综述：氧化还原信号调节共生链球菌中的亚硝酸盐转运

《Redox Biology》：Redox Signaling Modulates Nitrite Transport in a Commensal Streptococcus

　　

共生链球菌通过产生过氧化氢(H2O2)——一种具有强效抗菌活性的氧化还原活性分子——来调节口腔健康和稳态。研究人员团队先前已表明，副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)不仅利用H2O2拮抗口腔及呼吸道病原体，还通过将H2O2与环境易得的亚硝酸盐(NO2-)反应，产生过氧亚硝酸盐(ONOO-)等活性氮物种(RNS)。口腔链球菌产生H2O2需要丙酮酸氧化酶(PoxL)的活性，该酶对于副血链球菌抑制邻近病原体并在多微生物感染期间调节稳态至关重要。然而，H2O2如何影响副血链球菌中的NO2-摄取仍属未知。本研究探讨了PoxL在副血链球菌中NO2-转运及NO2-依赖性适应性和生理中的作用。与野生型细菌相比，缺乏PoxL导致黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)模型中的生物膜发育和定植减少，然而，外源性NO2-的补充恢复了poxL突变体的生物膜形成和定植缺陷。对poxL突变体的进一步分析显示，其细胞内NO2-水平低于野生型。支持这些发现的是，甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白(Spaf_1142)的表达在poxL突变体中显著低于野生型，并且添加过氧化氢酶(Catalase)后该表达亦降低。最后，研究人员观察到poxL突变体中多种糖酵解蛋白减少且ATP生成下降，而亚硝酸盐的添加增加了ATP产量。总之，这项工作强调了PoxL活性和H2O2产生对NO2-转运和代谢的协调调控作用。

引言

口腔是一个动态环境，可被超过700种不同的微生物物种定殖，这些物种在各种口腔表面形成多微生物生物膜群落。微生物定殖依赖于pH值、温度、氧张力、唾液流速、组织类型、地形复杂性和代谢通量等多种环境条件。各种口腔微生物分泌的代谢物在口腔微生物群的结构和功能中起着关键作用，并可能控制疾病结果。链球菌作为口腔中的主要菌属，是调节健康与生态失调的主要定殖者，部分原因是通过分泌具有协同或拮抗活性的代谢产物来调节种间相互作用。副血链球菌是一种缓症链球菌，可产生过氧化氢(H₂O₂)，这是一种有效的抗菌剂，可抑制口腔病原体并促进健康。此外，H₂O₂可以与其它细菌衍生的代谢物反应以影响微生物竞争。例如，由反硝化细菌从膳食硝酸盐(NO₃^-)还原而来的亚硝酸盐(NO₂^-)与副血链球菌产生的H₂O₂反应，生成活性氮物种，如过氧亚硝酸盐(ONOO^-)，这是一种有效的抗菌剂，可在体外和体内阻碍口腔及呼吸道病原体的生长。值得注意的是，副血链球菌对高浓度NO₂^-，甚至在H₂O₂存在下都具有抗性。这些研究表明，副血链球菌产生的H₂O₂和NO₂^-协同作用以保护宿主免受致病菌侵害，从而促进口腔稳态。然而，副血链球菌介导的H₂O₂产生与NO₂^-利用之间的调节相互作用尚不清楚。本研究中，研究人员利用poxL缺陷型突变体评估了H₂O₂产生如何调节副血链球菌对NO₂^-的利用。

材料与方法

细菌菌株和培养条件：使用了副血链球菌FW213、ΔpoxL突变体和ΔpoxL::poxL互补菌株。菌株在Todd Hewitt肉汤(THB)中培养。亚硝酸钠(NaNO₂)、硝酸钠(NaNO₃)、H₂O₂和过氧化氢酶(Catalase)分别以2 mM、500 μM、1.5 mg/mL的浓度使用。

结晶紫生物膜测定和共聚焦显微镜：将过夜培养的副血链球菌、ΔpoxL和ΔpoxL::poxL稀释于含1%蔗糖的胰蛋白酶大豆肉汤酵母提取物(TSBYE)中，在96孔板中培养16小时。使用结晶紫法量化生物膜生物量。对于共聚焦显微镜观察，使用尼康A1R/SIM共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像，并利用MATLAB R2024a和BiofilmQ 1.0.1分析图像以评估生物膜体积和平均荧光强度。

