进入中心区的次数更多、进入潜伏期更短、在中心区活动的距离和时间百分比更高，表明其冒险行为增加而风险评估行为减少。在高架十字迷宫中，SHRs在中心平台停留的时间百分比更低，封闭臂停留时间更长，但开放臂进入和停留的百分比在品系间无差异。雌性大鼠在开放臂停留的时间百分比高于雄性。在风险评估的精细行为方面，SHRs的伸展-趋近姿势（SAP）次数低于WKYs，而头探（HD）次数更高。雌性大鼠的SAP次数高于雄性。

药物处理产生了复杂的影响：在WKY大鼠中，8 mg/kg JZL-184延长了进入开放场地中心区的潜伏期，增强了风险评估。给予16 mg/kg JZL-184增加了开放臂进入的百分比。更重要的是，当内源性大麻素水平被提升时（通过JZL-184、AM404或URB597），雌性大鼠的SAP次数减少。在SHRs中，性别与药物存在交互作用：1 mg/kg URB597（FAAH抑制剂）使雄性SHRs的HD增加，却使雌性SHRs的HD减少；而1 mg/kg AM404（AEA转运抑制剂）使雌性SHRs的HD增加。

3.3. 纹状体与海马中CB₁R、CB₂R、FAAH和MAGL蛋白水平的品系差异

在对照组（未给药）动物中检测了基础蛋白表达。在纹状体，雌性SHRs的FAAH和MAGL蛋白水平高于雌性WKYs，而雄性SHRs的CB₂R水平低于雄性WKYs。在海马，雌性SHRs的CB₂R水平高于雌性WKYs。

3.4. 前额叶皮质、纹状体与海马中CB₁R、CB₂R、FAAH和MAGL蛋白水平的性别差异

在前额叶皮质，无论是WKY还是SHR品系，雌性大鼠的CB₁R蛋白水平均显著低于同品系雄性。在纹状体，SHR雌性大鼠的FAAH水平高于SHR雄性。在海马，SHR雌性大鼠的CB₂R水平低于SHR雄性，而FAAH水平更高。在WKY品系中，这些蛋白未见显著的性别差异。

四、讨论与结论

本研究的发现表明，在ADHD动物模型中，通过药物抑制降解途径来急性提升内源性大麻素2-AG和AEA的水平，能够以品系和性别依赖的方式调节防御行为。SHRs表现出基础的活动过度、冒险行为增加以及风险评估行为（如SAP）减少，这与前额叶-纹状体环路功能障碍的假设一致。雌性大鼠普遍表现出更高的自发活动和更活跃的风险评估行为，并且对内源性大麻素调节更敏感，例如其SAP在多种药物处理后均减少。

在分子层面，SHRs（尤其是雌性）在纹状体和海马等脑区表现出ECS关键蛋白（如FAAH、MAGL、CB₂R）的基础表达存在品系和性别特异性差异。雌性SHRs较高的降解酶（FAAH、MAGL）水平可能意味着其内源性大麻素基础“张力”较低。此外，雌性大鼠在前额叶皮质的CB₁R表达普遍低于雄性，这提示ECS信号传导存在固有的性别二态性。

这些结果综合表明，内源性大麻素系统在前额叶-纹状体环路中对抑制控制和防御行为的调节，受到遗传背景（品系）和性别的精细调控。合成性大麻素配体与提升内源性配体所产生的行为效应有所不同，后者可能涉及更复杂的受体激活模式（包括非大麻素受体）。本研究首次在ADHD动物模型中系统揭示了通过调节内源性大麻素降解途径来影响防御行为的性别和品系依赖性，并提供了相应的分子关联证据。这提示，未来任何针对ADHD的内源性大麻素系统干预策略，都需要充分考虑这些基础的性别和品系差异。研究结论强调，增加2-AG和AEA（通过抑制其降解途径）以品系和性别依赖的方式调节防御行为。前额叶皮质、纹状体和海马中蛋白质表达的差异与行为结果相符，为防御行为的品系和性别特异性模式提供了分子见解。