在野外条件下，使用prohexadione-calcium和acibenzolar-S-methyl控制‘WA 38’品种幼苹果树上的枝梢枯萎病

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Control of shoot blight in young apple trees of the cultivar ‘WA 38’ under field conditions using prohexadione-calcium and acibenzolar-S-methyl

　　艾娜·巴罗|萨拉·蒂安娜·杜邦
华盛顿州立大学农业、人类和自然资源科学学院，果树研究与推广中心，温纳奇，华盛顿州98801，美国

**摘要**
由Erwinia amylovora引起的火疫病仍然是华盛顿州苹果生产的主要威胁。尽管大多数感染发生在开花期间，但开花后的时期也具有高风险，因为生长中的新梢在受到风、雨或冰雹的伤害后可能会被感染。本研究评估了系统性获得抗性（SAR）诱导剂acibenzolar-S-methyl（ASM）和植物生长调节剂prohexadione-calcium（ProCa）在控制‘WA 38’苹果树新梢火疫病方面的有效性。2022年、2023年和2024年进行的田间试验评估了疾病的发生率和严重程度，并量化了六个与防御相关的基因（PR1、PR2、PR4、PR14、JAA和NIMIN2）的表达情况，以确定植物的防御激活情况。ProCa一致减少了新梢火疫病的发生率和严重程度，并显示出与植物防御反应相关的基因强烈且持续的上调。ASM和ProCa的低剂量联合使用表现出叠加效果，增强了与防御途径相关的基因表达和疾病控制效果。这些发现表明，ProCa单独使用或与ASM联合使用是‘WA 38’苹果树综合火疫病管理的有希望的工具。

**1. 引言**
火疫病是由细菌病原体Erwinia amylovora引起的，是影响苹果和梨作物最重要的疾病之一。该病在世界许多苹果生产地区都有广泛的影响，在美国主要的苹果生产区之一华盛顿州尤为严重[1]。在温暖湿润的春季，这种有利于病原体的条件下，火疫病的爆发可能非常严重，2017年和2018年时影响了华盛顿州12-17%的苹果种植面积[2]。火疫病在美国造成的经济损失巨大，据估计，当疾病爆发时，每年的损失超过1亿美元[3]。目前的火疫病管理策略主要集中在通过施用抗生素、生物控制剂（如Aureobasidium pullulans）和矿物质化合物（如铜）来预防开花期的感染。这些产品通过直接抑制病原体或激活植物的先天防御机制来发挥作用[4],[5],[6]。虽然在实现替代的集成管理计划以控制开花期感染方面取得了很大进展[7],[8]，但在开花后时期仍存在关键的管理空白。这一时期特别脆弱，因为生长中的新梢由于风、雨或冰雹造成的物理损伤而极易被感染，而且溃疡和受感染的花朵可以作为E. amylovora病原体的来源，通过昆虫、风或雨水传播[9],[10]。为了保护这一阶段的新生组织，种植者通常依赖反复施用抗生素和含铜产品。然而，这些产品并不能提供完全的保护，为了避免抗性的产生，不建议多次重复使用。一些在开花期使用的替代有机产品（如过氧乙酸/过氧化物制剂）已被考虑用于开花后时期，但它们可能会导致果实锈斑，从而限制了其使用[11]。

鉴于这些挑战，新的研究集中在植物防御诱导剂和植物生长调节剂（PGRs）增强植物自身抗感染能力的潜力上。特别是acibenzolar-S-methyl（ASM），一种众所周知的系统性获得抗性（SAR）诱导剂，以及prohexadione-calcium（ProCa），一种据报道具有抑制火疫病活性的PGR，在苹果生产系统中进行了研究[12],[13],[14],[15],[16]。尽管这两种化合物在减少疾病发生率方面显示出了潜力，但仍需要进一步研究以优化其使用方法，确定最佳剂量、施用时间和策略。此外，探索这两种产品的联合应用也很有意义，因为它提供了比单独使用ASM更具成本效益的替代方案，同时减少了高剂量ProCa带来的生长抑制风险[17],[18]。

