TAM对Kras重组及存活率的剂量依赖性效应…… 开放获取

《Cancer Research Communications》：Dose-dependent effects of TAM on Kras recombination, survi... Open Access

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摘要

饮食中的宏量营养素组成已被证实是胰腺肿瘤发生的关键调节因素，然而富含脂质的饮食，尤其是生酮饮食（KD），对胰腺癌早期发展阶段的影响仍不清楚。为了研究饮食中的脂质如何影响Kras驱动的肿瘤的起始和进展，我们在Ptf1aCreERT2;KrasG12V（AcinarKrasG12V）小鼠模型中检测了低脂饮食（LFD）、高脂饮食（HFD）和KD的效果。与标准饮食（SD，87 ± 29天）和LFD（57 ± 27天；P = 0.02）相比，KD喂养的小鼠生存时间最短（中位数26 ± 7天；P = 0.02），而HFD喂养的小鼠相对于SD也有较短的生存时间（35 ± 25天；P = 0.05）。KD喂养与严重的葡萄糖不耐受和循环中的β-羟基丁酸水平升高相关。组织学上，KD喂养的AcinarKrasG12V小鼠发展出侵袭性的、肉瘤样胰腺导管腺癌（PDAC），而HFD喂养的小鼠则表现出分化不良的PDAC；在两组中，这些侵袭性肿瘤都与广泛的纤维化和肿瘤区域相比较高的间质CD39表达相关。蛋白质组学分析显示，在KD和HFD喂养的AcinarKrasG12V小鼠的肿瘤中，PI3K–Akt–mTOR和EGFR信号通路被激活。血清细胞因子/趋化因子分析显示KD喂养的AcinarKrasG12V小鼠存在促炎和促血管生成的微环境。总体而言，这些结果表明，在致癌Kras激活之前的饮食中增加脂质含量与早期胰腺肿瘤的加速和发展有利于肿瘤进展的微环境有关。这些发现强调了在胰腺癌高风险个体中使用KD时需要谨慎考虑。

意义：本文评估了在AcinarKrasG12V模型中，致癌Kras激活之前KD和HFD的影响。这些发现表明富含脂质的饮食会加速PDAC的进展，并对胰腺癌高风险个体的饮食建议具有重要意义。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）占所有胰腺癌病例的90%以上，是最具侵袭性和致命性的癌症之一，预计到2030年将成为癌症相关死亡的第二大原因（1）。饮食中的宏量营养素组成已被证实是胰腺肿瘤发生的关键调节因素。在KrasG12D小鼠中，高脂饮食（HFD）会加速胰腺上皮内肿瘤（PanIN）的形成，增强炎症和纤维化，并降低生存率（2, 3）。高碳水化合物饮食（HCD）也有类似但较不显著的效果，而高蛋白饮食对胰腺肿瘤的影响与对照组相比可以忽略不计（4）。最近使用可诱导的腺泡特异性KrasG12V/Trp53缺失小鼠的研究进一步表明，HFD会促进炎症性肿瘤发生和巨噬细胞介导的cathelicidin抗菌肽–P2X嘌呤受体7信号通路，驱动肿瘤的 plasticity 和转移（bioRxiv 2026.02.10.703309）。有趣的是，由80%至90%脂肪组成的生酮饮食（KD）在临床和临床前研究中显示出抗肿瘤效果（5）。通过提高循环中的酮体水平，KD使细胞代谢重新编程为利用脂肪酸和酮体，同时限制葡萄糖的可用性。由于癌细胞严重依赖有氧糖酵解来维持生长，限制碳水化合物已被提出作为一种抑制肿瘤进展的代谢策略（6）。然而，KD对PDAC的影响似乎取决于具体情境。当KD与标准化疗结合使用时（7, 8）或给予肥胖的KrasG12D小鼠时（bioRxiv 2025.05.20.655200），KD可以改善生存率并延缓肿瘤进展。相比之下，在非肥胖的KrasG12D模型中，KD会加速肿瘤生长（bioRxiv 2025.05.20.655200）。这些发现突显了饮食与肿瘤相互作用的复杂性，并表明KD在胰腺癌中的预防潜力仍不确定。最近对健康供体胰腺的转录组分析显示了PanIN病变的意外存在，表明早期肿瘤病变可能很常见，并且可能通过饮食进行调节（9）。为了探讨饮食中的脂质含量如何影响早期胰腺肿瘤发生，我们使用Ptf1aCreERT2;KrasG12V（AcinarKrasG12V）小鼠模型研究了KD、HFD和低脂饮食（LFD）对胰腺疾病进展的影响，该模型允许在腺泡细胞中定时控制致癌Kras的激活。小鼠在Kras激活前接受了不同的饮食方案，并对其生存情况、组织病理学进展以及炎症和分子信号进行了监测。在这里，我们证明了在致癌Kras激活之前的饮食组成对胰腺癌的发展轨迹有深远影响。尽管HFD与疾病进展加速有关，但KD与比LFD和标准饮食（SD）更侵袭性的病理和更低的生存率相关。KD和HFD喂养的小鼠的肿瘤表现出PI3K–Akt–mTOR和EGFR信号通路的激活，并伴有系统性的促炎和促血管生成的细胞因子环境。这些发现表明，饮食中的脂质可以增强胰腺中的致癌和炎症通路，为饮食调节胰腺癌风险提供了新的见解。

