ALP 抑制 PDAC 组织中的 TLR4 信号通路。A、相对 RNA 表达的热图…… 开放获取

《Cancer Research Communications》：ALP suppresses TLR4 signaling in PDAC CAFs. A, Heatmap of relative RNA ex... Open Access

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摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）的诊断通常伴随着多种身体和心理症状，包括焦虑和抑郁。因此，许多患者会被开具抗焦虑药物，如苯二氮卓类（BZD），但这些药物会对肿瘤产生意想不到的影响。我们实验室之前的研究指出，BZD化合物之间的结构差异可能是导致不同临床结果的原因，这与其对PDAC肿瘤微环境（TME）中癌症相关成纤维细胞（CAF）的影响有关。在这项研究中，我们证明了常用的N-取代三唑苯二氮卓类药物阿普唑仑（ALP）可以抑制人类CAF产生促炎细胞因子，包括CCL2、CXCL12、白细胞介素6（IL6）和IL8。这种效应仅存在于含唑环的BZD中，例如咪达唑仑。ALP调节促炎细胞因子产生的能力在体内得到了验证，因为接受ALP治疗的胰腺肿瘤小鼠的肿瘤间质液中IL6水平有所降低。机制研究表明，ALP通过抑制Toll样受体4介导的细胞因子产生来实现这一效果。这些发现共同支持ALP能够减弱PDAC TME中的CAF介导的炎症信号通路。
重要意义：本研究的数据重点关注ALP对CAF分泌的影响，并提供了有力证据，表明ALP可能对重塑胰腺癌的免疫环境和治疗反应产生广泛影响。
引言

胰腺癌是最具侵袭性的实体瘤之一，总体5年生存率仅为13%（1）。在早期阶段，该疾病表现为非特异性症状，因此超过48%的胰腺癌患者在确诊时已处于晚期，此时5年生存率低至3.2%（2）。最常见的胰腺癌亚型是胰腺导管腺癌（PDAC），占所有胰腺肿瘤的90%，其预后最差（3-5）。这种疾病的糟糕预后及其对生活质量的影响导致胰腺癌患者中焦虑和/或抑郁的发生率很高（约30%；参考文献6-9）。大约50%的患者通过药物治疗来管理这些症状，例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）和苯二氮卓类（BZD；参考文献9）。SSRI和BZD的选择往往具有主观性，主要取决于医生的判断。通常，SSRI用于治疗一般的焦虑和抑郁，而BZD则用于缓解预期性恶心。在过去25年中，人们逐渐意识到某些药物，特别是SSRI，可能会对肿瘤及其微环境（TME）产生意想不到的影响（参考文献10-16），尽管针对PDAC的具体研究仍较少。因此，更好地了解这些常用药物如何影响PDAC的肿瘤生物学特性和治疗反应非常重要。我们实验室最近的一项研究报告称，在罗斯威尔公园综合癌症中心，超过40%的PDAC患者被开具了BZD（17）。BZD是一类能够调节中枢神经系统γ-氨基丁酸A（GABA-A）受体活性的化合物，因此具有镇静、抗焦虑和抗惊厥的临床作用（18）。尽管这些化合物具有基本结构（苯环+二氮卓环），但它们在结构上存在差异，并可根据BZD核心骨架氮原子的取代情况进一步分类（N-取代与N-未取代）。我们之前的研究报道，这些细微的结构差异可能与PDAC的不同结果相关（17）。具体来说，我们的流行病学分析显示，接受N-未取代BZD劳拉西泮（LOR）治疗的PDAC患者的无进展生存期比未接受任何BZD治疗的患者更差（17）。相反，接受N-取代BZD阿普唑仑（ALP）治疗的PDAC患者的无进展生存期有所改善。功能随访研究表明，这些发现的一个可能解释是ALP通过调节白细胞介素6（IL6）来调节炎症信号通路，IL6是一种主要由癌症相关成纤维细胞（CAF）分泌的促炎细胞因子，在PDAC的进展中起重要作用（19-24）。虽然LOR治疗增加了CAF中的IL6分泌，但ALP治疗将IL6分泌水平降至基线以下，表明ALP在体外可能具有抗炎作用。在这项研究中，我们旨在探讨ALP对CAF炎症分泌组的影响，CAF是调节PDAC纤维化和免疫排斥的关键成分（25）。我们发现，除了IL6外，ALP治疗还减少了CAF细胞中重要的免疫调节细胞因子（如CCL2、CXCL12和IL8）的产生。重要的是，这种细胞因子产生的减少似乎仅限于含有唑环的BZD化合物（ALP、咪达唑仑），进一步强调了BZD的结构特异性效应。我们还使用原位PDAC小鼠模型进行了体内研究，发现接受ALP治疗的肿瘤的肿瘤间质液中IL6水平较低，表明ALP改变了肿瘤内的细胞因子环境。机制研究表明，调节已知的脱靶受体血小板活化因子受体（PTAFR）和转运蛋白（TSPO）只能部分模拟ALP的治疗效果。我们还报告了ALP在调节Toll样受体4（TLR4）信号通路中的更广泛作用，ALP治疗降低了TLR4激动剂引起的炎症细胞因子转录水平。总之，这些结果支持ALP对PDAC TME具有抗炎作用的观点。

材料与方法

试剂和材料

所有化合物均从Cayman Chemical、Sigma-Aldrich或Thermo Fisher Scientific购买，并根据需要用无菌二甲基亚砜（Corning，25950CQC）或无菌UltraPure水（Invitrogen，10977023）稀释。每种化合物的详细信息见补充表S1。
细胞培养

C7-TA-PSC永生化人类（男性）CAF细胞由Edna Cukierman博士（费城Fox Chase癌症中心）提供。4175个鼠标CAF细胞由Jason Pitarresi博士（马萨诸塞大学伍斯特分校）通过在C57BL/6雄性小鼠中的KrasLSL-G12D/+；Trp53LSL-R172H/+；YFPLSL；Pdx1-Cre肿瘤中通过流式细胞术选择YFP细胞后建立。随后通过流式细胞术染色α-平滑肌肌动蛋白或podoplanin进一步确认成纤维细胞表型。PANC1人类PDAC细胞（男性；RRID:CVCL_0480）于2021年3月从美国典型培养物收藏中心购买。KPC1245鼠标PDAC细胞源自David Tuveson博士（纽约Cold Spring Harbor实验室）实验室中的KrasLSL-G12D/+；Trp53LSL-R172H/+；Pdx1-Cre肿瘤。上述细胞系未进行进一步鉴定。所有细胞系在10 cm组织培养皿（Fisher Scientific，08-772-22）中培养，培养条件为37°C和5% CO2，培养基为含有葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠（Corning，10-013-CV）的DMEM，添加10% FBS（Corning，35-011-CV）和1%青霉素/链霉素（Corning，30-002-CI）。细胞保持约80%的汇合度。所有实验使用的细胞均来自接收后的30代以内。细胞上清液常规检测支原体，结果为阴性。最后一次支原体检测日期为2025年4月3日。
细胞因子阵列