重要的是，不同的苹果品种对这些处理的响应仍有待探索。由于内在的防御系统和生长习性的差异，不同的苹果基因型对化学诱导剂和PGRs的响应可能有所不同。例如，通过ASM处理取得的疾病抑制效果不仅取决于品种的启动能力，还取决于诱导的防御是否达到有效保护的阈值[19]。在评估植物防御诱导剂和PGRs的类型和剂量是否适合特定品种的火疫病管理策略时，了解基础防御水平和防御反应的诱导性是至关重要的。将这些类型的产品与携带多个参与不同防御途径的QTL的基因型结合使用，可能会提供一种特别有前景且可持续的疾病控制方法[20]。这在年轻的果园开花后时期尤为重要，因为此时通常会促进树木生长以促进树冠发育，但这会增加树木对火疫病的敏感性。这一发育阶段在促进营养生长和增强抗病性之间存在生理上的权衡[21]。像ASM这样的处理可以上调防御途径，但可能会以牺牲生长为代价，而ProCa可能会抑制生长以限制敏感性，但可能抑制树冠发育[22]。这些权衡不仅取决于处理方式，还取决于品种，因为遗传背景会影响树木在压力下的资源分配[23],[24]。

尽管人们努力寻找对该疾病的抗性，但大多数商业苹果品种仍然易受火疫病的影响[3]。2017年，华盛顿州立大学育种计划开发出了新的苹果品种‘WA 38’，这是一种高质量的、以消费者为导向的苹果品种[25]。自那时起，华盛顿州种植了超过2000万棵这种苹果树，使其成为该州主要品种之一，其中包含了大量的幼树[26]。‘WA 38’是‘Honeycrisp’和‘Enterprise’的杂交品种，结合了两种品种的特性[27]，这种独特的遗传背景可能会影响其生理和防御反应。虽然最初被归类为对火疫病具有中等抗性，但随后的田间观察显示，在高疾病压力下其表现不稳定[28]。这种变异性凸显了适应不同环境条件下的品种特异性疾病管理策略的重要性。

本研究的主要目的是评估不同ASM和ProCa处理的有效性，比较多种剂量和施用方法，在关键的开花后时期减少‘WA 38’苹果树新梢火疫病的发生率和严重程度。此外，这项工作还旨在通过量化六个与防御相关的基因（PR1、PR2、PR4、PR14、JAA和NIMIN2）的表达来探索植物防御反应的激活情况。这些发现将有助于开发优化的、基于证据的苹果火疫病管理方案。

**2. 材料与方法**
**2.1. 田间试验**
田间试验于2022年、2023年和2024年在‘WA 38’苹果树上进行，这些苹果树于2021年种植在Columbia View果园（地址：48 Longview Rd., East Wenatchee, WA 98802-8283），每公顷种植2900棵树。实验采用随机完全区组设计，设置了3个生物重复区组。每个区组包含7个处理小区，每个小区包含5棵树。使用随机数生成器在每个区组内随机分配处理，以确保空间分布的公平性。为了最小化处理之间的干扰，每个小区内的小区之间至少间隔了4棵未经处理的缓冲树。所有选样的树木都符合一致的标准，包括活力、树冠大小和无可见的压力症状，以减少生物学变异。处理包括：70.1和140.1 g/ha的ASM（Actigard? 50WG），140.1和420.3 g/ha的ProCa（Kudos? 27.5 WDG），以及70.1 g/ha的ASM和140.1 g/ha的ProCa的联合处理。作为阴性对照处理，还施用了清水处理。根据制造商的建议，使用Stihl SR420背包喷雾器将产品喷洒在整个树上，喷雾量调节至每公顷935.4升。此外，还包括了140.1 g/ha的ASM浸渍处理（相当于每棵树0.05克）。

**2.2. 基因表达分析（2022年和2023年）**
**2.2.1. 田间样本采集**
2022年，每个重复处理从5棵树的新生叶子中采集2个新梢尖端作为样本；2023年，从每个重复处理的3棵未接种病原体的树中采集样本。使用无菌手套和剪刀切割新梢尖端，并将其放入装有干冰的袋子中，在野外保存。带回实验室后，样本被保存在-80°C下直至处理。