材料与方法

动物实验

所有动物实验均按照德克萨斯大学休斯顿健康科学中心和内布拉斯加大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准的指南进行。Pft1aCreERT2小鼠（RRID:IMSR_JAX:019378）和野生型（WT）C57BL/6J小鼠（RRID:IMSR_JAX:000664）购自The Jackson Laboratory。带有CAG-lox-GFP-stop-lox-KrasG12V（cLGL-KrasG12V）的转基因小鼠来自德克萨斯州休斯顿的MD Anderson癌症中心的Craig Logsdon（10）。Ptf1aCreERT2小鼠与cLGL-KrasG12V小鼠杂交，生成在Cre激活后在胰腺腺泡细胞中特异性表达突变Kras的AcinarKrasG12V小鼠。AcinarKrasG12V和WT对照小鼠来自同一繁殖群体，并在整个研究过程中在相同的 Housing 条件下饲养。所有组别都包括了雄性和雌性小鼠。小鼠在12小时光/暗循环下饲养，并可自由摄取标准饮食（PicoLab Rodent Diet 20，LabDiet，#5053），直到进行饮食干预。标准饮食大约24.5%的能量来自蛋白质，13.1%来自脂肪，62.4%来自碳水化合物。

为了确定致癌Kras激活的剂量条件，8-10周大的AcinarKrasG12V小鼠接受了1、5或10毫克泰莫昔芬（TAM）的腹腔注射。根据给予的剂量，将小鼠分为KrasLow（1毫克）、KrasMod（5毫克）或KrasHigh（10毫克）组。治疗后，监测小鼠的生存情况，并收集胰腺组织以评估腺泡Kras重组、病变发展和胶原蛋白沉积。

在8至10周大时，小鼠要么继续接受标准饮食，要么随机分配到三种实验饮食中之一：KD（TD.160153，Teklad定制饮食；90%的能量来自脂肪）、HFD（TD.160239，Teklad定制饮食；75%的能量来自脂肪，其脂肪组成修改以更好地模拟KD），或KD对照饮食（LFD；TD.150345，Teklad定制饮食；13%的能量来自脂肪）。总共，研究包括三只WT和三只AcinarKrasG12V小鼠接受标准饮食，四只WT和四只AcinarKrasG12V小鼠接受LFD，四只WT和五只AcinarKrasG12V小鼠接受HFD，以及五只WT和五只AcinarKrasG12V小鼠接受KD。每种饮食的热量和确切组成在补充表S1中提供。小鼠在指定的饮食下饲养1个月，之后所有WT和AcinarKrasG12V小鼠都接受了1毫克的腹腔注射泰莫昔芬。在建立饮食依赖性代谢状态后，无论组别如何，都给予相同剂量的泰莫昔芬，以确保系统的代谢效果相同。在注射泰莫昔芬时记录体重，并在注射后2周再次记录体重。小鼠可以自由进食，以探索饮食如何调节胰腺肿瘤的最早阶段。

葡萄糖耐量测试在注射泰莫昔芬后10天进行。测试前，小鼠禁食6小时。葡萄糖剂量根据禁食后的体重计算（每公斤体重2.0克葡萄糖）。在葡萄糖注射前（基线）和之后15、30、60和120分钟从尾静脉采集血液样本。使用CONTOUR NEXT ONE血糖监测系统测定血糖浓度。

组织学染色

福尔马林固定的石蜡包埋组织被切片并安装在带电玻璃载玻片上。载玻片在Histo-Clear中脱蜡，通过分级乙醇水化，然后用苏木精染色。载玻片然后用伊红复染，用乙醇脱水，在Histo-Clear中清除，然后安装。

载玻片在60°C下烘烤，用Histo-Clear脱蜡，通过分级乙醇水化到PBS中，然后使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0，Vector Laboratories，目录号#H-3300，RRID:AB_2336226）或Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0，Abcam，目录号#AB93684）进行热介导的抗原回收。切片在室温下用10% FBS在PBST中封闭1小时，然后在4°C下过夜孵育与一级抗体：细胞角蛋白19（CK19；Abcam，目录号#ab52625，RRID:AB_2281020）、CD8α（Cell Signaling Technology，目录号#98941，RRID:AB_2756376）、CD39（Abcam，目录号#ab223842，RRID:AB_2889212）和CD73（Cell Signaling Technology，目录号#13160，RRID:AB_2716625）。第二天，载玻片在PBS中清洗，并在室温下用生物素标记的二级抗体孵育30分钟（Vector Laboratories，目录号#BA-1000，RRID:AB_2313606）。使用VECTASTAIN Elite ABC试剂盒（Vector Laboratories，目录号#PK-4000，RRID:AB_2336818）进行信号检测，然后用DAB底物（Vector Laboratories，目录号#SK-4100，RRID:AB_2336382）进行显色。切片用苏木精复染，通过分级乙醇脱水，在Histo-Clear中清除，然后安装。

使用Abcam Trichrome Stain Kit（目录号#ab150686）根据制造商的方案可视化结缔组织。简要地说，载玻片在Histo-Clear中脱蜡，通过分级乙醇水化到蒸馏水中，然后在预热的Bouin’s溶液中孵育60分钟（60°C）。用自来水冲洗后，切片依次用Weigert’s铁苏木精（5分钟）、Biebrich Scarlet/酸性品红（15分钟）、磷酸锰-磷酸钨酸（10-12分钟）和苯胺蓝（10-20分钟）染色。然后用醋酸处理切片5分钟，通过分级乙醇脱水，在Histo-Clear中清除，然后安装。

