来自洋葱（Allium cepa）的槲皮素：一种针对感染番茄植株的根结线虫（Meloidogyne incognita）的强效生物防治剂

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Quercetin from Allium cepa: A potent bionematicide against root-knot nematodes, Meloidogyne incognita infecting tomato plants

　　阿杰伊·戈文达拉杰 | 拉贾·卡利穆图 | 卡南·潘迪安 | 卡尔蒂凯扬·穆图萨米 | 迪克沙娜·蒂鲁纳武卡拉苏 | 马里穆图·苏布拉马尼安 | 博米纳坦·帕拉苏拉曼 | 约翰逊·伊鲁塔斯瓦米 | 乐凯什·蒂鲁穆鲁甘
印度泰米尔纳德邦农业大学农业纳米技术中心，哥印拜陀

摘要
从洋葱皮中提取的槲皮素被评估其对感染番茄植株的根结线虫（Meloidogyne incognita）的杀线虫活性。基于生物测定的分馏和光谱分析确认了槲皮素的纯度为94%。扫描电子显微镜显示其具有长形的六边形微晶结构。体外生物测定表明，0.1%的槲皮素可在72小时内完全抑制卵的孵化并导致100%的幼虫死亡。分子对接结果表明，槲皮素可能与超氧化物歧化酶、翻译调控的肿瘤蛋白、胞苷脱氨酶和钙网蛋白等靶点发生相互作用。盆栽实验表明，施用0.025–0.125%的槲皮素可显著减少线虫数量，且不会对植物产生明显的毒性。接受槲皮素处理的植株的地上部分（增加80.72%）和根部（增加68.62%）的长度均高于受感染的对照组。此外，槲皮素处理还提高了植物中的酚类物质含量及防御相关的酶活性，包括过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸氨解酶和酸性磷酸酶。结合体外和体内的生物活性结果表明，槲皮素具有显著的杀线虫效果，使其成为温室条件下可持续管理根结线虫的植物源生物杀线虫剂。

1. 引言
番茄（Solanum lycopersicum L.）是一种在全球温带和热带地区广泛种植的重要蔬菜作物。2023年，全球番茄产量达到约1.9232亿吨，种植面积为540万公顷[1]。番茄是全球消费量最大的五种蔬菜之一，具有重要的营养、经济和工业价值。在印度，番茄全年都在露天和保护性种植系统中生长，是农民的主要收入来源。尽管如此，番茄生产仍受到生物和非生物因素的严重影响。其中，包括昆虫害虫、病原体和植物寄生线虫在内的生物因素导致全球每年约15–35%的产量损失[2]。
植物寄生线虫是微小的专性寄生虫，它们会侵入植物组织（尤其是根部），干扰水分和养分的吸收，从而造成植株生长受阻、叶片黄化和产量下降。这些线虫对许多经济重要作物的产量和质量构成严重威胁，每年造成5–20%的损失，相当于约1750亿美元的净经济损失[3]。在各种根结线虫中，根结线虫因其广泛的寄主范围、全球分布以及能够诱导宿主细胞形成巨型营养结构而尤为突出[4]。作为固着内寄生虫，它们的第二期幼虫会穿透根部并建立永久性的取食场所。全球已记录有超过100种根结线虫（Meloidogyne spp.），可感染3000多种植物宿主，包括多种蔬菜和水果。其中M. incognita、M. javanica、M. arenaria和M. hapla被认为是最具侵袭性和破坏性的物种，可导致易感作物产量损失高达90%[5]。它们的感染不仅会破坏植物生长，还会增加植物对其他土传病原体的敏感性，进一步加剧农业生产的损失。
番茄对M. incognita高度敏感，这种线虫会侵入根系并引发根瘤形成，影响养分和水分的吸收，导致产量损失11–35%，具体损失程度取决于线虫密度和环境条件[6]。综合线虫管理（INM）策略结合了栽培方法、抗病品种、生物控制剂和环境安全的杀线虫剂来可持续减少线虫种群。然而，这些方法的效果往往受到田间表现不稳定、成本高昂以及线虫适应能力的影响。合成杀线虫剂主要通过抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）来干扰神经系统，导致神经损伤和麻痹[7]，也可能通过干扰ATP合成影响线虫的线粒体呼吸和能量代谢，从而降低其繁殖能力[8]。尽管有效，但大量使用这些杀线虫剂会引发环境污染、非目标生物的毒性问题以及线虫的抗药性发展，并受到严格的监管限制。长期使用还可能降低土壤质量、污染地下水并破坏有益的土壤微生物，引发可持续性的担忧[9]。因此，人们越来越关注小分子抑制剂的研究，特别是来源于植物、真菌和细菌的次级代谢产物，因为它们具有生物降解性和靶向性。
来源于印楝（Azadirachta indica）、芥菜（Brassica spp.）、大蒜（Allium sativa）、洋葱（Allium cepa）和蓖麻（Ricinus communis）的植物次级代谢产物（如生物碱、黄酮类、萜类和酚类）为管理根结线虫提供了环保的选择[10]。这些化合物通过神经毒性、氧化应激、酶抑制和膜破坏等机制干扰线虫的生理活动，从而抑制卵的孵化、幼虫的活动或存活。此外，它们具有快速生物降解性，对非目标生物的毒性较低，使其成为可行的环保替代方案[11]。某些黄酮类化合物（包括来自苯丙烷类途径的槲皮素）可作为根系释放的信号分子，促进与固氮细菌和丛枝菌根真菌的共生作用，从而改善植物的养分吸收[12][13]。
洋葱（Allium cepa L.）是种植最广泛的蔬菜作物之一，其收获和加工过程中会产生大量的农业工业废弃物[14]。洋葱皮约占洋葱总质量的10–15%，但通常作为固体废物被丢弃，导致微生物降解、异味产生和温室气体排放，以及有价值的植物化学物质的损失。虽然洋葱皮富含生物活性化合物，但由于缺乏有效的利用策略和回收工艺，其价值未被充分挖掘。值得注意的是，洋葱皮富含多酚类化合物，尤其是槲皮素，主要以槲皮素-4-葡萄糖苷和槲皮素-3,4-二葡萄糖苷的形式存在。槲皮素具有很强的抗氧化、抗菌和广谱杀虫活性[15]。结构上，槲皮素由3-羟基黄酮骨架组成，含有多个羟基取代基，存在苷态、苷元和甲基化形式，这些因素影响其溶解度、稳定性和生物活性[16][17]。然而，植物中槲皮素的浓度和组成受生物和非生物因素的影响[18]。利用洋葱皮废弃物可以将其转化为高价值的生物活性化合物，实现可持续的废物转化。从洋葱皮中提取高纯度的槲皮素可以将其应用于营养保健品中的天然抗氧化剂和农业中的生物农药[19]。这种策略有助于减少废物、延长生物资源，并符合联合国可持续发展目标（SDG 12）关于负责任消费、减少废物和循环经济的理念[20]。
采用水基提取介质的超声波辅助提取（UAE）结合液-液萃取是一种绿色环保的提取方法，相比使用乙醇或深共晶溶剂的传统提取技术，该方法减少了有机溶剂的依赖[21]。声空化效应和高效的相分离增强了传质效率，减少了溶剂消耗和能源需求[22]。最近的研究表明，黄酮类化合物具有显著的杀线虫潜力，可显著杀死根结线虫的幼虫[23][24]。尽管槲皮素是一种具有抗菌和杀线虫活性的已知化合物，但关于从洋葱皮中优化提取槲皮素及其对根结线虫效果的全面植物水平验证的研究仍较为有限。
为填补这一空白，本研究探讨了从洋葱皮中提取的槲皮素对M. incognita的生物杀线虫效果。通过体外生物测定评估了其浓度对线虫存活的影响，并通过盆栽实验验证了其在温室条件下的抑制效果。此外，还进行了生化分析以评估槲皮素处理后植物的防御反应，并通过计算机模拟预测了槲皮素与关键线虫分子靶点（如代谢酶、细胞保护效应蛋白和氧化还原调节蛋白）之间的相互作用。这种综合方法结合了机制洞察和实践验证，使槲皮素成为一种可持续的生物杀线虫剂。