**2.2.2. 样品处理以获得互补DNA（cDNA）**
从果园采集的叶片样本在冷却的研钵和杵中用液氮研磨。根据制造商的推荐，使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，德国希尔登）从约200毫克研磨组织中提取总RNA，并在转移到QIAshredder旋柱之前添加了一个离心步骤（15,000 rpm下离心2分钟）。使用NanoDrop光谱仪（Thermo Scientific，美国沃尔瑟姆）测定RNA浓度和纯度。为了去除任何污染的基因组DNA（gDNA），将RNA调整至200 ng/μl，并使用Turbo DNA-free Kit（Invitrogen，美国沃尔瑟姆）进行DNase处理。根据制造商的推荐，使用SuperScript? III逆转录酶（Invitrogen，美国沃尔瑟姆）和Oligo (dT)20引物从0.96 μg RNA中生成第一链cDNA。

**2.2.3. 定量实时PCR（qPCR）**
定量实时PCR分析在20 μL反应体积中进行，其中包含2 μL cDNA、1 μL正向和反向引物（10 μM）、6 μL无核酸酶水和10 μL SYBR? Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，美国沃尔瑟姆）。在CFX Connect Real-Time PCR系统（BioRad，美国赫拉克勒斯）上进行反应。相对定量热循环条件为：95°C变性5分钟，随后是41个循环，每个循环包括10秒的95°C变性、30秒的60°C退火和30秒的72°C延伸。在最后一个qPCR循环后进行熔解曲线分析（从65°C到95°C，每间隔0.5°C进行5秒），以验证扩增子的特异性。每个qPCR实验还包括非模板对照，以评估试剂的纯度。

分析了以下参与植物防御机制的基因：NIMI相互作用蛋白2（NIMIN2）、香叶素诱导蛋白样蛋白（JAA）、致病相关蛋白1（PR1）、致病相关蛋白2（PR2）、致病相关蛋白4（PR4）、致病相关蛋白14（PR14）以及作为参考对照的组成β-actin（β-actin）。选择这些基因是因为它们代表了植物防御反应不同分支的关键标志物。PR1被认为是植物防御系统的指示器，具有多种功能之一是降解内源性底物以产生诱导剂，从而触发防御反应[29]。PR2是一种β-1,3-葡聚糖酶，据推测它可以降解入侵真菌病原体的细胞壁[30]，同时像PR1一样，通过降解内源性底物产生诱导剂来引发防御反应[31]。PR14是一种脂质转移蛋白，已被描述为参与植物对生物胁迫的防御，表现出抗真菌和抗氧化活性[32],[33]、抗菌活性[34]，以及与脂质衍生分子的相互作用以触发远距离信号传递[35],[36]。JAA是一种类似茉莉酸诱导的蛋白质，其功能尚不明确，但与茉莉酸有关，茉莉酸是一种调节植物生长、发育和防御的重要植物激素。

为了定量目标基因，使用了特定的寡核苷酸（5’到3’）（表1），并且对每个基因系统内的拷贝数范围进行了线性评估，同时也计算了每个曲线的效率（效率范围从87.68%到99.46%，R2 > 0.98）。基因表达的相对定量采用了ΔΔCT方法[37]，并且相对表达值以β-actin基因作为内部对照进行了标准化。图中展示了log2(倍数变化)的值，其中倍数变化是处理组与水处理对照组之间基因表达的差异[38]。