使用ImageJ软件（RRID:SCR_003070）对IHC和HE染色进行量化分析。分析每只小鼠的一个切片，根据组织大小选择3到5个代表性视野。对于IHC，使用颜色阈值工具识别阳性染色，并在组织间标准化信号。对于苏木精和伊红（H&E）染色的切片中的腺泡到导管化生（ADM）、PanIN或PDAC的分析，同样使用手动工具勾勒感兴趣的组织区域，并测量它们的相对面积。H&E切片还由不了解处理组的病理学家进行评估，以确认组织病理学特征。

反向相蛋白质测定（RPPA）分析在WT小鼠（标准饮食，n = 3；LFD，n = 2；KD，n = 3；HFD，n = 3）和AcinarKrasG12V小鼠（标准饮食，n = 3；LFD，n = 1；KD，n = 3；HFD，n = 3）的胰腺裂解物上进行。将少量整个冷冻胰腺组织在冰冷的裂解缓冲液中均质化[1% Triton X‐100，50 mmol/L HEPES（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，100 mmol/L NaF，10 mmol/L Na pyrophosphate，1 mmol/L Na3VO4，10%甘油]，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。裂解物在4°C下以14,000 rpm离心10分钟，收集上清液。使用BCA测定法测量蛋白质浓度，并用裂解缓冲液调整至1.5 μg/μL。样品与4× SDS样品缓冲液[40%甘油，8% SDS，0.25 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）按3:1的比例混合， boils 5分钟后在?80°C保存。在德克萨斯大学MD Anderson癌症中心的功能蛋白质组学核心设施进行RPPA分析（RRID:SCR_016649）。蛋白质裂解物依次在五个2倍稀释步骤中稀释，并使用Quanterix 2470 Arrayer阵列到硝化纤维素涂层载玻片上，每个载玻片生成5,808个点。每个载玻片包括实验样品、标准裂解物和阳性/阴性对照。每个载玻片用经过验证的一级抗体加上生物素标记的二级抗体进行探针检测。使用VECTASTAIN Elite ABC试剂盒（Vector Laboratories，目录号#PK-4000，RRID:AB_2336818）进行信号检测，然后用DAB底物（Vector Laboratories，目录号#SK-4100，RRID:AB_2336382）进行显色。切片用Hematoxylin复染，通过分级乙醇脱水，在Histo-Clear中清除，然后安装。

使用Abcam Trichrome Stain Kit（目录号#ab150686）根据制造商的方案可视化结缔组织。简要地说，载玻片在Histo-Clear中脱蜡，通过分级乙醇水化到蒸馏水中，然后在预热的Bouin’s溶液中孵育60分钟。用自来水冲洗后，切片依次用Weigert’s铁苏木精（5分钟）、Biebrich Scarlet/酸性品红（15分钟）、磷酸锰-磷酸钨酸（10-12分钟）和苯胺蓝（10-20分钟）染色。然后用醋酸处理切片5分钟，通过分级乙醇脱水，在Histo-Clear中清除，然后安装。

使用ImageJ软件（RRID:SCR_003070）对IHC和HE染色进行量化分析。分析每只小鼠的一个切片，并根据组织大小选择3到5个代表性视野。对于IHC，使用颜色阈值工具识别阳性染色，并在组织间标准化信号。对于苏木精和伊红（H&E）染色的切片中的腺泡到导管化生（ADM）、PanIN或PDAC的分析，同样使用手动工具勾勒感兴趣的组织区域，并测量它们的相对面积。H&E切片还由不了解处理组的病理学家进行评估，以确认组织病理学特征。