2. 材料与方法
2.1. 实验材料
铝背TLC板预涂有Silica gel 60F254，层厚为175–225 μm；Silica gel 60（70-230目）购自印度班加罗尔的Sigma-Aldrich公司。Folin-Ciocalteu试剂、香豆醇、L-苯丙氨酸、P-硝基苯酚磷酸酯、焦性没食子酚和Tween 20购自印度孟买的HiMedia Private Ltd.公司。乙酸乙酯（AR级）和己烷（AR级）购自印度新德里的Central Drug House（CDH）公司；甲醇（HPLC级）购自印度孟买的Molchem公司。

2.2. 洋葱皮的采集与制备
洋葱皮来自印度哥印拜陀的泰米尔纳德邦农业大学宿舍食堂。选择外观完整、无变色和微生物污染的洋葱皮，用双蒸水冲洗以去除附着的灰尘和杂质。去除多余的水分后，将清洗过的洋葱皮均匀摊开在不锈钢托盘上，在40±2°C的热风烘箱中干燥48小时以去除残留水分。干燥后的洋葱皮用实验室研磨机研磨成细粉，并过筛以获得粒径小于400 μm的粉末。将粉末样品装入琥珀色密封瓶中，在4±1°C的黑暗条件下储存以防止生物活性化合物降解。

2.3. 生物活性提取与分离
2.3.1. 超声波辅助水提取法
将洋葱粉悬浮在双蒸水中，固液比为1:10（w/v），置于高颈烧杯中。使用Vibra cell VCX 1500超声波仪（Sonics & Materials，美国）进行超声波处理，探头为直径13毫米的钛合金棒。处理条件为60%振幅和20 KHz频率，脉冲模式（5秒开/5秒关），持续40分钟，以减少热敏性黄酮的降解。使用冰水浴保持悬浮液温度低于40°C。超声处理后，让提取物在室温下冷却，然后通过双层棉布过滤，再通过Whatman No. 1滤纸过滤，得到澄清的水相提取物。记录滤液的体积，并将提取物在4°C下储存待进一步液-液萃取。所有提取操作重复三次以确保结果的一致性。

2.3.2. 液-液分离与水相提取物的浓缩
将超声波辅助提取得到的澄清水相提取物与等体积的乙酸乙酯和己烷（1:1 v/v）进行液-液分离，方法参考先前的研究并稍作修改[26]。混合液在25±2°C下以600 rpm旋转搅拌2小时，然后静置至完全分离。收集上层有机相，剩余的水相用新鲜的乙酸乙酯:己烷（1:1, v/v）再萃取两次，以确保目标生物活性物质的最大回收率。合并的有机相在旋转蒸发器（Heidolph Laborota 4000，德国）中减压浓缩至200 mbar和45°C，浓缩5分钟。将浓缩后的提取物转移到预先称重的琥珀色小瓶中，继续在室温下干燥24小时以获得粗提物。记录干燥重量，并将提取物储存在-20°C。

2.3.3. 用硅胶柱色谱纯化粗提物
取500毫克粗提物溶于乙酸乙酯（10 mL），然后用磁力搅拌器（Remi，印度）以600 rpm连续搅拌5分钟，将其均匀吸附到硅胶（60/120目，1.5克）上。在减压条件下使用旋转蒸发器（Heidolph Laborota 4000，德国）去除溶剂，得到干燥、流动性良好的样品-硅胶混合物。将样品-硅胶混合物装入玻璃柱中，采用阶梯式极性梯度（己烷:乙酸乙酯混合物）进行洗脱。重复使用己烷:乙酸乙酯（1:1 v/v）溶剂系统，确保槲皮素部分完全洗脱。共消耗1200毫升移动相，用于500毫克的粗提物，收集24个组分。通过薄层色谱（TLC）板分析了化合物的分子级分变化，移动相使用的是己烷：乙酸乙酯（1:1 v/v）混合物。色谱斑点在紫外光下可见。含有槲皮素的组分通过将其Rf值与槲皮素标准品直接比较来确定。具有相同Rf值和紫外荧光的组分被合并，并通过0.45-μm的PTFE注射器过滤器过滤，然后在减压条件下（150 mbar，40 °C）使用旋转蒸发器浓缩至干涸。