总共500,000个C7-TA-PSC细胞被接种在六孔板的各个孔中（Thermo Fisher Scientific，130184），培养24小时后，更换含有2 mL完全DMEM（10% FBS + 1%青霉素/链霉素）的培养基，培养基中可加入DMSO或20 μmol/L ALP。细胞再培养24小时后，通过1,000 rpm离心3分钟分离细胞和大颗粒杂质。取1毫升条件培养基按照制造商的方案（R&D Systems，ARY005B）进行样品制备。两种处理条件下的膜同时使用Bio-Rad ChemiDoc MP系统在“Hi Sensitivity”模式下成像5分钟。相对细胞因子水平使用ImageLab软件（Bio-Rad）进行定量。简而言之，每个阵列点都用固定体积的圆形轮廓绘制，包括制造商的空白点。通过从每个细胞因子点信号中减去平均背景信号后，将数值除以10^4并以任意单位报告总像素强度。
细胞活力分析

细胞按照上述方法培养和处理。经过24小时的DMSO或20 μmol/L ALP处理后，收集每个孔中所有非贴壁细胞（2 mL培养基），转移到无菌15 mL圆锥形容器（Corning，430790）中。然后用1× DPBS（Corning，20-031-CV）洗涤贴壁细胞一次，向每个孔中加入500 μL 0.25%胰蛋白酶（Corning，25-053-CI）。在37°C和5% CO2条件下培养5分钟后，用1 mL完全DMEM中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移到含有非贴壁细胞的15 mL圆锥形容器中。细胞以1,000 rpm离心3分钟，吸取上清液，每个沉淀物重新悬浮在500 μL完全DMEM中。悬液转移到计数杯（Beckman Coulter，383721）中，并加载到Vi-CELL XR细胞活力分析仪中。在机器计数之前，用1,000 μL移液器混合悬液以防止细胞沉淀。细胞用内部台盼蓝试剂（Beckman Coulter，B94987）染色以排除死细胞，每个生物学重复实验的50个视野的细胞计数结果取平均值。每个体积（细胞/mL）的细胞计数值除以2以考虑浓缩的500 μL输入量。
显微镜观察

对于相位对比图像，细胞按照上述方法培养和处理。经过24小时的20 μmol/L ALP或溶剂对照处理后，使用Olympus IX73显微镜在10×放大倍率下观察六孔板的每个孔，并拍摄代表性图像。刻度条代表200 μm。对于F-actin丝的荧光染色，第0天将50,000个细胞接种在八孔μ-Slide的高壁孔中（ibidi，80806）。第1天更换培养基，分别加入含有20 μmol/L ALP或DMSO的新鲜培养基。24小时后，去除培养基，用4%戊二醛在PBS（Thermo Fisher Scientific，J61899.AK）中固定细胞15分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，再用0.1% Triton X-100（Sigma-Aldrich，X100）稀释15分钟进行通透处理。之后用PBS洗涤细胞3次，并用Alexa Fluor 488 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific，A12379）染色剂（在PBS中稀释至1×于40×甲醇原液中）在黑暗条件下孵育30分钟。最后用PBS洗涤细胞3次，然后每个孔中加入两滴Fluoroshield与DAPI（Sigma-Aldrich，F6057）混合染色细胞核。使用KEYENCE BZ-X710荧光显微镜在20×放大倍率下观察图像。刻度条代表50 μm。
RT-qPCR

贴壁细胞先用1× DPBS和二乙基焦碳酸酯水（Thermo Fisher Scientific，AM9916）洗涤一次，然后使用Norgen Total RNA Purification Plus Kit（48300）进行RNA分离。使用NanoDrop检测RNA浓度和质量，标准为260/280 > 2和260/230 > 1.75。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，1708891）逆转录1微克RNA。除非另有说明，否则RT-qPCR在生物和技术重复三次中进行，使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，1725121）。每个样本在CFX Opus 96实时PCR系统（Bio-Rad）上使用默认设置进行十微升分析。所有引物均从Bio-Rad购买，详见补充表S2。每个技术重复的Ct值取平均值，除非另有说明，用于计算相对于GAPDH Ct值的基因表达倍数变化（ΔΔCt）和DMSO对照的Ct值（ΔΔCt）。倍数变化（相对RNA表达）计算为2^-ΔΔCt。这种方法用于每个生物学重复实验，以确保三个生物学重复中的溶剂对照的倍数变化均为1，除非另有说明。酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISAs）

**人类CAF酶联免疫吸附测定**

在第0天，将500,000个C7-TA-PSC细胞接种到6孔板的各个孔中。第1天，向每个孔中加入新鲜培养基，并添加20 μmol/L的BZD或DMSO作为对照。24小时后，按照上述方法分离条件培养基（conditioned media）。上层清液分装后储存在-80°C，以便在后续ELISA检测中使用（使用时间不超过2周）。对于每个ELISA实验，将条件培养基在冰上解冻，每个生物学重复实验（n = 3）进行两次技术重复检测。CCL2（Invitrogen，BMS281）、CXCL12（Invitrogen，EHCXCL12A）、IL6（Sigma-Aldrich，RAB0306）和IL8（Invitrogen，KHC0081）的ELISAs按照制造商的协议进行。样本稀释比例为1:10，以避免超过检测上限。标准曲线用于计算总蛋白质水平，数据以DMSO对照的浓度进行标准化。