表1. 用于逆转录定量实时PCR (RT-qPCR) 分析的基因和引物，以量化‘WA 38’苹果树中的这些基因表达水平。

**目标基因及引物描述**

| 基因 | 引物 |
|-----------------|------------------------|
| NIMIN2 | NIMI相互作用蛋白2 |
| NIMIN2-q1 | ACGGCGTTGTCTTGTCAGAT |
| NIMIN2-q2 | ACGTGACCTCCGTTACGTTC |
| JAA | 类茉莉酸诱导蛋白 |
| JAA-q1 | GGGACCACAGTGGGCATATC |
| JAA-q2 | GTGGGTTTTGGTTCTTCGG |
| PR1 | 与病原体相关的蛋白1 |
| PR1-q1 | CTTGACGTGGGATGACAATG |
| PR1-q2 | AGTGCTCATGGCAAGGTTT |
| PR2 | 与病原体相关的蛋白2（β-1,3-葡聚糖酶） |
| PR2-q1 | ACACTGACCCTGCAAACCAAT |
| PR2-q2 | GCAAGGTCTATGCTACCAGGG |
| PR4 | 与病原体相关的蛋白4（barwin结构域几丁质酶） |
| PR4-q1 | CATTGGGACAAAGTGCGACG |
| PR4-q2 | CAGTAGGCACTTACTGCCCG |
| PR14 | 与病原体相关的蛋白14（脂质转移蛋白） |
| PR14-q1 | GCTGCACAAAACACCACGAT |
| PR14-q2 | GGACAAGGAGAGCCACAGAC |
| Actin | β-actin（参考基因） |
| Actin-q1 | CTATGTTCCCTGGTATTGCAGACC |

**2.4. 数据分析**
基因表达数据的统计显著性是使用REST2009软件确定的，该软件通过配对重分配的随机化检验来评估处理组与对照组之间的基因表达差异[41]。使用GraphPad Prism v 9进行了主成分分析（PCA），以评估处理对所有基因表达的影响。分析使用了两年（2022年和2023年）每个处理时间和所有生物重复的log2(倍数变化)值。使用SAS v 9.4的线性混合模型（MIXED）方差分析对两年所有生物重复的log2(倍数变化)值进行了统计分析，以确定处理对每个基因总体表达的影响。时间被视为重复测量变量。多重均值比较是根据Tukey的诚实显著差异检验在P值≤0.05的情况下进行的。

**2.3. 枪枝枯萎病控制（2023年和2024年）**
**2.3.1. 感染E. amylovora**
在首次处理后11天，从5棵树中的2棵树各选取2个枝梢，用E. amylovora菌株Ea 153（浓度为1x10^8 CFU/ml）进行浸染[28]。选择长度通常大于15厘米的2个生长活跃的枝梢进行接种，在接种前先做好标记。用剪刀沿中脉将枝梢末端的2片叶子剪开，然后将切口浸入调整至1x10^8 CFU/ml的E. amylovora菌悬液中（2023年为5.2x10^7 CFU/ml，2024年为1.5x10^8 CFU/ml）。接种期间，菌悬液需保存在冰上并避免直接阳光照射；在不同品种和生物重复之间补充菌悬液。接种后12至36小时使用喷灌增加树冠的湿度。

**2.3.2. 枪枝枯萎病评估**
评估了每种处理方法的枝枝枯萎病发病率和严重程度。发病率是通过将枯萎枝梢的数量除以接种的枝梢总数计算得出的。每个接种枝梢的枯萎病严重程度是在接种后16-17天通过测量总枝梢长度和坏死病灶长度来评估的，计算方法如下：使用消毒过的工具迅速去除病灶，留下12厘米的残端。

**2.3.3. 数据分析**
使用GraphPad Prism v 9进行了双因素方差分析（ANOVA），以确定处理方法和年份对枝枝枯萎病发病率和严重程度的影响。为了评估处理组与水处理对照组之间的差异，我们在P值≤0.05的情况下进行了Dunnett的多重比较检验（严重程度数据经过 arcsin(sqrt(y/100) 转换以满足正态性和方差同质性要求）。2022年和2023年，使用 reverse transcription quantitative real-time PCR（RT-qPCR）分析方法，研究了年轻‘WA 38’苹果树在喷洒或浇灌acibenzolar-S-methyl（ASM）、prohexadione-calcium（ProCa）或两者结合处理后，与防御相关基因（JAA、PR1、PR2、PR4、PR14、NIMIN2）的表达水平。相对定量采用ΔΔCT方法，每种处理均与其对应的水处理对照进行比较。同一基因图中的不同字母表示根据Tukey的诚实显著差异测试（P ≤ 0.05）处理之间存在显著差异。注释：ASM 1，70.1 g/ha；ASM 2，140.1 g/ha；ProCa 1，140.1 g/ha；ProCa 2，420.3 g/ha。