**2.4 树皮素的定性和定量分析**

**2.4.1 光谱学表征**
在25°C下，使用UV-Vis分光光度计（SPECORD 200 plus analytik jena，德国）记录了纯化槲皮素和参考标准品的紫外-可见吸收光谱。光谱扫描范围为190-800 nm，数据采集间隔为1 nm。样品和标准品的溶剂均使用HPLC级甲醇（Molchem，孟买，印度）。在分析前测量含有纯甲醇的空白样品，以校正基线漂移、溶剂吸光度和光散射效应。将标准槲皮素溶解在甲醇中制备标准溶液，随后稀释得到25–500 μg/mL浓度范围内的校准曲线，线性非常好（R2 = 0.99）[27]。使用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱仪（FT-IR6800 Type A型号，JASCO International Co., Ltd.，日本）在环境温度下以衰减全反射（ATR）模式记录了纯化槲皮素和标准品的FT-IR光谱。为了提高信噪比，光谱采集范围设置在4000至400 cm?1的中红外区域[28]。

**2.4.2 高效液相色谱（HPLC）**
使用岛津Nexera X2（京都，日本）高效液相色谱系统对槲皮素进行定性和定量分析。色谱分离在C18柱（2.1 × 250 mm）上进行，该柱连接了一个SPD-M20A光电二极管阵列（PDA）探测器，该探测器配备了快速扫描功能，能够在整个190–800 nm波长范围内进行光谱采集，从而准确确定槲皮素的λmax值。移动相由甲醇和0.1%磷酸水溶液（49:51, v/v）组成，以等密度流速1 mL/min输送。每个样品注射10 μL的量，色谱图在370 nm波长下记录，保留时间为20分钟，峰也在370 nm下记录。使用HPLC级槲皮素作为内标，以确保峰的正确定量和可靠的定量分析[29]。

**2.5 X射线衍射（XRD）**
使用X射线衍射仪（PANalytical X’Pert PRO，荷兰）分析了纯化槲皮素的晶体结构，该仪器配备了Cu Kα辐射（λ=1.5406 ?）。分析在室温下进行，工作电压为45 kV，电流为30 mA。衍射图在2θ范围0-100°内以适当的扫描速率连续记录，以用于相鉴定[30]。

**2.6 扫描电子显微镜（SEM）**
使用扫描电子显微镜（Quanta 250 FEG，FEI，捷克共和国）观察了纯化槲皮素和标准品的表面形态。样品固定在铝制样品台上，表面涂有碳 tape并溅射了一层薄金（约10 nm），以改善导电性。SEM图像在8 kV的加速电压下获得，放大倍数范围从3000×到10,000×[30]。

**2.7 线虫分离和分子鉴定**
从印度泰米尔纳德邦科印巴托尔区Madhampatty的番茄种植区收集了感染根结线虫的根样本（纬度：10°58’29.5” N，经度：76°51’43.4” E）。根部彻底清洗以去除附着的土壤颗粒，然后仔细提取卵块并在室温（26 ± 2 °C；相对湿度80%）下孵育三天。通过PCR扩增卵、幼虫和成年雌虫的18S rRNA区域进行线虫的分子鉴定，使用的引物为TW81（GTTTCCGTAGGTGAACCTGC）和AB28（ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT），遵循Joyce等人的方案（1994）[31]。PCR产物（10 μL）在1%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液在70 V下运行50分钟，并在装有Image Lab?软件的Bio-Rad Gel Doc? XR+成像系统下在紫外光下观察。扩增片段随后外包进行测序，所得序列使用NCBI BLAST与非冗余核苷酸数据库进行比对[28]。

**2.8 槲皮素标准溶液的制备**
评估纯化槲皮素在体外条件下对M. incognita的杀线虫活性。由于其水溶性差，标准溶液制备在1%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）中，并进一步用水中的0.05%（v/v）吐温20稀释以提高分散性和降低表面张力。测试溶液的最终浓度为0.025%、0.05%、0.075%和0.1%（w/v）[23]，并评估其对M. incognita卵和J2阶段幼虫的影响。所有实验中还包括一个溶剂对照组，其中包含与处理溶液相同浓度的DMSO和吐温20（20μL DMSO和1980μL蒸馏水），不含槲皮素，以评估溶剂相关效应。

**2.8.1 对M. incognita卵的生物测定**
为了评估槲皮素对M. incognita卵孵化的影响，测试了不同浓度对J2阶段幼虫孵化能力的抑制作用。根据[32]描述的方法制备了含有100个M. incognita卵的悬浮液。将10 μL的悬浮液分配到含有2 mL不同浓度槲皮素的24孔组织培养板中。同时包括一个溶剂对照组，其中含有20 μL DMSO和0.05%吐温20的1980 μL蒸馏水，以及单独的蒸馏水作为对照。在暴露后24小时、48小时和72小时使用倒置荧光显微镜（Nikon，Eclipse Ti2，日本）观察结果。每种处理重复四次，实验进行两次以确保结果的一致性。通过计数孵化和未孵化的卵来计算卵孵化抑制率（%）[33]。

**2.8.2 对M. incognita幼虫的生物测定**
为了评估槲皮素对M. incognita幼虫死亡率的影响，测试了不同浓度对其致死能力。将含有100个M. incognita幼虫的悬浮液（10 μL）加入含有2 mL不同浓度槲皮素的24孔组织培养板中。同样包括一个溶剂对照组，其中含有20 μL DMSO和0.05%吐温20的1980 μL蒸馏水，以及单独的蒸馏水作为对照。在暴露后24小时、48小时和72小时使用倒置显微镜观察结果。暴露72小时后，在倒置显微镜下计数不动（死亡）的M. incognita幼虫数量。为了区分死亡和暂时性麻痹，通过将处理的线虫转移到干净的蒸馏水中进行恢复实验[34]。恢复实验按照(Whitehead and Hemming, 1965) [35]的方法进行。在25 ± 2 °C下再孵育24小时后再次观察幼虫。即使经过多次针刺仍然保持直立不动的幼虫被视为死亡，而可以移动或卷曲的幼虫被视为存活。最终幼虫死亡率使用公式[18]计算。死亡数据使用Abbott公式进行校正，以考虑任何由对照组引起的死亡率[36]。

