U2af1S34F和U2af1Q157R髓系肿瘤相关热点突变在小鼠中诱导独特的造血表型

《Leukemia》：U2af1S34F and U2af1Q157R myeloid neoplasm-associated hotspot mutations induce distinct hematopoietic phenotypes in mice

　　

复发性体细胞突变在剪接体基因SF3B1、SRSF2和U2AF1中频繁发现于患有髓系肿瘤（如骨髓增生异常综合征）的患者中。研究人员表征了表达U2AF1中两个热点突变（编码S34F和Q157R替换）的在体后果。结果表明，这两种突变在小鼠中诱导了独特的造血表型，提示U2AF1S34F和U2AF1Q157R突变不应被混为一谈，因为它们可能对患者的疾病发病机制产生不同影响。与表达U2af1Q157R/+的小鼠相比，表达U2af1S34F/+的小鼠其血液和骨髓细胞计数减少更为严重，且干细胞重建能力降低。在小鼠和人类样本中，两种突变之间的靶基因表达和剪接在很大程度上是独特的，这可能驱动了任一突变诱导的表型差异。这两种突变在患者中与不同的基因突变共现，且在髓系肿瘤中的代表性并不均等，这表明多种机制可能驱动U2AF1突变体的疾病发病机制。总的来说，研究人员的結果支持U2AF1S34F和U2AF1Q157R突变在在体情况下诱导了独特的造血、基因表达和RNA剪接表型。未来需要更大规模的人群研究来确定这些表型变化是否转化为患者的临床病理差异，从而证明其应被单独分类。

论文解读：U2AF1热点突变在髓系肿瘤中的差异化致病机制

研究背景与立项依据

骨髓增生异常肿瘤（MDS）、骨髓增殖性肿瘤（MPN）及继发性急性髓系白血病（sAML）等髓系肿瘤中，剪接体基因（SF3B1、SRSF2、U2AF1）的复发性体细胞突变检出率高达30%–60%。其中，U2AF1作为剪接因子具有特殊性，其两个热点位点——第34位丝氨酸（S34）和第157位谷氨酰胺（Q157）——在患者中常发生突变，且分别与独特的mRNA剪接后果相关。既往研究表明，携带不同U2AF1突变的患者可能在共突变谱系及造血表型上存在差异，提示S34F与Q157R突变或许不应被归为同一病理机制。然而，缺乏直接的体内功能比较研究。为此，研究人员构建了条件性敲入小鼠模型，旨在阐明这两种突变在造血系统内的特异性影响。该研究成果发表于《Leukemia》。

关键技术方法概述

本研究主要采用条件性基因敲入小鼠模型，分别构建了携带U2af1^S34F/+（MGS34F）和U2af1^Q157R/+（MGQ157R）突变的品系，并利用Mx1-Cre系统诱导造血细胞中的突变表达。研究人员通过竞争性骨髓移植实验评估造血干细胞（HSC）的重建能力，利用流式细胞术分析外周血及骨髓中各系血细胞计数及造血干祖细胞（HSPC）亚群比例。在分子层面，通过对骨髓Kit⁺Lineage^?Sca-1^?（KL）细胞进行mRNA测序（RNA-seq）和差异可变剪接分析（rMATS），揭示了基因表达与剪接层面的变化。此外，研究还整合分析了多个已发表的MDS和AML患者RNA-seq数据集，并通过RT-PCR验证了关键剪接异构体。最后，研究人员统计了487例髓系肿瘤患者的测序数据，分析了不同U2AF1突变在不同疾病亚型中的分布频率及共突变特征。

研究结果

建立U2af1基因座条件性敲入Q157R突变的小鼠模型

研究人员成功构建了模拟人类U2AF1^Q157R突变的条件性敲入小鼠模型（MGQ157R），并与已有的MGS34F模型进行了平行比较。通过Southern blot及靶向测序验证，确认了突变等位基因在造血细胞中的正确表达。值得注意的是，Q157R突变不仅导致氨基酸替换，还创建了一个新的5'剪接位点，导致表达出一种在突变密码子后框内缺失四个氨基酸的次要异构体（Q157Rdel）。

U2AF1^S34F与U2AF1^Q157R导致小鼠不同的造血改变

在原生造血条件下，U2af1^S34F/+小鼠表现出显著的白细胞（WBC）减少、红细胞（RBC）计数及血红蛋白下降，并伴有平均红细胞体积（MCV）升高。相比之下，U2af1^Q157R/+小鼠除MCV升高外，其余血常规指标未见显著变化。流式分析显示，S34F突变导致短期造血干细胞（ST-HSC）、KL细胞及共同髓系祖细胞（CMP）数量显著减少，而Q157R突变的影响相对较轻。在红系分化方面，S34F突变在骨髓和脾脏中造成明显的核红细胞分化阻滞，而Q157R突变仅引起脾脏中轻微的非显著性改变。