**小鼠CAF ELISAs**

在第0天，将250,000个4175细胞接种到6孔板的各个孔中。第1天，向每个孔中加入新鲜培养基，并添加20 μmol/L的ALP或DMSO作为对照。24小时后，按照上述方法分离条件培养基。对于每个ELISA实验，将条件培养基在冰上解冻，每个生物学重复实验（n = 3）进行两次技术重复检测。CCL2（Invitrogen，BMS6005）和IL6（Invitrogen，BMS603-2）的ELISAs按照制造商的协议进行。样本稀释比例为1:10，以避免超过检测上限。标准曲线用于计算总蛋白质水平，数据以DMSO对照的浓度进行标准化。

**PANC1细胞培养用于细胞因子RNA分析**

在第0天，将250,000个PANC1人类PDAC细胞接种到6孔板的各个孔中。第1天，吸出培养基并替换为含有DMSO或20 μmol/L ALP的培养基。细胞培养24小时后，按照上述方法分离RNA。

**同种异体胰腺移植和体内药物治疗**

所有体内实验均遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南（协议编号#1381M）进行。手术当天，使用异氟烷麻醉10周大的雌性C57BL/6J小鼠（RRID:IMSR_JAX:000664）。每只小鼠皮下注射500 μL 0.9%生理盐水（Sigma-Aldrich，S8776）和长效镇痛剂（Ethiqa）。手术部位剃毛并使用氯己定、70%乙醇和碘伏消毒。小鼠转移到加热垫上的无菌手术台并进行铺巾。在皮肤和腹膜上做小切口以暴露脾脏和胰腺。使用Hamilton注射器（Hamilton，80501）将含有10,000个KPC1245细胞的无血清和无抗生素的DMEM悬浮液（20 μL）注入胰腺头部。暴露脾脏和胰腺后，用5-0 Vicryl缝线关闭腹膜，然后在皮肤上使用伤口夹固定。手术后监测小鼠72小时以观察恢复情况，之后开始每天腹腔注射DMSO或ALP（0.5 mg/kg）。药物制备时，先将ALP稀释至10 mg/mL的储备液。注射当天，将储备液稀释至0.9%生理盐水中的50 μg/mL浓度，每20克小鼠体重注射200 μL溶液。每5到7天称重一次小鼠以确保剂量一致。

**全血血清的收集与分析**

根据IACUC标准，使用二氧化碳对小鼠实施安乐死，然后进行心脏穿刺。将全血转移到微量离心管（Thermo Fisher Scientific，1149X91）中，室温下静置30分钟后再以10,000转/分钟离心10分钟。每个样本的上清液（血清）分装到微量离心管（25 μL/管）中，储存在-80°C，以备后续小鼠ELISA检测使用（参见“小鼠CAF ELISAs”部分）。血清ELISA的输入体积为每1克体重1 μL，以标准化不同小鼠之间的体积差异。与条件培养基不同，血清在CCL2 ELISA中使用时不进行稀释。

**胰腺肿瘤提取物（TIF）的收集与分析**

从腹腔中分离出原发性胰腺肿瘤，并用冷生理盐水快速冲洗。用Kimwipes（Fisher Scientific，06-666）擦拭肿瘤以去除多余盐水，然后将其放置到20 μm Spectra/Mesh过滤器（Spectrum，148134）上，过滤器固定在50 mL锥形管（Falcon，352070）中。盖上管盖后，将样本转移到冷藏离心机（4°C）中，以1,500转/分钟离心10分钟。每个肿瘤的流通过量（TIF，约25 μL）分装到冷冻管（VWR，10018-738）中，并在液氮中快速冷冻。样本储存在-80°C，以备后续小鼠ELISA检测使用（参见“小鼠CAF ELISAs”部分）。TIF ELISA的输入体积为每0.1克肿瘤1 μL，以标准化肿瘤大小差异。TIF在CCL2 ELISA中使用时不进行稀释。

**受体/配体剂量递增实验**

将总共500,000个C7-TA-PSC细胞接种到6孔板的每个孔中，并过夜培养。处理当天，在含有载体或指定浓度化合物（GABA、PK11195、WEB2086、ALP）的15 mL锥形培养基中准备培养基。化合物稀释剂作为相应化合物的载体使用。从细胞中移除培养基并替换为含有相应药物浓度的新鲜培养基。细胞再培养24小时后，收集RNA进行分离。

**人类PDAC单细胞测序数据集分析**

人类胰腺腺癌的标准化单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据直接来源于Chijimatsu及其同事的研究（26）。原始作者完成了所有上游处理步骤，包括原始读段对齐、唯一分子标识符计数、初步质量控制和标准化。预处理后的数据通常以Seurat对象格式提供，然后加载到R统计计算环境（R版本4.2.0）中。单细胞数据的后续分析使用Seurat R包（版本5.0.0；参考文献27）进行。将scRNA-seq数据加载到R会话中后，程序化地从Seurat对象中检索感兴趣的基因的标准化表达数据。生成综合基因报告，系统地检查这些基因在各种元数据因素下的表达情况。这些因素包括但不限于数据来源的项目、疾病类型（例如肿瘤与正常组织）和细胞亚型（例如成纤维细胞与导管细胞），具体分类参见参考文献（26）。基因报告通常包含汇总统计信息（例如平均表达水平、表达该基因的细胞百分比）以及可视化图表，如均匀流形近似和降维投影图、小提琴图和箱线图或特征图，以展示不同细胞和样本背景下的基因活性和分布。为了直观展示感兴趣基因的差异表达模式，生成了热图。这些热图显示了选定基因在单个细胞或聚类细胞中的标准化表达水平，提供了全面的概览。特别强调了比较肿瘤和正常样本之间基因表达谱的热图，以便全面评估疾病相关的表达变化。基于数据注释，创建了聚焦于成纤维细胞群体的比较热图。

**siRNA转染**

在第0天，将500,000个细胞接种到6孔板的两个孔中。24小时后，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen，13778075）将细胞转染非靶向对照siRNA池（siNTC；Horizon，D-001206-13-05）或靶向TSPO的四个siRNA组成的SMARTpool（Horizon，M-009559-03-0005）。简而言之，将每个冻干池的5 nmol溶液溶解在1× siRNA缓冲液（Horizon，B-002000-UB-100）中，制成20 μmol/L的siRNA储备液，储存在-20°C。转染当天，将1.25 μL的20 μmol/L siRNA储备液稀释在200 μL Opti-MEM（Gibco，31985062）中，并加入2 μL RNAiMAX试剂。充分涡旋混合物30秒以确保混合均匀，短暂离心后置于室温下孵育15分钟。此时用800 μL Opti-MEM替换细胞上的培养基。然后将含有相应siRNA条件的siRNA溶液（NTC vs. TSPO）加入每个孔中。4小时后，向细胞补充1.5 mL无抗生素培养基（DMEM + 10% FBS）。