**2.9 M. incognita关键蛋白靶标的分子对接**
M. incognita的潜在蛋白靶标包括超氧化物歧化酶、翻译调控的肿瘤蛋白、胞苷脱氨酶和钙网蛋白。使用计算结构软件如SWISS-MODEL [37]、Phyre2 [38]和ROBETTA [39]（表S6）对选定的关键靶标进行分子建模。当查询覆盖率超过80%且序列同一性超过30%时，选择SWISS-MODEL。当查询覆盖率在50%到80%之间且序列同一性低于30%时，选用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）模型。当查询覆盖率和同一性都较低时，使用ROBETTA服务器（http://robetta.bakerlab.org/）进行结构预测。目标FASTA序列使用BLASTp [40]与蛋白质数据库比对，以评估查询覆盖率、比对性能和百分比同一性，从而选择合适的建模软件。建模结构的质量通过诸如全局平均质量估计（GMQE）得分接近1、序列同一性在安全范围（30–50%）以及最佳查询覆盖率等标准进行验证 [2.10]。

**2.10 M. incognita蛋白模型的验证**
使用PROCHECK [41]（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK/）工具从结构分析和验证服务器（SAVES metaserver；https://saves.mbi.ucla.edu/）生成Ramachandran图，通过评估残基在有利区域和禁止区域的分布来验证建模蛋白的质量[41]。此外，还使用Swiss PDB Viewer [42]（http://www.expasy.org/spdbv/）进行能量最小化和环FFT细化，以修正位于禁止区域的残基[2.11]。

**2.11 配体制备**
为了对接研究，选择了一种从洋葱皮次生代谢物中分离出的生物分子，并将其与M. incognita靶标进行对接。这些配体的2D和3D结构从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以SDF格式获取。商用杀线虫剂fluenensulfone用作参考化合物，以评估测试分子对M. incognita的效果。Open Babel软件被用来将配体文件从SDF格式转换为PDB格式[2.12]。

**2.12 在计算机上对生物分子与M. incognita靶蛋白的筛选和对接**
使用PyRx 0.8中的AutoDock Vina模块进行了分子对接[2.12]。目标蛋白使用PyRx中的大分子工具进行准备，每个配体通过共轭梯度算法进行200步的能量最小化，采用了通用力场（UFF）参数。使用CASTp 3.0 [44]识别蛋白上的结合口袋。配体设置为网格生成和对接，使用AutoDock 4和AutoGrid 4进行对接，允许8的扭转灵活性。蛋白质和配体文件均转换为PDBQT格式。使用BIOVIA Discovery Studio Client 2021 [45]可视化和分析所得的蛋白-配体复合物[2.13]。

**2.13 植物生物活性槲皮素在番茄植物中的效果**
在印度泰米尔纳德邦科印巴托尔大学（TNAU）的植物学系温室条件下研究了植物生物活性槲皮素对M. incognita的效果（纬度：11°00’37.0” N，经度：76°55’52.1” E）。通过将3 kg的红土、沙子和农家肥按1:1:1（w/w）的比例混合制备了无菌生长介质。将15天大的番茄（Solanum lycopersicum L.）PKM 1品种幼苗移植到该混合物中。培养盆在50%遮荫条件下，温度维持在26 ± 2 °C，整个实验期间控制灌溉。移植一周后，每盆接种3000个J2阶段的线虫[33]。接种7天后，每个含有3 kg土壤的培养盆用10 mL不同浓度的0.025%、0.05%、0.075%和0.125% [23]槲皮素溶液浇灌。不含槲皮素的溶剂对照组包含相同浓度的DMSO和吐温20（20μL DMSO和1980μL蒸馏水，总共20μL），以评估溶剂的相关效应。

**2.13.1 对M. incognita卵的生物测定**
为了评估槲皮素对M. incognita卵孵化的影响，测试了不同浓度对其抑制孵化能力的作用。根据[32]描述的方法制备了卵悬浮液。将含有100个M. incognita卵的10 μL悬浮液分配到含有2 mL不同浓度槲皮素的24孔组织培养板中。同时包括一个溶剂对照组，其中含有20 μL DMSO和0.05%吐温20的1980 μL蒸馏水，以及单独的蒸馏水作为对照。在暴露后24小时、48小时和72小时使用倒置荧光显微镜（Nikon，Eclipse Ti2，日本）观察结果。每个处理重复四次，实验进行两次以确认结果的可靠性。通过计数孵化和未孵化的卵来确定卵孵化抑制率[33]。

**2.13.2 对M. incognita幼虫的生物测定**
为了评估槲皮素对M. incognita幼虫死亡率的影响，测试了不同浓度对其致死能力的作用。将含有100个M. incognita幼虫（J2阶段）的10 μL悬浮液加入含有2 mL不同浓度槲皮素的24孔组织培养板中。同样包括一个溶剂对照组，其中含有20 μL DMSO和0.05%吐温20的1980 μL蒸馏水，以及单独的蒸馏水作为对照。在暴露后24小时、48小时和72小时使用倒置显微镜观察结果。暴露72小时后，在倒置显微镜下计数不动（死亡）的M. incognita幼虫数量。为了区分死亡和暂时性麻痹，通过将处理的线虫转移到干净的蒸馏水中进行恢复实验[34]。恢复实验按照(Whitehead and Hemming, 1965) [35]的方法进行。在25 ± 2 °C下再孵育24小时后再次观察幼虫。即使经过多次探针刺激仍然保持直立不动的幼虫被视为死亡，而能够移动或卷曲的幼虫被视为存活。最终幼虫死亡率使用公式[18]计算。死亡数据使用Abbott公式进行校正，以考虑任何由对照组引起的死亡率[36]。