讨论
本研究展示了ASM和ProCa在减轻苹果火疫病感染方面的能力。SAR诱导剂和PGR（如ASM和ProCa）越来越多地被用于综合病害管理实践中。多项研究表明，ASM和ProCa对控制花期和枝条期火疫病有积极效果[14]、[15]、[16]、[22]、[42]、[43]、[44]。ASM作为SAR诱导剂而广为人知，它能在细胞间隙激活病原体相关的蛋白质（PR蛋白），模拟水杨酸的作用[45]。此外，PGR ProCa可促进皮质薄壁组织细胞壁增厚，形成物理屏障，减缓病原体的感染和系统性传播[42]、[46]。在本研究中，我们评估了ASM和ProCa在田间条件下控制火疫病，特别是预防‘WA 38’品种枝条期火疫病的潜力。本研究的独特之处在于对六个防御相关基因进行了基因表达定量分析，从而了解了它们诱导植物防御反应的能力。

在连续两个生长季节中，以420.3 g/ha的剂量施用ProCa可显著控制‘WA 38’品种的枝条期火疫病，表现为发病率和病情严重程度的降低（图2）。此外，观察到的控制效果与大量与防御途径相关的基因上调相关：JAA、PR1、PR2、PR4和PR14（图7）。一些田间研究已经证明了使用ProCa在花前和花后施用可以控制火疫病，但这些研究将其与皮质薄壁组织细胞壁增厚联系起来，而非防御反应的诱导[16]、[42]。ProCa上调防御相关基因的能力已在受控条件下（温室、生长室）得到证实，并与田间观察到的病害控制效果相一致[39]、[47]、[48]。我们的发现表明，ProCa在田间控制火疫病的同时也伴随着植物防御反应的诱导。此外，处理后14天就观察到防御相关基因的显著上调，这与先前研究的结果一致，即ProCa需要10到14天才能见效[16]。

较低剂量的ProCa（140.1 g/ha）未能显著控制枝条期火疫病。尽管与高剂量相比，相同基因有显著上调，但这种上调在不同时间点的频率较低（图3和图4），这表明防御反应的时间稳定性对于有效控制火疫病可能是关键。其他研究也显示了ProCa的剂量-反应关系，即较低剂量下的枝条期火疫病控制效果较差[43]。例如，A?imovi?等人[43]报告称，在田间条件下，较低剂量或最小剂量的ProCa提供的枝条期火疫病控制效果较弱，特别是在快速枝条生长稀释了保护效果的情况下。Slack等人[49]进一步发现，在较低剂量的ProCa下，皮质薄壁组织细胞壁增厚减少。这些发现共同表明，ProCa诱导的反应的强度和持久性取决于剂量，低于最佳施用率可能无法提供足够的保护。这些结果强调了优化施用率以实现可靠病害控制的必要性。

在已建立的果园中，使用ProCa可以作为综合火疫病和作物管理措施。ProCa是一种PGR，通过抑制 gibberellin 的生物合成来减缓枝条的生长，因此除了控制枝条期火疫病外，在花瓣脱落期施用该产品还可以减少树势[3]、[50]。在‘WA 38’品种中，过强的树势可能是导致绿斑病发展的一个因素，这种病害表现为苹果表皮出现深绿色晕圈，受影响区域下方有坏死、木栓化和氧化的组织[51]。在‘WA 38’品种的花瓣脱落期施用ProCa可以减少冬季修剪时去除的枝条量，并有助于生产更大、更均匀的果实[50]。

据报道，施用ASM可以上调β-1,3-葡聚糖酶等防御相关酶[12]，并诱导PR1等基因的表达[14]、[15]。尽管在我们的研究中观察到PR1、NIMIN2和JAA的上调，但在大多数时间点上与水处理对照相比并不显著。2022年和2023年，在7天时均未观察到PR1、JAA或NIMIN2的显著表达，这与需要在田间多次施用该产品才能观察到显著效果的事实相符[52]。ASM处理后防御相关基因诱导的基因型特异性差异可能是我们研究中观察到的表达水平低于之前报告的原因之一[19]。施用方法也会影响防御相关基因的激活。通过树干涂布施用的ASM效果优于浇灌施用[15]，而在另一项研究中，浇灌施用的PR2表达水平高于叶面喷施[53]。