反向相蛋白质测定（RPPA）分析在WT小鼠（标准饮食，n = 3；LFD，n = 2；KD，n = 3；HFD，n = 3）和AcinarKrasG12V小鼠（标准饮食，n = 3；LFD，n = 1；KD，n = 3；HFD，n = 3）的胰腺裂解物上进行。将小块整个冷冻胰腺组织在冰冷的裂解缓冲液中均质化[1% Triton X‐100，50 mmol/L HEPES（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，100 mmol/L NaF，10 mmol/L Na pyrophosphate，1 mmol/L Na3VO4，10%甘油]，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。裂解物在4°C下以14,000 rpm离心10分钟，收集上清液。使用BCA测定法测量蛋白质浓度，并用裂解缓冲液调整至1.5 μg/μL。样品与4× SDS样品缓冲液[40%甘油，8% SDS，0.25 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）按3:1的比例混合， boiling 5分钟，然后在?80°C保存直至分析。RPPA分析在德克萨斯大学MD Anderson癌症中心的Functional Proteomics Core Facility进行（RRID:SCR_016649）。蛋白质裂解物在五个2倍稀释步骤中连续稀释，并使用Quanterix 2470 Arrayer阵列到硝酸纤维素涂层载玻片上，每个载玻片生成5,808个点。每个载玻片包括实验样品、标准裂解物和阳性/阴性对照。每个载玻片用经过验证的一级抗体加上生物素标记的二级抗体进行探针检测。信号使用Agilent GenPoint系统放大，并用DAB比色反应显色。切片使用Huron TissueScope扫描，然后用Array-Pro Analyzer软件（Media Cybernetics）量化斑点强度。使用RPPA SPACE软件（MD Anderson生物信息学和计算生物学部门）通过逻辑“supercurve”拟合确定相对蛋白质表达（11）。为每个抗体生成一个拟合曲线，以稀释步骤作为独立变量，信号强度作为响应。蛋白质水平通过双向中值中心化算法进行了标准化处理（针对每种抗体在所有样本间，以及每种样本中所有抗体的平均水平）。进一步应用基于重复样本的标准化方法（RBN），并使用对照样本来校正样本间的变异，以便能够直接比较不同RPPA批次的结果（12）。使用R语言中的limma软件包（RRID:SCR_010943，版本4.5.2，RRID:SCR_001905）评估了野生型（WT）和AcinarKrasG12V小鼠在不同饮食组间的蛋白质差异表达。为了控制假发现率，采用了Benjamini–Hochberg方法进行多重假设检验校正。火山图（volcano plot）的生成采用了P < 0.01和|log2FC| = 0.2的显著性阈值，其中FC表示倍数变化，并使用ggplot2软件进行了可视化处理（RRID:SCR_014601）。KEGG通路富集分析仅针对显著上调的蛋白质进行（P < 0.05且|log2FC| ≥ 0.10）。蛋白质标识符通过org.Mm.eg.db（RRID:SCR_023488）映射到小鼠基因标识符，并使用R语言中的clusterProfiler包（RRID:SCR_016884；organism = mmu）进行了富集分析。富集通路的排序依据是富集P值，每个通路中贡献的蛋白质数量以“hit”计数表示。

血清细胞因子和趋化因子谱型分析使用了Proteome Profiler Mouse XL Cytokine Array试剂盒（ARY028；R&D Systems），该试剂盒可同时检测111种细胞因子/趋化因子的相对表达水平。实验按照制造商的方案进行，通过化学发光信号强度来确定相对表达水平。分析中包含了每个组的一个生物学重复样本（血清样本）：WT SD、AcinarKrasG12V SD、WT KD和AcinarKrasG12V KD。成像工作在Bio-Rad ChemiDoc仪器上进行（RRID:SCR_019037）。血清细胞因子表达的热图是使用R语言中的pheatmap（RRID:SCR_016418）软件生成的。

血清丙酸酯水平通过Acetate Colorimetric Assay Kit（MilliporeSigma，产品编号#MAK086）进行定量。血清β-羟基丁酸（β-OHB）水平使用β-Hydroxybutyrate Assay Kit（MilliporeSigma，产品编号#MAK041）进行测定。血清淀粉酶水平使用Pointe Liquid Amylase（CNPG3）试剂套装（MedTest DX，产品编号#23-666-111）进行测量。天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平使用AST（SGOT）– IFCC液体试剂套装（Teco Diagnostics，产品编号#A559-150）进行测定。所有实验均按照制造商的说明进行。

统计分析使用GraphPad Prism软件（RRID:SCR_002798）中的非配对t检验和单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后进行Sidak或Tukey多重比较检验。对于生存分析，采用Kaplan–Meier方法估计生存曲线，并使用log-rank（Mantel–Cox）检验进行组间比较。

**TAM剂量决定了腺泡Kras重组的程度，并影响胰腺疾病的进展**

此前，我们的实验室研究表明，TAM剂量的不同会导致胰腺导管中KrasG12V的差异表达，从而引发早期和晚期的PanIN细胞以及侵袭性PDAC（13）。在这里，我们试图验证TAM剂量是否与腺泡细胞中致癌性Kras的激活程度以及随后的疾病进展相关。AcinarKrasG12V小鼠分别接受低剂量（1 mg，KrasLow）、中等剂量（5 mg，KrasMod）或高剂量（10 mg，KrasHigh）的TAM处理。如图1A所示，TAM处理激活了腺泡细胞中的Ptf1aCreERT2，诱导了LSL-KrasG12V等位基因的重组。Kaplan–Meier生存分析显示TAM对生存有剂量依赖性效应：KrasLow小鼠的生存期延长，有些小鼠存活超过100天，而KrasMod和KrasHigh小鼠的生存期显著缩短，分别在约46天和约20天内死亡。危险比分析证实，与KrasLow小鼠相比，KrasMod和KrasHigh小鼠的死亡风险显著增加（P < 0.01；图1B）。通过绿色荧光蛋白（GFP）表达的丢失来评估腺泡细胞内的重组效率，也显示出明显的剂量依赖性效应（图1C和D）。KrasLow小鼠的重组率为约26%，KrasMod小鼠约为46%，KrasHigh小鼠几乎完全重组（约98%），所有比较均具有高度显著性（P < 0.0001）。组织病理学评估进一步表明，胰腺病变的类型和严重程度与TAM剂量有关（图1D–G）。KrasLow小鼠的PanIN病变比KrasHigh小鼠更严重（P < 0.001；图1E）。相反，KrasHigh小鼠的侵袭性PDAC病变更为明显，显著高于KrasMod（P < 0.001）和KrasLow（P < 0.001）小鼠（图1F）。三色染色显示，与KrasLow小鼠相比，KrasMod（P < 0.05）和KrasHigh（P < 0.05）小鼠的胶原沉积增加（图1G）。综上所述，这些结果表明TAM剂量决定了腺泡KrasG12V的重组程度，并与从PanIN到PDAC的疾病进展轨迹密切相关。因此，选择1 mg剂量进行后续的饮食干预研究，因为它能诱导部分重组，主要引起PanIN病变，并延长生存期，为评估不同饮食暴露对早期胰腺肿瘤的发生和发展提供了理想的条件。图1。