**ALP处理时间过程**

将总共500,000个C7-TA-PSC细胞接种到6孔板的每个孔中，并过夜培养。在时间点0，从细胞中移除培养基并替换为含有20 μmol/L ALP或等效浓度的DMSO的新鲜培养基。每个时间点通过胰蛋白酶处理收集细胞沉淀，并在-80°C冷冻以分离RNA。

**实验设计图示**

所有实验设计图示均使用BioRender（RRID:SCR_018361，https://BioRender.com）创建。

**磷酸化富集样本制备**

将总共2,500,000个C7-TA-PSC细胞接种到10 cm培养皿中，每个条件各培养过夜。在ALP处理前一小时，更新细胞培养基以去除细胞接种后积累的任何 constitutive 信号，并让细胞适应培养基变化。一小时后再次更新培养基为20 μmol/L ALP，通过胰蛋白酶处理收集细胞沉淀，并在每个时间点冷冻。为了进行磷酸化富集，细胞沉淀用含有8 mol/L urea的裂解液（150 μL裂解缓冲液 [50 mmol/L 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-propanesulfonic acid (EPPS; pH 8.5), 1% SDS, 1 PhosSTOP (Roche), 1 cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche)]裂解，然后在4°C下离心10分钟，转速16,000 × g。使用CB-X蛋白测定试剂（G-Biosciences）对上清液进行定量。所有样本用水稀释至1 mg/mL，用5 mmol/L DTT还原30分钟，然后在黑暗中用15 mmol/L iodoacetamide烷基化30分钟。使用SP3方法（28）对样本进行脱盐，使用两种磁珠（Cytiva，45152105050250和65152105050250）以1:1比例混合。将1:10比例的磁珠和蛋白质混合后，通过加入2倍体积的100%乙醇沉淀蛋白质15分钟，再用80%乙醇洗涤两次。磁珠在含有1 mg MS Trypsin（Thermo Fisher Scientific）的75 μL 50 mmol/L EPPS缓冲液中孵育过夜，转速800 RPM。通过添加无水乙腈（Sigma）将肽标记，然后用TMTpro（Thermo Fisher Scientific，A44520）试剂标记。每份标记样本的1%进行合并和分析，以确保标记效率>97%，并将所有通道合并。按照制造商的说明使用100 mg C18 Sep-Pak（Waters）对合并样本进行脱盐。肽通过Fe-NTA旋转柱（Thermo Fisher Scientific，A32992）进行富集，进一步富集磷酸肽。

**受体/配体剂量递增实验**

将总共500,000个C7-TA-PSC细胞接种到6孔板的每个孔中，并过夜培养。处理当天，从细胞中移除培养基并替换为含有20 μmol/L ALP或DMSO的新鲜培养基。每个时间点通过胰蛋白酶处理收集细胞沉淀，并在-80°C冷冻以分离RNA。

所有实验设计图示均使用BioRender（RRID:SCR_018361，https://BioRender.com）创建。

**荧光免疫细胞术（Flow-Through, TIF）的收集与分析**

将原发性胰腺肿瘤从腹腔中分离出来，并用冷生理盐水短暂冲洗。用Kimwipes（Fisher Scientific，06-666）擦拭肿瘤以去除多余盐水，然后将肿瘤放置在20 μm Spectra/Mesh过滤器（Spectrum，148134）上，过滤器固定在50 mL锥形管（Falcon，352070）的顶部。盖上管盖后，将样本转移到冷藏离心机（4°C）中，以1,500转/分钟离心10分钟。每个肿瘤的流通过量（TIF，约25 μL）分装到冷冻管（VWR，10018-738）中，并在液氮中快速冷冻。样本储存在-80°C，以备后续小鼠ELISA检测使用（参见“小鼠CAF ELISAs”部分）。TIF ELISA的输入体积为每0.1克肿瘤1 μL，以标准化肿瘤大小。TIF在CCL2 ELISA中使用时不进行稀释。

**受体/配体剂量递增实验**

将总共500,000个C7-TA-PSC细胞接种到6孔板的每个孔中，并过夜培养。处理当天，在含有载体或指定化合物浓度的15 mL锥形培养基中准备培养基（GABA、PK11195、WEB2086、ALP）。化合物稀释剂分别用作各化合物的载体。从细胞中移除培养基并替换为含有相应药物浓度的新鲜培养基。细胞再培养24小时后，收集RNA进行分离。

**人类PDAC单细胞测序数据集分析**

人类胰腺腺癌的标准化单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据直接来源于Chijimatsu及其同事的研究（26）。原始作者完成了所有上游处理步骤，包括原始读段对齐、唯一分子标识符计数、初步质量控制和标准化。预处理后的数据通常以Seurat对象格式提供，加载到R统计计算环境（R版本4.2.0）中。单细胞数据的下游分析使用Seurat R包（版本5.0.0；参考文献27）进行。将scRNA-seq数据加载到R会话后，从Seurat对象中程序化检索预定义基因列表的标准化表达数据。生成综合基因报告，系统地检查这些基因在各种元数据因素下的表达情况。这些因素包括但不限于数据来源的项目、疾病类型（例如肿瘤与正常组织）和细胞亚型（例如成纤维细胞与导管细胞），具体分类参见参考文献（26）。基因报告通常包括汇总统计信息（例如平均表达水平、表达该基因的细胞百分比）以及可视化图表，如均匀流形近似和降维投影图、小提琴图和箱线图或特征图，以展示不同细胞和样本背景下的基因活性和分布。为了直观展示感兴趣基因的差异表达模式，生成了热图。这些热图显示了选定基因在单个细胞或聚集细胞簇中的标准化表达水平，提供了全面的概览。特别关注生成比较肿瘤和正常样本之间基因表达谱的热图，以便全面评估疾病相关的表达变化。比较热图基于数据的注释，重点关注成纤维细胞群体。样品被分析了两次，第一次使用FAIMS补偿电压（CV）分别设置为-40、-60和-80 V，第二次注射时的CV设置为-30、-50和-70 V。质谱数据分析使用了内部软件工具进行数据库搜索和报告离子定量，如先前所报道的（29）。MS/MS光谱使用Sequest算法进行匹配，并与UniProt人类数据库（2024年10月编译）进行比对，结合正向和反向序列以启用目标-诱饵策略（30, 31）。数据库搜索考虑了肽N端和赖氨酸残基的半胱氨酸烷基化及串联质谱标签（TMT）等静态修饰。变量修饰包括甲硫氨酸的氧化以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。还搜索并识别了中性磷酸盐的损失。前体离子的容忍度为50 ppm，碎片离子的容忍度为0.8 Da（对于HCD）。Sequest匹配通过线性判别分析进行过滤，如先前所报道的，首先在肽水平上将错误率控制在1%（31）。