**2.14 M. incognita关键蛋白靶标的分子对接**
M. incognita的潜在蛋白靶标包括超氧化物歧化酶、翻译调控的肿瘤蛋白、胞苷脱氨酶和钙网蛋白。使用SWISS-MODEL [37]、Phyre2 [38]和ROBETTA [39]（表S6）等计算结构工具对选定的关键靶标进行了分子建模。当查询覆盖率超过80%且序列同一性超过30%时，选择SWISS-MODEL。当查询覆盖率在50%到80%之间且序列同一性低于30%时，选择Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）模型。当查询覆盖率和同一性都较低时，使用ROBETTA服务器（http://robetta.bakerlab.org/）进行结构预测。目标FASTA序列使用BLASTp [40]与蛋白质数据库比对，以评估查询覆盖率、比对性能和百分比同一性，从而选择适当的建模软件。建模结构的有效性通过全球平均质量估计（GMQE）得分接近1、序列同一性在安全范围（30–50%）以及最佳查询覆盖率等标准进行验证[2.14]。

**2.15 M. incognita开发蛋白模型的验证**
使用PROCHECK [41]（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK/）工具从结构分析和验证服务器（SAVES metaserver；https://saves.mbi.ucla.edu/）生成Ramachandran图，通过评估残基在有利区域和禁止区域的分布来验证建模蛋白的整体质量[2.15]。此外，还使用Swiss PDB Viewer [42]（http://www.expasy.org/spdbv/）进行能量最小化和环FFT细化，以修正位于禁止区域的残基[2.15]。

**2.16 配体制备**
为了对接研究，从洋葱皮次生代谢物中分离出的生物分子被选为配体，并与M. incognita靶标进行对接。这些配体的2D和3D结构从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以SDF格式获取。商业杀线虫剂fluenensulfone作为参考化合物，以评估测试分子对M. incognita的效果。使用Open Babel软件将配体文件从SDF格式转换为PDB格式[2.16]。

**2.17 在计算机上对生物分子与M. incognita靶蛋白的筛选和对接**
使用PyRx 0.8中的AutoDock Vina模块进行了分子对接[2.17]。目标蛋白使用PyRx中的大分子工具进行准备，每个配体通过共轭梯度算法进行200步的能量最小化，采用了通用力场（UFF）参数。使用CASTp 3.0 [44]识别蛋白质上的结合口袋。配体设置为网格生成和对接，使用AutoDock 4和AutoGrid 4进行对接，允许8的扭转灵活性。蛋白质和配体文件均转换为PDBQT格式。使用BIOVIA Discovery Studio Client 2021 [45]可视化和分析得到的蛋白-配体复合物[2.17]。

**2.18 植物盆栽实验**
在印度泰米尔纳德邦科印巴托尔大学（TNAU）的槲皮素的效力评估包括一项番茄-线虫相互作用试验，并通过生化评估进行了验证。数据以两次生物学重复实验的平均值±标准误差（SE）的形式呈现，每次实验包含四个技术重复。超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定遵循Jing等人（2017）[51]的方法进行。2.15部分描述了具体步骤。2.16部分对槲皮素在番茄植株中的视觉植物毒性进行了定期评估（1、3、5、7、10、15、20、25和30天后），以评估其与未处理对照组的相对安全性。2.16部分还介绍了统计分析方法：使用单因素方差分析（ANOVA）来检验处理组间的总体显著差异；当p<0.05时，采用Tukey’s HSD（ Honestly Significant Difference）检验进行事后均值分离。所有统计分析均使用R语言的agricolae包（版本4.3.1）完成。此外，还利用probit分析来建模剂量-反应关系，并估计达到50%（LC50）和95%（LC95）死亡率的剂量。

**3. 结果**
**3.1 槲皮素从洋葱皮中的提取与纯化**
首先筛选了无变色、无损伤且未受微生物污染的洋葱皮，以减少污染风险并确保样品的均匀性。将选定的洋葱皮在40°C下空气干燥48小时，最终含水量约为4.0±0.5%。随后采用超声波辅助提取（UAE）结合真空过滤，将溶剂体积减少了20±2%。随后通过己烷:乙酸乙酯（1:1 v/v）的液-液萃取法得到澄清的双相体系，重复萃取以最大限度回收脂溶性成分。在减压条件下使用旋转蒸发器浓缩有机相，得到了一种粘稠的粗产物，其中槲皮素的平均含量为每克干洋葱皮粉12.2±0.35毫克。取部分粗产物（500毫克）进行正常相硅胶柱色谱分离，使用己烷:乙酸乙酯（1:1，v/v）作为洗脱液。共收集到24个馏分，并通过TLC分析（流动相同样为己烷:乙酸乙酯（1:1，v/v））。馏分9-12在紫外光下显示亮黄色荧光斑点，Rf值为0.53[52]，与槲皮素标准品的结果一致（见图S1）。减压去除溶剂后，每500毫克柱负载的粗产物可纯化出约220.25毫克的槲皮素，提取效率为44.05%（w/w）。

**3.2 纯化槲皮素的物理化学与光谱特性**
纯化的化合物呈亮黄色固体状，显微镜观察显示结晶生长清晰，表明纯度较高且具有结晶有序性。扫描电子显微镜（SEM）图像进一步证实了层状生长模式，这符合受控成核和溶剂介导的重结晶过程。经过48小时缓慢溶剂蒸发后，槲皮素结晶为长形六边形微晶，表面光滑边缘锐利，平均长度为15.50微米，宽度为3.852微米（见图1）。

**3.3 槲皮素对线虫种类的分子识别**
从不同发育阶段的M. incognita中扩增18S rRNA区域，得到约560 bp的片段。BLAST分析显示这些片段与参考M. incognita序列具有99%的序列相似性。所得序列经过NCBI数据库比对后提交至GenBank，赋予访问编号PV450689。