U2af1^S34F/+HSC在骨髓重建实验中受损程度显著高于U2af1^Q157R/+HSC

竞争性骨髓移植实验进一步证实了细胞内在的差异。移植了U2af1^S34F/+供体细胞的受体小鼠，其外周血、骨髓及脾脏中的供体细胞嵌合率在多系细胞中均显著降低。相反，U2af1^Q157R/+供体细胞的嵌合率降低幅度较小，表明S34F突变对HSC的长期重建功能损害更为严重。二次移植实验也复现了这一结果，证明Q157R突变HSC的功能受损程度轻于S34F突变。

半合子U2af1^Q157R/?与U2af1^S34F/?HSC在骨髓重建实验中均严重受损

为了探究野生型U2AF1表达对突变体细胞的生存必要性，研究人员分析了半合子突变体（即不表达野生型蛋白）的表型。结果显示，无论是U2af1^S34F/?还是U2af1^Q157R/?，其供体细胞的嵌合率在移植后均迅速丢失，表明两种突变体HSC的存活均依赖于野生型U2AF1的表达，这支持了U2AF1为单倍体必需基因（haplo-essential gene）的特性，同时也说明Q157R虽然表型较轻，但同样损害了U2AF1的正常功能。

U2AF1^S34F与U2AF1^Q157R在小鼠髓系祖细胞中诱导独特的基因表达改变

对KL细胞的RNA-seq分析显示，S34F和Q157R突变诱导的基因表达谱在PCA分析中明显分离。S34F突变组鉴定出185个差异表达基因（DEGs），而Q157R组仅有77个，两者共享的DEGs极少（仅12个）。基因集富集分析（GSEA）揭示，S34F突变细胞中p53通路显著富集，而两种突变均导致免疫反应相关Hallmark通路的负富集。

U2AF1^S34F与U2AF1^Q157R在小鼠髓系祖细胞中诱导独特的可变前mRNA剪接改变

利用rMATS软件分析发现，S34F和Q157R突变导致的差异剪接事件（DSEs）重叠率极低（约8.3%）。S34F突变主要导致外显子跳跃（SE）且倾向于外显子排除，而Q157R突变则较为均衡地分布于内含子保留（RI）和外显子跳跃。序列分析表明，两种突变偏好不同的3'剪接位点（3'SS）共识序列：S34F偏好-3位为C（外显子包含）或T（外显子跳跃），而Q157R偏好+1位为G（外显子包含）或A（外显子跳跃）。

U2af1^S34F/+与U2af1^Q157R/+小鼠模型重现了MDS和AML患者中的可变前mRNA剪接改变

通过整合分析三个公共MDS/AML患者RNA-seq数据集，研究人员发现患者样本中U2AF1突变导致的剪接改变与小鼠模型高度一致。约20%的异常剪接基因在人和小鼠样本中是共享的。功能注释显示，S34F共享基因显著富集于mRNA结合、应激颗粒（stress granules）及翻译相关通路，而Q157R共享基因则富集于组蛋白结合和DNA损伤应答通路。RT-PCR验证进一步证实了特定转录本（如H2AFY、SETD5、CLIP1）在突变小鼠和患者样本中存在一致的异常剪接模式。

U2AF1^R156/Q157突变在CMML和MPN患者中的富集程度高于U2AF1^S34F突变

回顾性分析487例患者数据发现，U2AF1^R156/Q157突变在慢性粒单核细胞白血病（CMML）和MPN中更为常见，而U2AF1^S34F突变则在继发性AML（sAML）和AML中占比较高，在MDS中两者比例相近。共突变分析显示，S34F倾向于与NRAS、FLT3及BCOR共现，而Q157R则倾向于与ASXL1、CBL、PTPN11及CSF3R共现。

结论与讨论

本研究通过系统的体内外实验证实，U2AF1的两个热点突变S34F和Q157R在小鼠模型中诱导了截然不同的造血表型、基因表达谱及RNA剪接模式。研究人员得出结论：U2AF1^S34F突变导致更严重的造血功能障碍和干细胞重建缺陷，而U2AF1^Q157R的影响相对温和。这种分子与细胞水平的异质性也反映在临床流行病学数据中，表现为不同突变在特定髓系肿瘤亚型中的偏好性及独特的共突变谱系。这些发现强调了在分子分型及临床管理中区分U2AF1不同热点突变的重要性，并为未来针对特定突变亚型的精准治疗策略开发提供了理论基础。