TMT报告离子的定量按照之前发表的方法进行（32）。简而言之，使用0.004 Da的过滤器分离TMT信号，并根据制造商的说明校正同位素杂质。只有当所有通道的总信噪比大于160时，才认为肽是可量化的。

磷酸肽位点的定位和定量分析使用了改进版的AScore算法。AScore值大于13（P ≤ 0.05）的磷酸肽位点被认为是可靠地定位在特定残基上的（29）。学生t检验用于确定磷酸肽丰度变化的置信度。

磷酸肽被输入到PhosphoSitePlus磷酸蛋白质组学富集工具（版本0.1.0，旧版本；参考文献33, 34）中，作为逗号分隔的文本文件，其中包含了标记的磷酸受体、log2（倍数变化）和P值，用于基于差异表达的分析。log2（倍数变化）和P值的截断值分别设置为0.322和0.05。使用默认设置对经典的和非经典的丝氨酸/苏氨酸及酪氨酸激酶（共396种激酶）进行了富集分析。

所有显著差异调节的磷酸肽列表[|log2（倍数变化）| ≥ 0.322, ?log10（P值）> 1.3]被上传到EnrichrKG（35）中，针对每个时间点。该分析的输出结果来自2021年京都基因与基因组百科全书（RRID:SCR_012773）、2021年基因本体论（GO）生物过程（RRID:SCR_002811）和2022年反应组（RRID:SCR_003485）数据集。使用Origin 2025软件创建了显示z分数和P值的图表。

将500,000个C7-TA-PSC细胞接种到六孔板的每个孔中，并过夜培养。处理时，移除细胞培养基，并替换为含有DMSO、20 μmol/L ALP和/或2.5 μg/mL脂多糖（LPS；1:1,000）的新鲜培养基。细胞再培养24小时后再收集用于RNA分离。

所有实验均进行了三次技术重复和三次生物学重复，除非另有说明，否则条形图上的每个数据点代表一个生物学重复值。误差条表示平均值±标准差。所有统计分析均在GraphPad Prism 10中完成（RRID:SCR_002798）。对于仅比较两个组的分析，使用了非配对的双尾学生t检验。当实验组仅与对照组比较时，使用单因素ANOVA并进行Dunnett校正；当实验组与所有组比较时，使用Tukey校正。P值<0.05被认为是显著的。

**ALP在体外改变了PDAC CAFs的炎症分泌组**

永生化的人类CAFs（C7-TA-PSC）用DMSO或20 μmol/L ALP处理24小时，收集条件培养基以评估基于膜免疫测定的36种不同细胞因子的相对丰度。除了IL6外，ALP处理还导致条件培养基中的CCL2、CXCL12、IL8和SERPINE1蛋白水平降低（图1A和B）。

为了评估细胞因子的整体减少是否可以归因于ALP处理后的细胞存活变化，我们评估了培养物的活力和形态。我们观察到处理组之间的细胞总数或活力没有显著降低（补充图S1A和S1B）。有趣的是，ALP处理后细胞的形态发生了轻微变化，用ALP处理的细胞比用载体处理的对照细胞更不具有纺锤形（补充图S1C）。排除了细胞存活受损的可能性后，我们认为ALP介导的细胞因子分泌变化可能是由于转录程序的改变。因此，我们使用RT-qPCR定量RNA水平，发现ALP处理显著降低了CCL2、CXCL12、IL6和IL8的水平（图1C）。我们没有观察到用ALP处理的细胞中SERPINE1的RNA水平有任何显著变化（补充图S1D）。因此，我们选择关注四种变化最显著的细胞因子（CCL2、CXCL12、IL6和IL8）作为后续研究的ALP活性指标。

鉴于我们之前的研究强调了BZDs对IL6水平的结构特异性效应，我们在分析中额外纳入了五种BZD化合物。我们发现咪达唑仑是唯一一种在RNA和蛋白质水平上都表现出与ALP相同效应的BZD（图1C和D；补充图S1E）。我们还使用小鼠CAF细胞系（4175）作为正交方法评估了ALP效应，观察到与DMSO处理的对照细胞相比，经过24小时ALP处理后Ccl2、Cxcl12和Il6的转录水平显著降低（补充图S1F）。由于小鼠基因组中没有IL8的同源物，因此没有包括IL8。作为概念验证，我们选择了CCL2和IL6作为代表性目标，评估ALP对细胞因子分泌的影响，观察到在ALP处理的小鼠CAF条件培养基中这两种细胞因子的蛋白水平一致降低（补充图S1G–S1I）。有趣的是，我们还观察到在人类PDAC细胞中ALP依赖性地降低了CCL2、IL6和IL8的RNA表达水平，这表明这种特征可能不仅限于CAF（补充图S1J）。总之，这些数据表明ALP在体外抑制了免疫调节细胞因子的产生。

为了在体内验证这一理论，我们将同源的KPC1245细胞（源自雌性小鼠KrasLSL-G12D/+；Trp53LSL-R172H/+；Pdx1-Cre胰腺肿瘤）异位注射到10周大的雌性C57BL/6小鼠的胰腺中，允许72小时术后恢复，然后开始14天的腹腔注射方案，分别给予0.5 mg/kg ALP（n = 14）或DMSO等效物（n = 13；补充图S2A）。与之前的研究一致，ALP处理耐受性良好，但相对于载体处理组未能显著减少肿瘤负担（补充图S2B和S2C）。尽管ALP处理没有影响化学治疗初期的肿瘤负担，但我们怀疑ALP仍可能影响已知会影响治疗反应的促炎细胞因子的产生。我们使用全血血清以及高浓度的TIF进行了小鼠CCL2和IL6的ELISA检测。在血清中，我们未能检测到两组之间任何明显的细胞因子浓度变化（补充图S2D和S2E）。然而，在TIF中，我们观察到ALP处理的肿瘤中的IL6浓度通常低于载体对照组（补充图S2F和S2G）。这些结果支持ALP在体内减弱肿瘤内细胞因子产生的观点。