**3.4 植物基生物分子对M. incognita卵和幼虫的体外评估**
使用纯化的槲皮素对M. incognita的卵和幼虫进行了体外生物测定。结果表明，在不同浓度和暴露时间内，该分子对M. incognita具有显著影响：0.1%浓度下暴露24小时后，幼虫死亡率高达84%；相同浓度下暴露72小时后死亡率可达100%，而对照组仅为6%。线虫死亡动力学曲线见图6。此外，暴露0.1%浓度24小时后，卵孵化率相对对照组降低了近100%（对照组为97%）。24、48和72小时时的致死浓度（LC50和LC90）及其相应的置信区间见表2，并以probit剂量-反应曲线形式展示（见图7）。

**3.5 植物基生物分子对M. incognita蛋白质靶点的computational模拟**
从洋葱皮中分离出的槲皮素对M. incognita的多种蛋白质靶点具有显著作用。通过与翻译调控的肿瘤蛋白（TCTP）结合亲和力为-8.1 kcal/mol，与calreticulin为-7.5 kcal/mol，与超氧化物歧化酶（SOD）为-7.2 kcal/mol，与胞苷脱氨酶为-6.7 kcal/mol（见图S2及相应的ramachandran图）。Fluensulfone作为阳性对照，还观察到其他相互作用类型，如疏水性、范德华力、π-π堆积、烷基和π-烷基作用（见图S3）。

**3.6 温室条件下槲皮素的视觉植物毒性分析**
在整个观察期间，经槲皮素处理的植株未表现出任何可见的植物毒性症状，如叶片黄化、坏死、萎蔫、变形或生长抑制。处理植株的生长状况与未处理对照组相当，说明在温室条件下使用槲皮素不会对番茄植株产生毒性。

**3.7 槲皮素的生长促进和杀线虫活性评估**
体外研究显示槲皮素具有显著效果，随后进行盆栽实验以评估其对M. incognita种群的作用。土壤浸泡法表明，0.125%浓度的槲皮素显著影响了线虫种群并促进了植株生长：与对照组相比，其茎长（55.32厘米）、茎重（38.21克）、根长（31.4厘米）和根重（23.48克）均有所增加（见表1）。同时发现该化合物能显著减少根部的线虫数量：0.125%浓度下，每根根系有13个虫瘤、10条雌性线虫、8个虫卵，而对照组分别为45个虫瘤、58条雌性线虫和272条线虫（见图9）。

**3.8 槲皮素的生长促进和杀线虫效果验证**
进一步研究证实了槲皮素的有效性。在受到M. incognita感染并经过槲皮素处理的植物中，发生了生物化学和抗氧化反应。M. incognita感染在植物中引发了显著的生物化学变化，槲皮素处理过的植物与未处理的受感染植物之间存在明显差异。在经过槲皮素处理的植物中，可溶性蛋白水平在感染初期上升，但随后下降，这可能是由于线虫摄入了养分。感染后，酚类化合物积累，处理过的植物中其含量更高（3毫克/克根），表明它们参与了植物的防御机制。过氧化物酶（PO）活性在受感染的植物中降低，但在经过槲皮素处理的植物中增加（3.5毫摩尔/毫克蛋白），有助于细胞壁木质化并增强抗性。同样，多酚氧化酶（PPO）（3.3毫摩尔/毫克蛋白）和苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）活性（3.5纳摩尔/克/分钟）也增加，支持了防御反应和木质素的生物合成。酸性磷酸酶活性也升高（15.6毫摩尔/分钟对硝基苯酚/毫克），进一步增强了对M. incognita的抗性（图10）。

图10. 番茄植物对M. incognita感染的生物化学反应。该图展示了可溶性蛋白水平（a）、多酚氧化酶（PPO）（b）、总酚含量（c）、苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）活性（d）、过氧化物酶（PO）活性（e）和酸性磷酸酶活性（f）的变化，这些参数反映了在线虫胁迫下可能与植物防御反应相关的酶学变化。

超氧化物歧化酶（SOD）活性随着线虫侵染程度的增加而升高，原始SOD活性从0.52 U/ml上升到1.70 U/ml。然而，当按蛋白质含量归一化后，SOD活性从6.8 U/mg下降到4.07 U/mg，表明在严重胁迫下酶活性降低。这表明线虫感染在番茄根部引发了氧化应激反应（图11）。

讨论：
番茄根结线虫M. incognita通过分泌和效应蛋白介导寄生、免疫抑制以及取食部位的形成[53]。为了克服这种病原性，可以利用植物代谢物如酚类、萜类和黄酮类作为替代品；它们可以干扰线虫的行为，抑制效应蛋白和分泌蛋白的活性，抑制运动能力，并具有驱线虫和杀线虫的作用[54]。因此，本研究重点关注槲皮素对番茄植物中M. incognita的隔离、特性鉴定、杀线虫效果及其促进生长的性质。研究结果强调了槲皮素作为强效生物制剂的潜力，为线虫问题提供了一种可行的、环保的解决方案，并为合成杀线虫剂提供了可持续的替代方案。从植物基质中提取的黄酮类因其广谱的抗菌、抗氧化和抗炎活性而受到认可，这些活性是通过清除活性氧、调节代谢酶和调控细胞信号通路来实现的[55][56]。

本研究优化了一种超声辅助提取（UAE）和纯化策略，从洋葱皮废料中回收高纯度的槲皮素，从而能够可靠地评估其对Meloidogyne incognita的杀线虫和促进植物生长的作用。使用UAE方法获得的槲皮素产量高于传统提取方法，这归因于关键工艺参数的系统性优化，包括溶剂浓度、提取时间和超声波强度[57]。超声波引起的声空化产生高剪切力，破坏植物细胞壁，从而增强溶剂渗透并增加细胞内多酚向提取介质中的转移[58]。随后的液-液分配进一步去除杂质，提高了槲皮素的回收率和纯度[57]。优化的UAE和选择性相分离的联合效应不仅提高了提取效率，还确保了槲皮素的结构完整性和分析纯度[59]。

