利用1H NMR/LC-PDA-MS技术从Keteleeria pubescens中靶向分离出先前未被描述的fortunefuroic酸类三萜化合物，并对其对ACL（黑色素合成酶）的抑制作用进行了评估

《Phytochemistry》：Targeted isolation of previously undescribed fortunefuroic acid-type triterpenoids from Keteleeria pubescens using 1H NMR/LC-PDA-MS and assessment of ACL Inhibition

　　

池春静|赵泽宇|臧毅|李聪|李嘉|黄东|孙鹏|熊娟|Choo Yeun-Mun|胡金凤

中国浙江省台州市台州大学药学院濒危植物可持续利用重点实验室，邮编318000

摘要

Keteleeria 是松科（Pinaceae）中的一个小型针叶属植物。最近研究表明，fortunefuroic acids（FFAs）是该属植物的特征性代谢产物。FFAs 是一类独特的三萜类化合物，其侧链中含有呋喃酸结构。通过¹H NMR 和 LC-PDA-MS 技术引导的分离与鉴定方法，从中国特有的稀有针叶植物 Keteleeria pubescens 的可再生叶片和枝条中分离出了四种此前未描述的 FFAs 类化合物（1–4，分别为 fortunefuroic acid Q–T），以及一种已知的 FFAs 类化合物（5，即 fortunefuroic acid H）。化合物 1–3 被鉴定为 cycloart-16,23,25(27)-trien-26-oic 酸的衍生物，而化合物 4 被鉴定为 3-oxo-lanost-16,23,25(27)-trien-26-oic 酸。通过结合光谱技术及实验数据与计算电子圆二色性数据的比较分析，阐明了它们的化学结构。化合物 3 和 4 对 ATP-citrate lyase (ACL) 具有抑制作用，这是一种治疗高脂血症及相关代谢疾病的有潜力药物靶点，其 IC₅₀ 值分别为 16.6 和 17.2 μM。通过分子对接研究揭示了这些化合物在 ACL 酶活性位点上的结合机制。这些 FFAs 的发现进一步强调了它们在 Keteleeria 属中的分类学意义。总体而言，这些研究成果拓展了天然三萜类化合物的结构多样性，为开发针对 ACL 相关疾病的治疗药物提供了潜在的先导化合物，并为濒危植物的可持续利用与科学保护提供了新的见解。

引言

植物来源的天然产物（NPs）已被广泛认为是发现创新治疗药物的重要来源（Butler 等人，2026a, 2026b；Domingo-Fernández 等人，2024；Newman 和 Cragg，2020；Rodrigues 等人，2016；Wang 等人，2024；Xie 等人，2025）。值得注意的是，从稀有和濒危植物（REPs）中分离出的 NPs 通常具有更大的结构多样性和更强的药用潜力（Ibrahim 等人，2013）。这些发现突显了继续探索 REPs 作为珍贵未发现药物及其他潜在有用生物活性化合物来源的价值（Fox，1984）。根据国际自然保护联盟（IUCN）红色名录的数据，目前全球约有 34% 的针叶植物物种面临灭绝威胁（IUCN，2026）。作为主要的针叶植物家族，松科（Pinaceae）历来被认为是十大产药植物家族之一（Zhu 等人，2011）。因此，亟需进一步研究来自可持续采伐的濒危松科植物的生物活性代谢产物。Keteleeria 是松科中的一个小型残遗针叶属（Huang 等人，2021；Shi 等人，2022；Xiang 等人，2025；Yuan 等人，2025；Zhu 等人，2024）。该属主要分布于中国，具有重要的生态和经济价值；然而，大多数物种目前受到栖息地丧失、破碎化及自然再生能力差的威胁（IUCN，2026；Fu 和 Jin，1992）。最近对几种濒危 Keteleeria 物种（如 K. fortunei 和 K. hainanensis）的植物化学研究发现了 fortunefuroic acids（FFAs），这是一类独特的 C₃₀ 三萜类化合物，其侧链含有罕见的呋喃酸结构（Zhao 等人，2023, 2024, 2025）。由于 FFAs 具有复杂的多环结构、独特的结构特征以及对细胞代谢关键酶 ATP-citrate lyase (ACL) 的显著抑制作用，它们在合成化学领域引起了越来越多的关注（Wang 等人，2026）。