已知ALP受体的配体仅部分模拟了ALP的特征变化

尽管ALP主要被认为是GABA-A受体的正向别构调节剂，但也有报道指出它对PTAFR和TSPO有脱靶效应（36–39）。为了确定ALP在CAF/炎症背景下可能作用的主要受体，我们设计了实验，以ALP已知的作用方式同时调节这三个受体。简而言之，在收集样本前24小时，我们用载体、10或100 μmol/L的GABA-A激动剂（GABA）、TSPO配体（PK11195）或PTAFR抑制剂（WEB2086）处理细胞，然后进行RT-qPCR分析。总体而言，GABA处理对细胞因子转录水平没有显著影响（图2A）。然而，PK11195和WEB2086的处理均降低了CCL2和CXCL12的RNA水平。虽然WEB2086处理也降低了IL6的表达，但PK11195处理显著增加了IL6和IL8的RNA水平。值得注意的是，100 μmol/L的PK11195和100 μmol/L的WEB2086均不足以像50 μmol/L的ALP那样显著降低细胞因子水平（图2B）。N.D. 表示每个生物学重复样本的至少两个技术重复样本的 Ct 值超出了检测限。ns 表示不显著；* 表示 P < 0.001；**** 表示 P < 0.0001。图 2。查看大图 下载幻灯片。

已知的 ALP 受体的配体只能部分模拟 ALP 的特征变化。A 和 B 图显示了在 C7-TA-PSC 细胞用 A（10 或 100 μmol/L 的指定化合物）或 B（0.05、0.5、5 或 50 μmol/L 的 ALP）处理 24 小时后，通过 RT-qPCR 测定的相应细胞因子的 RNA 表达倍数变化，相对于其溶剂对照（0 μmol/L）。C 图显示了通过 RT-qPCR 确定的 C7-TA-PSC 细胞中每个基因的 Ct 值与 GAPDH 的比值。D 图通过人类 scRNA-seq 数据集（26）展示了正常和肿瘤成纤维细胞中相对 RNA 水平的热图。E 图通过 RT-qPCR 测定了 siNTC 和 siTSPO 转染的 C7-TA-PSC 细胞中 TSPO 和 ALP 特征细胞因子的 RNA 表达倍数变化。A 图中的数据是技术重复三次和生物学重复三次的（n = 3）。B、C 和 E 图中的数据是技术重复三次和生物学重复三次的（n = 3）。数据以平均值 ± 标准差表示。N.D. 表示每个生物学重复样本的至少两个技术重复样本的 Ct 值超出了检测限。ns 表示不显著；* 表示 P < 0.001；**** 表示 P < 0.0001。

我们认为，这些结果中的一些可能是由于我们模型细胞系中目标受体的相对丰度造成的。对 TSPO、PTAFR 和三种最丰富的 GABA-A 受体亚单位（α1β2γ2；参考文献 17、40、41）进行的 RT-qPCR 分析显示了 TSPO 和 PTAFR 的表达，而 GABA-A 亚单位的 RNA 水平降至检测限以下（图 2C）。在一个公开的人类 PDAC scRNA-seq 数据集（26）中，β2 和 γ2 GABA-A 亚单位的表达较低，在正常和肿瘤组织的成纤维细胞中均未检测到 α1 亚单位（图 2D）。我们还观察到，在该数据集中，TSPO 的表达远高于 PTAFR，并且在肿瘤成纤维细胞中高于正常成纤维细胞。考虑到这一点，我们使用 siRNA 干扰系统进一步研究了人体 CAFs 中的 TSPO。siTSPO 细胞中的 CXCL12 和 IL6 表达低于 siNTC 转染的细胞（图 2E）。然而，由于 TSPO 干扰剂 PK11195 和 WEB2086 都不足以完全模拟 ALP 的效应，这些数据表明在这个背景下 ALP 可能不是通过 TSPO 或 PTAFR 直接起作用的。无偏磷酸蛋白质组学揭示了 ALP 依赖的激酶活性变化。

为了进一步了解 ALP 处理对 CAFs 中下游通路的影响，我们进行了时间进程分析，以确定 ALP 特征细胞因子的变化能多快被检测到。在治疗时更换培养基足以在 4 小时内降低 DMSO 处理的细胞中的 IL 表达，这表明仅培养基组成就会影响细胞因子的转录。然而，最重要的是，在 20 μmol/L ALP 处理后的 1 至 4 小时内，CCL2、IL6 和 IL8 的 RNA 水平显著低于 DMSO 处理的细胞，表明 ALP 直接诱导了快速的转录重编程（图 3A）。基于此，我们选择了在 0、10、30 和 60 分钟的时间点进行无偏磷酸蛋白质组学筛选，以确定 ALP 依赖的信号级联（图 3B）。利用基于质谱的蛋白质组学与固定金属亲和色谱结合的方法，我们能够在每个时间点检测到 2,433 种磷酸蛋白上的 6,541 个磷酸肽（主要是单体肽）中的 7,693 个独特磷酸位点，且方差系数较低（补充图 S3A–S3D）。总体而言，磷酸化事件的数量随时间呈增加趋势（图 3C–E）。在 10 分钟的时间点，与 0 分钟的基线相比，最显著的磷酸化事件被下调；而在 60 分钟时，大多数显著的磷酸肽被上调。整体 GO 分析显示，在所有时间点，参与内吞作用、粘附连接和肌动蛋白细胞骨架调节的磷酸蛋白都有所富集（补充图 S3E）。尽管这一发现与补充图 S1C 中的形态变化一致，但它并未直接解释 ALP 介导的细胞因子变化。接下来，我们使用激酶预测软件推断我们检测到的共同上游调节因子，并观察到在 60 分钟时炎症小体相关激酶的上调，在 30 分钟时蛋白激酶 C 家族成员的下调，以及最有趣的是，在 10 分钟时参与 TLR 信号传导的激酶的下调（图 3F）。图 3。查看大图 下载幻灯片。