**KD饮食与AcinarKrasG12V小鼠的生存率降低和葡萄糖耐受性恶化相关**

为了确定饮食组成是否会影响PDAC的发展，将8至10周大的WT和AcinarKrasG12V小鼠分别维持在标准饮食（SD）或随机分配到三种饮食中的任何一种：低脂肪饮食（LFD）、高脂肪饮食（HFD）或卡路里限制饮食（KD）。在每种饮食下持续一个月后，这些小鼠接受了1 mg的TAM处理，并监测其生存情况和体重（图2A）。接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的中位生存时间最短（26 ± 7天），显著低于接受SD饮食（87 ± 29天，P = 0.02）和LFD饮食（57 ± 27天，P = 0.02）的小鼠。同样，HFD饮食也与生存期缩短相关（35 ± 25天，P = 0.05，与SD饮食相比，图2B）。这些发现表明KD和HFD都会加速疾病进展并导致更早的死亡。在实验终点时，接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的体重显著减轻（P = 0.05；图2C）。正如预期的那样，KD饮食显著增加了WT小鼠的血清β-OHB水平（与SD饮食相比，P = 0.003；与HFD饮食相比，P = 0.02），AcinarKrasG12V小鼠也表现出类似的趋势（KD vs. SD和HFD，P = 0.0001）。此外，接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的β-OHB水平也高于KD饮食的WT对照组（P = 0.03；图2D）。图2E显示了TAM处理后3周WT和AcinarKrasG12V小鼠的血糖水平。在WT小鼠中，KD饮食导致葡萄糖耐受性受损，表现为曲线下面积（AUC）显著增加（与SD饮食相比，P = 0.03；与LFD饮食相比，P = 0.01）。在比较不同基因型时，AcinarKrasG12V小鼠的葡萄糖AUC低于WT小鼠（P = 0.02；图2F）。接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的胰腺重量增加，胰腺重量与体重的比例也显著高于WT对照组，而接受SD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的胰腺重量和胰腺重量与体重的比例显著降低（图2G和H）。在两种基因型中，不同饮食对血清丙酸酯、淀粉酶或AST水平没有显著影响（图2I–K）。

**KD饮食与AcinarKrasG12V小鼠的生存率降低和WT对照组葡萄糖耐受性增加相关**

为了确定饮食组成是否会影响PDAC的发展，将8至10周大的WT和AcinarKrasG12V小鼠分别维持在标准饮食（SD）或随机分配到三种饮食中的任何一种：LFD、HFD或KD。在每种饮食下持续一个月后，这些小鼠接受了1 mg的TAM处理，并监测其生存情况和体重（图2A）。接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的中位生存时间最短（26 ± 7天），显著低于接受SD饮食（87 ± 29天，P = 0.02）和LFD饮食（57 ± 27天，P = 0.02）的小鼠。同样，HFD饮食也与生存期缩短相关（35 ± 25天，P = 0.05，与SD饮食相比，图2B）。这些发现表明KD和HFD都会加速疾病进展并导致更早的死亡。在实验终点时，接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的体重显著减轻（P = 0.05；图2C）。与KD饮食的WT小鼠相比，KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的血清β-OHB水平也显著升高（P = 0.03；图2D）。TAM处理后3周测量的WT和AcinarKrasG12V小鼠的血糖水平如图2E所示。在WT小鼠中，KD饮食导致葡萄糖耐受性受损，表现为曲线下面积（AUC）显著增加（与SD饮食相比，P = 0.03；与LFD饮食相比，P = 0.01）。在比较不同基因型时，AcinarKrasG12V小鼠的葡萄糖AUC低于WT小鼠（P = 0.02；图2F）。接受KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的胰腺重量增加，胰腺重量与体重的比例显著高于WT对照组，而接受SD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的胰腺重量和胰腺重量与体重的比例显著降低（图2G和H）。图2显示，在两种基因型中，不同饮食对血清丙酸酯、淀粉酶或AST水平没有显著影响（图2I–K）。