光谱和色谱分析用于确认分离化合物的纯度和结构完整性。纯化后的槲皮素在UV-Vis光谱上显示出两个特征性吸收峰，分别位于260 nm和370 nm，对应于A环的苯甲酰基系统和C环的肉桂酰基系统[60]。这些峰源于典型的黄酮醇化合物的π→π*电子跃迁。370 nm处的强烈吸收是由于C2=C3双键和3-羟基黄酮发色团中的4-羰基的π-共轭作用，证实了槲皮素保持的flavan-4-one骨架[61]。这种平面、高度共轭的结构赋予了分子刚性，并促进了与生物大分子的π-π堆积和疏水相互作用，这可能有助于其报道的生物活性，尽管其多个酚羟基预计会限制其被动跨膜扩散[62][63]。分离化合物的FT-IR光谱在3294 cm-1处显示出宽吸收峰，对应于酚类O-H伸缩振动。1664 cm-1处的显著峰归因于黄酮醇羰基的C=O伸缩振动，而1518 cm-1和1455 cm-1处的峰与芳香C=C振动相关。此外，1385 cm-1附近出现的特征性酚类O-H弯曲振动与羟基取代的芳香环一致[64]。这些光谱特征总体上证实了分离槲皮素的结构完整性和高纯度[28]。在相同等渗条件下进行的HPLC分析显示，分离化合物有一个单一、尖锐且对称的峰，保留时间为11.72分钟，与槲皮素标准品的保留时间11.81分钟非常接近。几乎相同的保留时间、无共洗峰以及高对称性证实了化学纯度。峰面积归一化证实了纯度约为94%，证明了提取和纯化策略的有效性[65]。XRD图谱显示多个清晰且分辨良好的布拉格反射峰，半高宽（FWHM）值低于0.5°，表明了高程度的晶格有序性，确认了分离物的晶体性质。衍射图中不存在宽的漫反射峰，进一步表明纯化过程保留了槲皮素的固有晶体结构[66]。

杀线虫活性取决于分子结构、浓度和暴露时间[23]。功能上，分离出的槲皮素对M. incognita的卵孵化具有显著的抑制作用，并导致幼虫高死亡率。槲皮素破坏卵内成分的完整性，导致幼虫明显收缩，并抑制线虫的运动（图S4）。本研究的结果与先前报道的一致，表明槲皮素具有杀线虫潜力，在72小时内可导致70-80%的线虫卵和幼虫死亡[23][67]。类似的活性也已在其他植物寄生线虫中得到记录。例如，槲皮素的杀线虫效果比马特林更强。在Bursaphelenchus xylophilus中，马特林与低死亡率和62.5%的运动抑制相关，表明其作用方式为抑线虫[68]。同样，从Tagetes patula L.花提取的槲皮素在0.5%浓度下72小时后导致Heterodera zeae幼虫80%死亡[69]。从Ceriops tagal果实中提取的槲皮素在72小时后也表现出对H. zeae的强杀线虫活性，在不同浓度范围内（0.125–1%）导致78–90%的幼虫死亡，LC50为1.18 ppm[70]。这些发现表明槲皮素对不同线虫类具有广谱杀线虫活性，尽管其确切的作用机制尚需进一步阐明，但观察到的生物活性可能与多酚结构有关，这可能通过与角质层成分和必需蛋白质的相互作用来干扰线虫的生理过程[62][71]。

分子对接实验表明槲皮素与M. incognita的多种蛋白质具有显著的亲和力，包括超氧化物歧化酶、翻译调控的肿瘤蛋白、胞苷脱氨酶和calreticulin。槲皮素与翻译调控的肿瘤蛋白（TCTP）的结合亲和力为-8.1 kcal/mol，提示其相互作用可能通过干扰线虫的耐受性、生长调控和免疫抑制来影响线虫的生存和寄生。这种预测的相互作用与槲皮素的多酚结构相符，后者允许多个H键和π–π堆积相互作用与蛋白质结合口袋内的氨基酸残基结合[72]。类似地，其他植物来源的杀线虫化合物也显示出类似的结合亲和力。例如，从Acalypha indica中提取的苯甲酸、环辛基硅氧烷和3-异丙氧基-1,1,1,7,7,7-六甲基-3,5,5-四硅氧烷被预测对M. incognita蛋白目标具有强结合亲和力[73]。同样，从Ipomoea carnea中提取的新植二烯和2-氨基-2-甲基-1-丙醇，以及来自Achyranthes aspera的植醇、新植二烯和十七烷酸在对接研究中也表现出对M. incognita关键蛋白目标的强结合能[74][75]。值得注意的是，本研究观察到的杀线虫活性与先前的实验结果一致，表明微生物和植物来源的代谢物可以诱导根结线虫的高死亡率卵孵化和幼虫死亡。例如，内生细菌B. subtilis GEB-1产生的2,3-丁二醇在24小时内导致84%的幼虫死亡，并在1000 μg/mL浓度下完全抑制了M. enterolobii的卵孵化[76]。这些研究结果表明，槲皮素具有广谱杀线虫活性，尽管其确切的作用机制尚待完全阐明，但观察到的生物活性可能与多酚结构有关，后者可能通过与角质层成分和必需蛋白质的相互作用来干扰线虫的生理过程[62][71]。

抗氧化反应通过SOD活性进行了评估以提供初步支持；然而，这些结果应被视为支持而非确认所提出的机制。除了直接的杀线虫毒性外，据报道槲皮素还会影响线虫的行为。先前的研究表明，存在于番茄根分泌物中的槲皮素可以在M. incognita的J2阶段引起不同的趋化反应，效果取决于浓度[77][78]。在低浓度下，槲皮素可能作为信号分子发挥作用，而在高浓度下则可能作为抑制剂，突显了其在植物-线虫相互作用中的双重作用[71][78]。槲皮素处理减少了线虫侵染并促进了番茄生长，表现为株条、根长和生物量的增加。尽管这些反应部分可能是由于减轻了线虫引起的胁迫，但先前的研究表明槲皮素也可以调节植物生长。其他生物活性化合物也观察到了类似的双重效应，例如非anol可以减少线虫数量同时促进植物生长[79]，而Xenorhabdus nematophila的次级代谢物（セドヘプツロース7-磷酸和二苯基磷酸）显著抑制了线虫并促进了番茄生长[80]。外源施用5 μmol L-1的槲皮素通过提高幼苗活力、叶绿素含量和抗氧化酶（包括超氧化物歧化酶）缓解了Apocynum pictum和A. venetum种子中的甘露醇诱导的渗透压胁迫[81]。同样，叶面施用5%的槲皮素衍生物在玉米（Zea Mays L.）中增强了抗氧化能力、净光合速率、气孔传导性和叶绿素积累[82]。当与有益微生物联合使用时，槲皮素还报告了增强疾病抑制和植物生理特性的效果。例如，Bacillus consortium（Bacillus velezensis菌株BS6、Bacillus thuringiensis菌株BS7、Bacillus fortis菌株BS9）与槲皮素的联合应用将腐霉病指数降低了69%，并改善了番茄生长参数[83]。作为双重功能分子，槲皮素在番茄植物中既可作为诱导剂或信号分子，促进与有益微生物的共生相互作用，并通过苯丙烷酸盐途径激活防御反应[84][85]。