无偏磷酸蛋白质组学揭示了 ALP 依赖的激酶活性变化。A 图显示了在 C7-TA-PSC 细胞用 20 μmol/L ALP 或 DMSO 处理指定时间后，通过 RT-qPCR 确定的细胞因子 RNA 表达水平的倍数变化，相对于 0 小时的溶剂对照。样品是技术重复两次和生物学重复三次的（n = 3）。B 图展示了在生物学重复三次（n = 3）中进行的磷酸蛋白质组学实验设计。C 图显示了在 20 μmol/L ALP 处理后每个指定时间点相对于 0 分钟对照显著上调或下调的磷酸肽的数量。D 图通过热图显示了随时间变化的磷酸肽的 z 分数。E 图通过火山图显示了在 20 μmol/L ALP 处理后 10、30 和 60 分钟分别上调（洋红色）和下调（青色）的差异富集磷酸肽。F 图通过火山图显示了基于每个时间点差异表达的磷酸肽底物预测激酶活性增强（洋红色）或减弱（青色）的激酶。图 3。查看大图 下载幻灯片。

ALP 抑制 PDAC CAF 中的 TLR4 信号传导

TLR 信号传导在炎症调节中起着重要作用，特别是炎症细胞因子的产生（42, 43）。预计在 ALP 处理 10 分钟后 TLR 相关激酶活性的下调促使我们探究了 PDAC CAF 中这些受体的情况（44–48）。在 10 种已知的人类 TLR 家族成员中（44），我们发现 TLR4 是 PDAC CAF 中表达最高的 TLR，并且在肿瘤成纤维细胞中也比正常成纤维细胞更富集（图 4A；参考文献 26）。尽管 TLR4 似乎在 PDAC TME 的多种细胞亚型中都有表达，但成纤维细胞是最高表达者之一（补充图 S4）。我们还在我们的人体 CAF 细胞系中确认了 TLR4 的表达（图 4B）。因此，我们推测 ALP 可能通过抑制 PDAC CAF 中的 TLR4 激活来抑制炎症细胞因子的产生。为了验证这一点，C7-TA-PSC 细胞被用 DMSO 或 20 μmol/L ALP 处理，有的同时加入 2.5 μg/mL 的 LPS（一种已知的 TLR4 激活剂）。尽管 LPS 处理增加了相对于溶剂对照的 ALP 特征基因的转录水平，但 ALP 与 LPS 的组合显著降低了这些转录本的水平（图 4C）。总体而言，这些数据表明 ALP 处理足以抑制 PDAC CAF 中 TLR4 介导的炎症细胞因子产生。图 4。查看大图 下载幻灯片。

ALP 抑制 PDAC CAF 中的 TLR4 信号传导。A 图显示了在参考文献（26）中分析的正常胰腺和 PDAC 肿瘤组织的人类成纤维细胞 scRNA-seq 剖面中 TLRs 的相对 RNA 表达水平的热图。B 图通过 RT-qPCR 验证了 C7-TA-PSC 细胞在基线时相对于 GAPDH 的 TLR4 RNA 表达。C 图显示了在 DMSO、20 μmol/L ALP 和/或 2.5 μg/mL LPS 处理 24 小时后，通过 RT-qPCR 确定的细胞因子 RNA 表达水平的倍数变化。B 和 C 中的实验是技术重复三次和生物学重复三次的（n = 3）。数据以平均值 ± 标准差表示。C 中的统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行多重比较的 Tukey 校正。ns 表示不显著；** 表示 P < 0.01；*** 表示 P < 0.001；**** 表示 P < 0.0001。图 4。查看大图 下载幻灯片。