**KD饮食与AcinarKrasG12V小鼠的生存率降低和WT对照组葡萄糖耐受性增加相关**

**KD饮食与非肥胖型AcinarKrasG12V小鼠的纤维化增加和PDAC进展相关**

由于接受KD和HFD饮食的AcinarKrasG12V小鼠的生存结果最差，接下来我们通过组织学和免疫组化（IHC）分析进一步研究了组织层面的变化。图3A显示了在不同饮食条件下，AcinarKrasG12V小鼠胰腺组织切片中ADM、PanIN和PDAC、CK19、三色染色、CD8、CD39以及CD73染色的代表性图像。病理学评估显示病变级别和组织结构存在显著差异（表1）。与喂食标准饮食（SD）的小鼠相比，喂食高脂肪饮食（HFD）和极高脂肪饮食（KD）的AcinarKrasG12V小鼠中，被侵袭性、类肉瘤型PDAC替代的胰腺比例显著更高（P < 0.0001），而喂食低脂肪饮食（LFD）的小鼠则表现出中度分化的肿瘤（P = 0.01）。喂食HFD的AcinarKrasG12V小鼠中低分化PDAC的比例也增加（P = 0.0007；图3B）。这些数据表明，KD和HFD都与AcinarKrasG12V小鼠中侵袭性和侵袭性PDAC的发展有关。CK19+区域的百分比表明，在喂食LFD、KD和HFD的AcinarKrasG12V小鼠中，导管样分化增加（P = 0.02、P = 0.002和P = 0.003；图3C）。通过胶原+区域评估的纤维化在喂食KD的AcinarKrasG12V小鼠中显著增加，这些小鼠表现出最强的纤维化反应（P = 0.005 vs. SD；P = 0.0002 vs. LFD）。与LFD相比，喂食HFD的AcinarKrasG12V小鼠的纤维化也显著增加（P = 0.01；图3D）。此外，喂食HFD的AcinarKrasG12V小鼠中的CD8+ T细胞数量显著减少，这表明HFD可能与肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫浸润减少有关（图3E）。与各自的肿瘤组成部分相比，喂食KD和HFD的AcinarKrasG12V小鼠中的基质CD39表达显著增加，而CD73表达在不同饮食组之间没有显著差异（图3F和G）。总体而言，这些发现表明饮食组成与AcinarKrasG12V小鼠的胰腺病变严重程度、纤维化及免疫细胞景观相关，KD和HFD对应于更侵袭性的疾病表型。图3。

表1显示了在不同饮食条件下AcinarKrasG12V小鼠胰腺组织切片的病理学评估结果。饮食类型包括：

- **标准饮食（SD）**：主要为正常腺泡结构，可见残留腺泡；几乎没有恶性证据；轻度至中度炎症浸润；中度分化病变；胰岛细胞增生。
- **低脂肪饮食（LFD）**：恶性区域涉及腺泡区域；轻度炎症；总体为中度分化病变。
- **高脂肪饮食（KD）**：存在肉瘤样转化，轻度至中度炎症，中性粒细胞浸润导致细胞死亡和损伤相关因子（DAMPs）的释放；观察到干细胞活性增加。
- **极高脂肪饮食（HFD）**：恶性显著，病变高度分化；几乎无炎症。

KD和HFD与AcinarKrasG12V小鼠中纤维化增加和PDAC进展有关。A图显示了喂食SD、LFD、KD和HFD的AcinarKrasG12V小鼠的胰腺组织代表性图像，包括ADM、PanIN病变、PDAC、CK19免疫染色、三色染色以及CD8、CD39和CD73表达。比例尺为50 μm。B图为堆叠条形图，显示不同饮食组中ADM、PanIN和PDAC的百分比。C图量化了喂食SD、LFD、KD和HFD的AcinarKrasG12V小鼠的（C）CK19+上皮区域、（D）胶原沉积（三色+区域）和（E）每只小鼠的CD8+ T细胞数量。F图和G图分别量化了不同饮食条件下肿瘤和基质组成部分中的CD39表达（强度×%面积）和CD73表达（强度×%面积）。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），组间显著性用字母对表示（a = SD, b = LFD, c = KD, d = HFD；B），以及带有Sidak检验的单因素方差分析（C–E）和带有Sidak检验的双因素方差分析（F和G）。数据以均值±标准误（SEM）表示。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。

HFDs和KD与肿瘤信号传导的重编程和系统细胞因子谱的变化有关。

鉴于喂食KD和HFD的小鼠表现出更侵袭性的组织病理学特征，我们接下来试图确定这些饮食诱导效应的分子信号通路。我们对整个胰腺组织进行了RPPA分析，以评估致癌和炎症信号传导的局部变化（补充表S2）。火山图突出了与喂食标准饮食（WT）对照组相比，在喂食LFD、KD和HFD的小鼠中显著的蛋白质变化（P < 0.01，|log2FC| > 0.2）（图4A）以及在AcinarKrasG12V模型中（图4B）。与喂食SD的AcinarKrasG12V小鼠相比，喂食LFD的小鼠有12种蛋白质发生变化（7种下调和5种上调），喂食KD的小鼠有18种蛋白质发生变化（8种下调和10种上调），喂食HFD的小鼠有21种蛋白质发生变化（10种下调和11种上调）。几种蛋白质在KD和HFD组中都存在共同的变化，包括Akt、GSK3β、磷酸化S6（Ser235/236）、磷酸化AMPKα（Thr172）、paxillin和YTHDF2的上调，以及PUMA、STAT5A、c-kit、PHGDH、FASN和ASNS的下调。此外，喂食LFD的小鼠表现出Akt和磷酸化CREB（Ser133）的上调以及PUMA、STAT5A和c-Kit的下调（补充表S3；图4B）。为了识别受这些蛋白质组学变化影响的生物过程，进行了KEGG通路富集分析。图4C–E分别显示了与喂食SD相比，喂食LFD、KD和HFD的AcinarKrasG12V小鼠的前10个富集KEGG通路。在所有饮食组中，多个通路普遍上调，包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、趋化因子信号传导、mTOR信号传导、PI3K–Akt信号传导、胰岛素抵抗、Rap1信号传导和VEGF信号传导通路（补充表S4；图4C–E）。