M. incognita的侵染在番茄植物中引起了显著的生物化学变化。我们的研究表明，槲皮素最初提高了根部的可溶性蛋白水平；然而，由于线虫活动导致的养分耗尽，这些水平随后下降[86]。同样，槲皮素处理过的植物中酚类化合物的积累增加是由于它们参与了不相容的植物-线虫相互作用。这些酚类化合物有助于抗菌防御[54]。未处理植物中PO活性的抑制表明在线虫胁迫下氧化防御受损，而在槲皮素处理过的植物中观察到其显著增加可能与木质化有关，从而限制了线虫的渗透[87]。此外，PPO和PAL活性的增加是由于苯丙烷酸盐途径的激活，有助于系统抗性和木质素生物合成[85][88]。槲皮素处理过的植物中酸性磷酸酶活性的增加可能有助于提高磷的动员、能量代谢并增强植物的防御能力[89]。观察到的防御相关酶（PAL、PPO、PO/POD、SOD、酸性磷酸酶）活性的增加，以及酚类含量的增加，表明在线虫侵染下发生了增强的应激相关代谢反应。这些酶被广泛认为是由各种生物和非生物因素引发的植物应激和防御反应的通用标志[90][91]。然而，目前的研究结果反映了相关的生物化学调节，而不是特定抗性途径激活的直接证据。山柰酚处理过的植物表现出生长改善，这可能是由于减少了线虫侵染，从而减轻了根部损伤，进而提高了养分和水的吸收。[92] 随着M. incognita侵染程度的增加，粗SOD活性逐渐升高，表明番茄根部出现了氧化应激。然而，在高侵染水平下，蛋白质标准化SOD活性的下降反映了酶效率的降低，这是由于蛋白质变性或代谢紊乱所致[93]。这种双相模式证实了SOD作为线虫诱导损伤的代表性生物标志物的作用。这些生化变化揭示了山柰酚通过上调抗氧化酶和防御相关酶来对抗M. incognita引起的应激的保护作用。因此，本研究通过计算机模拟和体外实验评估了山柰酚（一种生物活性黄酮类化合物）对根结线虫M. incognita的潜在效果。分子对接结果显示，山柰酚与选定的线虫靶蛋白（包括SOD、翻译调控的肿瘤蛋白、胞苷脱氨酶和钙网蛋白）具有良好的结合相互作用，支持其在抑制线虫方面的潜力。洋葱皮是一种全年大量产生的农业工业废弃物，为山柰酚的提取提供了可持续的来源。然而，这种方法的经济可行性取决于加工效率、溶剂使用量和能耗。整合预处理、提取、纯化和溶剂回收的大规模工艺模型展示了其在循环经济中的可扩展性，为工业化提供了可行的途径[94]。本研究中使用的山柰酚浓度经过优化，以证明其在实验室和温室条件下的驱线虫效果。蚯蚓毒性评估显示，山柰酚的不良反应明显低于传统农用化学品，表明其作为环保替代品的潜力[95]。然而，由于氧化反应和环境因素（如pH值、温度和微生物活动）的影响，山柰酚在土壤中的持久性有限，这些因素会影响其生物利用度[96]。此外，在土壤施用后，山柰酚可以与土壤颗粒相互作用，通过吸附作用改变其功能行为，并通过还原溶解和络合机制增强锰（Mn）的释放，从而促进养分的释放[97]。为了克服这些限制，需要优化基于山柰酚的配方，以提高其在土壤中的稳定性、持久性和释放控制，以有效管理M. incognita[98]。此外，详细评估配方的稳定性、经济可行性、毒性和可扩展性对于支持基于山柰酚的驱线虫产品的大规模应用至关重要。虽然这些发现提供了初步的生物学证据，但需要在多种田间条件下进行进一步验证，以确定其实际应用性。

5. 结论

本研究证明山柰酚对M. incognita具有显著的驱线虫活性，这一点从其对第二阶段幼虫和卵孵化的抑制作用中得到了证明。生化分析进一步显示，山柰酚调节了关键的防御和应激相关酶，支持其在缓解线虫引起的植物生理紊乱中的作用。随后的分子对接分析显示，山柰酚与选定的线虫靶蛋白之间存在强烈的相互作用，这与实验观察到的生物活性一致。总体而言，这些发现突显了山柰酚作为一种生物衍生生物活性化合物在線蟲管理中的潜力。

**作者贡献声明**

Ajay Govindaraj：撰写——原始草稿、软件使用、方法论设计、数据分析。
Raja Kalimuthu：撰写——审阅与编辑、监督、研究实施、资金获取、概念构思。
Lokesh Thirumurugan：方法论设计、数据分析。
Boominathan Parasuraman：监督、研究实施。
Johnson Iruthaswamy：监督、研究实施。
Deeikshana Thirunavukkarasu：数据处理可视化、软件使用、方法论设计、数据管理。
Marimuthu Subramaniam：监督、研究实施。
Kannan Pandiyan：研究实施、概念构思。
Karthikeyan Muthusamy：撰写——审阅与编辑、验证、监督、研究实施、概念构思。

**未引用的参考文献** [99], [100], [101], [102]

**利益冲突声明**

作者声明没有可能影响本文报道工作的财务利益或个人关系。

**资金情况**

本研究未收到任何公共机构、商业机构或非营利组织的财务支持。