无论剂量或施用方法（叶面喷施或浇灌）如何，使用ASM均未观察到显著的枝条期火疫病控制效果，无论是发病率还是严重程度。正如Marolleau等人[19]所指出的，ASM在抑制病害方面的效果可能取决于诱导的防御反应是否超过某个临界阈值，这受到植物对处理的响应性和其基础防御水平的影响。在我们的案例中，对‘WA 38’品种的年轻苹果树施用ASM并未随着时间的推移持续或强烈诱导选定的防御相关基因，这可能解释了在田间条件下未观察到明显病害控制的原因。此外，田间条件下的ASM效果可能还受到影响水杨酸依赖性信号途径的环境因素的进一步限制。这与广泛证据一致，即在非受控环境中诱导的防御反应表现不稳定，其效果通常低于实验室或温室研究[54]。

我们的试验还测试了低剂量ProCa和ASM的组合效果，结果显示与水处理对照相比，枝条期火疫病的严重程度显著降低（图2）。由于在所有时间点上，结合使用这两种产品时与单独使用任一种产品时相比，有相同或更多数量的防御相关基因显著上调，因此组合处理对防御相关基因诱导的效果似乎具有叠加效应。这与其他使用ProCa和植物诱导剂与ASM结合的研究结果一致，这些研究表明它们对防御相关基因的表达具有协同效应[19]、[49]、[55]。在我们的案例中，这种协同效应有助于在田间有效控制枝条期火疫病，提供了比单独使用ASM更具成本效益的选择。尽管严重程度的降低与单独使用420.3 g/ha的ProCa效果相同，但最新研究表明，这种组合处理不会影响树的生长[49]或冠层发育和果园建立[18]，特别是在年轻的高密度果园中特别有益。此外，ProCa的应用还与减少再开花和改变作物负载动态有关[56]、[57]，将其与ASM结合使用可以缓解这些效应，改善作物负载管理[18]。

如前所述，树龄和品种会影响基础防御水平、诱导反应的强度以及总体对火疫病的敏感性，从而可能影响我们研究结果的普遍性[28]、[58]。因此，尽管先前的研究已经证明这些产品在成熟苹果和梨果园中对火疫病有抑制作用，但ASM或ProCa调控防御激活的程度在不同苹果和梨品种之间仍不清楚[54]。未来结合多种品种和果园年龄的研究将对验证这些结果的广泛适用性以及完善多样化的商业生产系统的管理建议至关重要。

结论
总之，当前研究表明，ProCa特别是在高剂量下，在田间条件下对‘WA 38’苹果树的枝条期火疫病控制有效。这种效果与其诱导植物防御途径的能力相关，并能随时间持续发挥作用。虽然单独使用ASM在实验条件下无效，但与其结合使用ProCa可以增强植物防御的激活并改善枝条期火疫病的控制，表明具有协同效应。鉴于ProCa在需要减少过量树势时的潜在益处（例如，在采用顶接法时），在花后期间使用它代表了一种综合的火疫病和作物管理方法。在新建立的果园中，联合使用低剂量的ProCa和ASM可能是一个合适的替代方案，尤其是在促进快速树生长的情况下。

作者贡献声明
Sara Tianna DuPont：撰写 – 审阅与编辑、项目管理、方法学、调查、资金获取、概念化。
Aina Baró：撰写 – 审阅与编辑、原始草稿撰写、方法学、调查、正式分析、数据管理。

利益冲突
作者声明，本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

数据可用性声明
研究中呈现的原始贡献包含在文章/补充材料中。进一步的咨询可以联系对应的作者。

资助
本研究得到了美国国家食品和农业研究所（Specialty Crop Research Initiative）资助的“综合火疫病管理系统”项目（2020-51181-32158）的支持。