为了确定KD和HFD导致疾病进展加速的系统因素，我们分析了喂食SD和KD的WT和AcinarKrasG12V小鼠的血清细胞因子谱（补充表S5）。热图（图5A）显示了KD组中血清细胞因子水平的改变，其中AcinarKrasG12V小鼠的变化最为显著。KD组小鼠的Ang-2、CCL6、LDLR、MMP-9、PAI-1、PTX3、TNFSF13B和OPG的血清水平升高，并且在喂食KD的AcinarKrasG12V小鼠中进一步升高（图5B）。此外，CCL11、CD14和FGF-21水平升高，而CX3CL1和IL12p40在喂食KD的AcinarKrasG12V小鼠中降低。这些发现表明，KD与系统性的促炎和促血管生成细胞因子环境有关，这与胰腺中PI3K–Akt–mTOR和EGFR信号通路的激活一致。这些组织和血清水平的改变共同揭示了富含脂质的饮食如何促进AcinarKrasG12V小鼠中的胰腺肿瘤进展。

饮食组成越来越被认为是一个可调节的因素，能够影响胰腺癌的风险，但其对KRAS驱动的转化最早阶段的影响仍不清楚。利用一种可诱导的腺泡特异性Kras模型，我们发现肿瘤前的饮食暴露与胰腺疾病进程的显著差异有关。KD和HFD都与疾病进展加速、侵袭性PDAC增加和生存率降低相关，与喂食SD和LFD相比。先前的研究表明，腺泡细胞在炎症和KrasG12D突变的作用下具有可塑性（14–17），我们的发现扩展了我们对腺泡细胞在KrasG12V突变背景下对饮食变化反应的理解。这些发现表明，在致癌激活之前，宏量营养素的平衡与胰腺组织对KRAS信号的反应有关，富含脂质的饮食对应于有利于侵袭性肿瘤形成的条件。超过90%的人类PDAC携带激活型KRAS突变，这确立了KRAS作为疾病发生的主要驱动因素（18, 19）。尽管PDAC表现为导管组织学特征，但实验和人类研究支持腺泡细胞是通过KRAS依赖的ADM成为主要起源细胞（20, 21）。与常用的PDAC模型相比，包括用于晚期和转移性疾病的KPC模型以及在不同胰腺细胞谱系中具有持续KrasG12D激活的KC模型，我们开发的TAM诱导的腺泡特异性KrasG12V模型能够实现对致癌激活的时间控制（22, 23）。这一特性使得该模型特别适合研究饮食等环境因素如何在胰腺肿瘤发生的早期调节KRAS信号通路。本研究中使用的不同饮食代表了不同的代谢状态，这些状态可能影响胰腺癌的风险和进展。极低碳水化合物和高脂肪含量的KD饮食会诱导营养性酮症，并逐渐被研究作为癌症的代谢干预手段，尽管其在PDAC中的效果仍具有情境依赖性（bioRxiv 2025.05.20.655200；参考文献5, 7, 8）。相比之下，HFD饮食反映了与肥胖相关的西方饮食习惯，这种饮食与肥胖、代谢功能障碍和胰腺癌风险增加有关（24–26）。LFD饮食则实现了最低的脂肪摄入量以及较高的碳水化合物暴露，从而允许在不同的宏量营养素状态下进行比较。SD饮食作为生理参考饮食，为实验饮食提供了代谢基线。类似的宏量营养素组合在先前的PDAC研究中被广泛使用，有助于跨研究比较（bioRxiv 2025.05.20.655200；参考文献2–4, 7, 8）。HFD饮食的有害影响与先前的研究结果一致，即高脂肪饮食会促进KrasG12D和KrasG12V/Trp53缺失小鼠模型中的腺泡损伤、ADM（腺泡变性）和PDAC进展（bioRxiv 2026.02.10.703309；参考文献2, 3）。此外，我们的结果也与新兴证据相符，即KD饮食可能会加速非肥胖Kras突变体模型中的PDAC发展，但在肥胖相关环境中则可能延缓肿瘤进展（bioRxiv 2025.05.20.655200）。这种情境依赖性表明，是否受益或受损取决于代谢状态本身，而不仅仅是KD饮食本身。重要的是，由于KD和LFD都代表了极端的代谢状态，观察到的效果可能反映了全身性的代谢应激，而不仅仅是脂肪或碳水化合物本身的影响。在我们的研究中，喂食KD饮食的WT小鼠出现了显著的葡萄糖耐受不良现象，这一表型也在长期喂食KD饮食的非肥胖啮齿动物中被报道过（27）。这些发现与胰岛素敏感性下降相关，尽管我们没有测量胰岛素和C肽的水平。鉴于胰岛素抵抗会增强PI3K–Akt–mTOR信号通路，而这一通路与KRAS协同作用促进肿瘤早期发展，因此饮食诱导的代谢应激可能导致了KD饮食小鼠的疾病进展加剧（28, 29）。此外，KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠相对于WT对照组观察到的较低葡萄糖AUC可能反映了肿瘤相关的系统性葡萄糖利用改变，而不是代谢功能的改善。虽然LFD饮食比KD或HFD饮食的损害性小，但我们的发现与先前的研究结果一致，即富含碳水化合物的饮食也会促进早期胰腺病变（4）。我们研究中使用的LFD饮食（77%碳水化合物）在组成上与Zhu及其同事评估的HCD饮食相似（4），他们发现HCD饮食会导致KrasG12D小鼠的生存期缩短、ADM增加、炎症加重和PanIN形成增加。他们的研究表明，富含蔗糖的碳水化合物来源可能与有害效应特别相关，这与流行病学观察结果一致，即高摄入简单糖或含果糖的饮料与胰腺癌风险增加有关（30）。总体而言，我们的结果支持这样一个观点：无论是过量的饮食脂肪还是高比例的快速代谢碳水化合物都与早期胰腺肿瘤恶化有关，尽管富含脂质的饮食影响最为显著。KD和HFD饮食都与胶原沉积增加和间质CD39表达升高相关。CD39与CD73一起调控细胞外腺苷的产生，并与免疫调节信号通路相关（31）。临床和临床前研究表明，间质CD39和肿瘤CD73与PDAC的不良预后相关，并可能抵消CD8+肿瘤浸润的有利影响（32）。因此，在KD和HFD饮食小鼠中观察到的间质和免疫改变与支持更晚期疾病的微环境一致。此外，最近的研究表明，β-HB通过赖氨酸β-羟基丁酰化稳定了上皮-间质转分化调节因子Snail，从而增强肿瘤侵袭性（33）。这种表观遗传机制为酮体暴露增加与KD饮食的AcinarKrasG12V小鼠中观察到的导管转化和纤维化增强之间的联系提供了合理的解释。在系统层面，KD饮食引发了促炎和促血管生成的细胞因子谱，如Ang-2、MMP-9、PAI-1、PTX3和TNFSF13B等水平升高。这些细胞因子已知能促进细胞外基质重塑、组织侵袭和血管生成，表明KD饮食可能有助于形成促进肿瘤发展的系统环境（21, 34, 35）。蛋白质组学分析进一步揭示了饮食驱动的多种机制。KD和HFD饮食都与多个致癌通路的激活相关，包括PI3K–Akt–mTOR、EGFR、趋化因子信号通路以及与PDAC发生和发展密切相关的胰岛素抵抗通路。这些发现与在已建立的肿瘤模型中的报告相反，在那里KD饮食会抑制AKT和ERK信号通路，尤其是在与化疗联合使用时（7）。这种差异突显了疾病阶段的重要性：早期PanIN病变可能利用高脂质可用性和酮体来促进生长，而已建立的肿瘤对相同的营养条件以及与化疗结合时的反应可能不同。因此，饮食暴露的时间点相对于致癌事件的发生可能是决定生物学结果的关键因素。RPPA和细胞因子分析使用了有限数量的生物学样本，因此被视为探索性和假设生成的。相应地，这些数据集中的通路级发现应被视为初步结果。此外，由于研究中未包括车辆对照组，因此难以区分饮食的特定效应与TAM和饮食诱导的代谢状态之间的潜在相互作用。未来的功能研究应该评估抑制PI3K–Akt–mTOR信号通路、调节CD39相关免疫通路或阻断关键细胞因子网络是否可以改变KD和HFD饮食小鼠中观察到的PanIN向PDAC的加速进展。这些研究将有助于确定这些变化是直接导致饮食相关的胰腺肿瘤，还是仅仅与疾病进展相关。总之，我们的发现表明，在致癌Kras激活之前的饮食脂质含量与胰腺癌的起始和进展存在显著差异。KD和HFD饮食都与纤维化、免疫重塑、CD39间质表达增加、系统性炎症以及关键致癌通路的激活相关，这些共同导致了从PanIN到PDAC的加速进展。这些结果有助于我们更好地理解饮食如何影响早期肿瘤演变，并强调了在胰腺癌高风险人群中必须仔细考虑高脂肪或生酮饮食模式。数据可用性