随着分离技术和分析方法的进步，利用 NMR （Guo 等人，2026；Mai 等人，2025；Rallis 等人，2024；Tudi 等人，2026；Wei 等人，2024；Zhao 等人，2022）和 HPLC-UV/PDA （Wang 等人，2025；Zhou 等人，2022）技术已实现了靶向天然产物的分离与鉴定。在我们之前的研究中，通过 LC-MS 技术快速鉴定了 Sinocalycanthu 属植物中的 chimonanthine 类生物碱（Ma 等人，2018）和 Lycopodium 属植物中的石松碱（Tang 等人，2019）。近年来，基于 LC-MS/MS 的分子离子网络（MoIN）策略进一步促进了靶向化合物的发现（Wan 等人，2026；Wu 等人，2024；Xiong 等人，2021；Zhou 等人，2023, 2024, 2025a）。对于 FFAs，最初建立了整合的 NMR/EI-MS/LC-PDA-ESIMS 分离策略，以识别该类化合物特有的 23,27-epoxy-23,25(27)-dien-26-oic 酸（即呋喃酸）结构（Zhao 等人，2025）。在 FFAs 的 ¹H NMR 光谱中，与该结构相关的两个烯丙基质子信号（δ_H-24：约 6.36 ppm；δ_H-27：约 7.97 ppm）非常一致且易于区分。此外，还建立了先前分离出的 FFAs 的 UPLC 快谱图，显示出约 λ_max 245 nm 的特征性紫外吸收峰和 464–468 Da 的分子量范围，从而能够快速鉴定 FFAs。

已有研究表明，分离出的 FFAs 可作为 Keteleeria 属的化学分类标记物（Zhao 等人，2025），且该属内的其他物种也可能产生结构相关的代谢产物。为了进一步验证整合的 ¹H NMR/LC-PDA-MS 分离策略的有效性并鉴定新的 FFAs，选择了 K. pubescens W. C. Cheng & L. K. Fu 作为研究对象。该物种种群数量稀少，分布零散（IUCN，2026；Han 等人，2025），并被列入 1992 年发布的《中国植物红皮书》（CPRDB）中的中国特有物种（Fu 和 Jin，1992）。2021 年，K. pubescens 被正式列为中国的‘二级’保护物种（国家林业局和农业部，2021）。最近，从与 K. pubescens 共生的内生菌 Diaporthe RYF-Br-5 中发现了抗菌性 10 元内酯衍生物 diaporolide 和几种已知的聚酮类化合物（Yan 等人，2025）。然而，K. pubescens 本身的化学成分仍大部分未被探索。在本研究中，我们分析了来自浙江省台州市的可再生枝条和叶片的 90% MeOH 提取物。本文报告了这些化合物的 ¹H-NMR/LC-PDA-MS 分离、结构鉴定及其对 ACL 的抑制活性。这项工作属于“中国特有稀有和濒危植物的植物化学与生物学研究”系列（第四十七部分、第四十八部分和第四十九部分的内容分别见 Wan 等人，2026；Zhou 等人，2026；Zhao 等人，2026）。

章节片段

结果与讨论

将 K. pubescens 干燥枝条和针叶的 90% MeOH 提取物依次用石油醚（PE）、EtOAc 和 n-BuOH 进行分离。EtOAc 浓缩物经过硅胶柱层析（CC），得到六个组分（Fr. 1–Fr. 6）。记录 EtOAc 浓缩物及其各组分的 ¹H NMR 光谱，以监测分离过程并指导后续的分离步骤。在 EtOAc 浓缩物及其组分中观察到了特征性的 FFAs 信号（δ_H-24: 6.34–6.37 ppm；δ_H-27: 7.95–7.98 ppm）。

结论

作为由六個异戊二烯单元衍生的结构最多样化的代谢产物亚类，植物三萜类化合物表现出广泛的多样性。Fortunefuroic acids（FFAs）是一类独特的三萜类化合物，其侧链中含有稀有的呋喃酸单元，形成了特征性的 23,27-epoxy-23,25(27)-dien-26-oic 酸结构。通过 ¹H NMR 和 LC-PDA-MS 技术引导的分离与鉴定方法，发现了四种此前未描述的 FFAs 类三萜类化合物。

通用实验程序

光学旋转值使用 Rudolf Autopol IV 自动极谱仪测量。紫外光谱在 Hitachi U-2900E 双光束分光光度计上记录。ECD 光谱在 JASCO-810 分光极谱仪上记录。红外光谱在 Thermo Scientific Nicolet iS10 FTIR 光谱仪上记录。核磁共振光谱在 Bruker Avance III 400 MHz 光谱仪上获取。化学位移以 δ（ppm）表示，并以残余溶剂信号为参照。质谱图像在 Shimadzu 光谱仪上测量。

作者声明没有利益冲突。

Jin-Feng Hu: 文章撰写、审稿与编辑、方法论设计、资金申请、概念构思。Juan Xiong: 监督、方法论设计、数据管理。Yeun-Mun Choo: 软件支持、数据分析。Dong Huang: 数据分析。Peng Sun: 软件支持、项目管理。Cong Li: 软件支持、项目管理、数据分析。Jia Li: 方法论设计、数据分析。Ze-Yu Zhao: 文章撰写、初步草稿编写、项目管理、实验设计、数据分析。Yi Zang:

数据可根据需求提供。

Butler 和 La Clair, 2026b；IUCN 红色名录，2026；国家林业局和农业部

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC，项目编号 21937002、81773599）和中国浙江省自然科学基金（项目编号 LY23H300001）的支持。