讨论

PDAC 肿瘤的一个显著特征是它们密集的纤维基质，占据了肿瘤体积的绝大部分（49）。这种纤维组织不仅物理上限制了免疫细胞的浸润，还包含多种分泌细胞间信号分子的成纤维细胞亚型，这些分子有助于免疫抑制（25, 50）。在本研究中，我们证明了常用的 BZD 类 ALP 可以显著减少 PDAC CAFs 在体外产生的炎症细胞因子，如 CCL2、CXCL12、IL6 和 IL8。我们发现图 1 中识别的 ALP 特征也被咪达唑仑模拟，但并非所有 BZD 都如此。这一发现表明，这两种化合物之间的结构相似性可能使它们具有抗炎特性。虽然 ALP 被归类为三唑类 BZD，但咪达唑仑是氟化咪唑类 BZD，这意味着这两种化合物都含有与中心 BZD 结构结合的唑环。尽管地西泮和替马西泮也含有 N-取代基，但这些化合物对细胞因子表达没有明显影响，进一步支持了这种表型仅存在于含有 N-取代基的唑类 BZD 中的观点。ALP 和咪达唑仑增强效应的一个解释可能是它们对 α1β2γ2 GABA-A 受体的高结合亲和力（18），这是该受体在大脑中最丰富的异五聚体构型（40, 41）。然而，对我们模型细胞系的 RT-qPCR 分析以及对人类 PDAC scRNA-seq 数据集（26）的挖掘显示，CAFs 中这些 GABA-A 亚单位的表达可以忽略不计（图 2C 和 D）。这些分析并不排除这些亚单位在蛋白质水平上表达的可能性。也有可能 CAFs 表达的是 ALP 和/或咪达唑仑结合的较少见的 GABA-A 亚单位组合。然而，由于 GABA 的添加不足以消除细胞因子水平（图 2B），因此 ALP 主要通过 GABA-A 在 PDAC CAFs 中起作用的可能性较低。在 20 世纪 80 年代，首次报告 BZD（ALP）可以干扰 PTAFR 信号传导（36, 37）。尽管与 BZD 结构不同，含唑的噻嗪类药物艾司唑仑已被报道可以通过 PTAFR 在食管 CAFs 中发挥抗炎作用（51）。最近还发现 PTAFR 是 PDAC 中免疫调节的目标（52）。考虑到这一点，我们测试了一种已知的 PTAFR 抑制剂（WEB2086），看这种化合物是否可以再现 ALP 的细胞因子特征。虽然 100 μmol/L WEB2086 足以降低 CCL2、CXCL12 和 IL6 的转录水平，但我们没有观察到 IL8 RNA 的减少（图 2B）。尽管ALP有可能通过抑制PTAFR来调节某些（但不是所有）这些细胞因子，但在体外和体内PDAC间质细胞（CAFs）中PTAFR RNA的低表达表明这种可能性较低。与GABA-A的表达类似，PTAFR也可能在蛋白质水平上表达；然而，需要进一步的研究来阐明这种蛋白质在PDAC肿瘤中的空间分布。另一个已知的BZD结合伴侣是TSPO（38, 39），也被称为外周BZD受体。虽然文献中对ALP与TSPO之间的结合亲和力存在争议（53），但生化分析表明ALP确实可以与TSPO结合，其亲和常数为约14 μmol/L（38）。最近的一项研究报告将TSPO与PDAC中的炎症细胞因子生成调控联系起来（54）。重要的是，该研究表明咪达唑仑可以降低携带肿瘤的小鼠血浆中的CCL2和IL6水平，并且这种效应可以通过TSPO配体PK11195来恢复。关于PK11195是主要作为TSPO激动剂还是拮抗剂的作用也存在争议（55）。由于有报道称PK11195可以在体外模拟含有唑类的BZD（如咪达唑仑）对炎症的影响（56），我们在研究中使用了这种化合物来评估它是否能够复制ALP的效果。有趣的是，尽管100 μmol/L的PK11195再现了我们在ALP处理时观察到的CCL2和CXCL12的下降，但IL6和IL8的水平却显著上升。这些结果可能可以通过高剂量PK11199的脱靶效应来解释。由于通过基因靶向TSPO也未能减少所有ALP特征基因的RNA表达，因此更有可能存在一种多方面的受体反应。采用非特异性方法，我们进行了质谱分析，发现了TLR信号通路下游蛋白质磷酸化的时间依赖性变化。鉴于TLR在调节肿瘤内炎症和免疫信号传导中的重要作用（57），这些结果特别值得关注。我们对scRNA-seq数据的分析表明，TLR4在PDAC间质细胞中可能特别值得关注。不仅在永生化PDAC间质细胞系中可以检测到TLR4的水平，而且与正常胰腺成纤维细胞相比，肿瘤成纤维细胞中的TLR4表达也上调。TLR4是一种跨膜蛋白，能够识别来自多种内在和外在配体的病原体相关分子模式（58）。重要的是，尽管我们使用了LPS作为有效的TLR4激动剂，但在PDAC肿瘤微环境（TME）中存在许多具有已知TLR4活性的蛋白质和分子。这些因素可能在体外刺激基线水平的细胞因子生成，而这种生成在ALP处理后会被抑制。此外，ALP对PTAFR和TSPO的脱靶效应也可能影响TLR4信号通路，因为这些通路也与TLR4介导的炎症有关（59–62）。最终，需要进一步的研究来确定ALP干扰PDAC间质细胞中TLR4信号通路的主要机制。需要注意的是，此处提供的体外数据应该结合培养条件进行解读。普遍认为，用于CAF培养的基底材料（例如塑料或Matrigel）可以影响成纤维细胞的表型（63），而这些成纤维细胞的表型又可以通过重塑细胞外基质来影响基底的硬度（64）。通过在2D单层环境中培养CAFs，我们的细胞可能仅代表CAFs中的一种类似肌成纤维细胞的亚群，可能无法准确反映构成PDAC TME的CAFs的异质性和可塑性（65–67）。因此，我们正在积极研究ALP在体内的作用，包括对细胞外基质组成的影响。本研究的数据集中在描述ALP对CAF细胞因子分泌的影响，并为ALP可能广泛影响PDAC的免疫环境和治疗反应提供了有力证据。例如，CCL2是PDAC TME中炎症单核细胞招募的关键介质，靶向CCL2/CCR2轴已被证明可以提高对放疗、化疗和免疫治疗的敏感性（68–71）。同样，CXCL12、IL6和IL8在TME中参与了复杂的基质-免疫旁分泌信号传导（72），是PDAC中的有吸引力的治疗靶点（23, 73–77）。总之，ALP带来的改善效果（17）可能归因于本文描述的多方面的抗炎CAF信号通路。数据可用性：

所有数据均包含在文章中。肽分析、激酶富集结果及所有统计分析均包含在补充数据文件中。来自人类PDAC scRNA-seq的基因表达分析数据来源于参考文献（26）中描述的数据集。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库（78）提交至ProteomeXchange Consortium，数据集标识符分别为PXD067046和10.6019/PXD067046。

作者披露：

A.L. Smythers在本研究期间获得了Dana-Farber Cancer Institute的资助。其他作者没有披露任何利益冲突。

作者贡献：

H.D. Reavis：概念提出、数据管理、正式分析、验证、研究、可视化、方法论制定、初稿撰写、项目管理。
A.H. Chaubey：研究、审稿和编辑。
A.L. Smythers：资源提供、数据管理、正式分析、研究、可视化、方法论制定。
A.A. Tisdale：研究。
A. Tracz：研究。
A.N. Dimeck：研究。
K.E. Maraszek：研究。
E. Cortes Gomez：正式分析、可视化。
J.A. Paulo：资源提供、研究。
S. Dasgupta：资源提供、资金筹集、方法论制定。
S.P. Gygi：监督、资金筹集。
M.E. Feigin：监督、资金筹集、项目管理、审稿和编辑。

致谢：

我们感谢Edna Cukierman博士、Jason Pitarresi博士和David Tuveson博士慷慨捐赠的细胞系。同时感谢David Heppner博士在生物化学方面的见解，以及Tao Dai博士制定的肿瘤间质液分离方案。H.D. Reavis获得了Roswell Park Comprehensive Cancer Center Alliance Scholars Presidential Fellowship的支持。A.L. Smythers获得了Dana-Farber Cancer Institute Trustee Science Committee Fellowship和T32 HL160522项目的资助。NCI的P30CA016056项目资助了Roswell Park Comprehensive Cancer Center的比较肿瘤学共享资源的使用。本研究中报道的研究还得到了NIH国家转化科学促进中心（NCI）的资助，项目编号为UM1TR005296，资助方为布法罗大学。肿瘤间质液的分离工作得到了T32CA085183项目（资助A.N. Dimeck）和R01CA285707项目（资助S. Dasgupta）的支持。内容仅代表作者的观点，不一定代表NIH的官方立场。本研究还得到了SAS基金会和ELF基金会（M.E. Feigin）的资助。本文的补充数据可在Cancer Research Communications Online网站（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）获取。