RPPA和血清蛋白质组学分析的原始数据分别可在补充表S2和S5中找到。本研究生成的所有其他数据可向相应作者咨询获得。作者披露

K.A. Klute报告了来自Revolution Medicines和Bristol Myers Squibb的资助，以及来自Pfizer的个人费用；Ipsen也在本工作之外提供了个人费用。其他作者未报告任何披露。作者贡献

U.K. Sardarni：数据管理、正式分析、初稿撰写。E.Y. Faraoni：数据管理、正式分析、研究方法。A.M. Waller：数据管理、正式分析。L.N. Strickland：数据管理、正式分析、研究。B. O’Brien：数据管理、研究。K.A. Klute：撰写、审阅和编辑。J.L. Cox：正式分析、研究。F. McAllister：研究、撰写、审阅和编辑。J.M. Bailey-Lundberg：资源支持、正式分析、资金获取、项目管理、撰写、审阅和编辑。致谢

本研究中报告的研究得到了NIH下属NCI的支持，资助编号为P30 CA036727（UNMC CCSG癌症中心资助）。内容仅代表作者的观点，并不一定代表NIH的官方立场。部分数据是通过使用功能性蛋白质组学RPPA核心设施生成的，该设施部分由NCI通过P30CA016672资助（MD Anderson癌症中心）。本研究中报告的研究并未直接通过P30CA016672资助（MD Anderson癌症中心），也不在该资助范围内。J.M. Bailey-Lundberg获得了NCI（R01CA277161-01A1, R21CA249924）和美国国防部（DOD；HT94252410921）的资助。F. McAllister获得了NCI（1R37CA237384, R01 CA282786）、德克萨斯州癌症预防研究所（RP200173）以及DOD（HT94252310665）的支持。注意：本文的补充数据可在Cancer Research Communications Online（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）上获取。