黑腹果蝇定殖试验：利用口服蔗糖喂养的黑腹果蝇模型评估细菌定殖。果蝇先在含有抗生素的食物上清除原生微生物组，然后暴露于含有5%蔗糖(+/- 2 mM NaNO₂)的细菌悬液中感染24小时，之后粉碎果蝇并计数菌落形成单位(CFUs)。

RT-qPCR分析：收集生物膜细胞提取RNA并逆转录为cDNA，利用iQ SYBR Green Supermix和特定引物对甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白(Spaf_1142)的基因表达进行分析。

细胞内亚硝酸盐定量：使用Griess试剂试剂盒测量细胞内和细胞外亚硝酸盐浓度，并将细胞内亚硝酸盐浓度标准化为已知NO₂^-浓度的标准曲线。

SDS-PAGE和质谱蛋白质分析：收集生物膜细胞裂解液和上清液，通过SDS-PAGE凝胶分离并进行考马斯蓝染色，差异表达的条带经 excision 后进行质谱分析。

ATP分析：利用BacTiter–Glo微生物细胞活力测定法量化细胞内ATP水平，并将ATP浓度标准化为总蛋白浓度。

统计分析：使用Prism软件进行数据分析，采用双向ANOVA确定P值，统计显著性设定为P ≤ 0.05。

结果

过氧化氢产生的缺陷增加了在有或无亚硝酸盐情况下的共生菌生长

为了理解PoxL与NO₂^-之间的关系，研究人员首先检查了野生型(WT)、ΔpoxL突变体和ΔpoxL::poxL互补菌株在2mM NaNO₂存在下的生长情况。结果显示，poxL突变体在基础状态和2mM NaNO₂存在下均表现出增加的指数期生长，表明副血链球菌的生长受H₂O₂产生的控制。相比之下，互补菌株在有无2mM NaNO₂^-的情况下均表现出较差的稳定期生长，这归因于其产生近双倍于野生型的H₂O₂。这些发现共同说明了H₂O₂的产生控制了副血链球菌的生长速率。

亚硝酸盐恢复PoxL缺陷导致的生物膜发育和体内定殖减少

先前的研究表明，副血链球菌H₂O₂产生的调节调节了生物膜的发育。研究发现，poxL突变导致生物膜形成减少。外源性亚硝酸盐对野生型和互补菌株的生物膜无显著影响，但显著增加了poxL缺陷生物膜的生成。共聚焦显微镜显示，poxL突变体生物膜显示出较少的聚集和微菌落形成，而添加2 mM NaNO₂促进了微菌落的发展和聚集。定量分析证实，ΔpoxL突变体的生物膜体积和高度显著降低。在体内实验中，poxL突变体在黑腹果蝇中的定殖存在缺陷，但添加2 mM NaNO₂恢复了这种缺陷。这些发现表明，NO₂^-不仅促进了PoxL缺陷型菌株在体外和体内条件下的适应性，还突出了PoxL活性对于定殖和生物膜形成的重要性。

在缺乏PoxL的情况下，细胞内亚硝酸盐和甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白的表达降低

研究人员测量了野生型和poxL突变体细胞中的细胞内NO₂^-浓度。有趣的是，ΔpoxL突变体显示出比野生型和互补菌株更低的细胞内亚硝酸盐，且这一现象不受细菌生长的影响。为了排除反硝化活性的影响，研究人员检测了暴露于NO₃^-的细胞，确定该共生菌不进行硝酸盐/亚硝酸盐还原。在野生型菌株中添加过氧化氢酶和NaNO₂导致细胞内NO₂^-降低。为了进一步确定机制，研究人员测量了甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白(Spaf_1142)的表达。在2 mM NaNO₂存在下，野生型细胞显示Spaf_1142表达增加，而该转运蛋白在ΔpoxL突变体中下调。此外，当野生型和ΔpoxL突变体细胞同时暴露于2 mM NaNO₂和过氧化氢酶时，Spaf_1142未显示显著变化。这些数据表明，H₂O₂可能作为一种信号分子调节亚硝酸盐的转运。

外源性过氧化物不能恢复PoxL缺陷的亚硝酸盐摄取

为了确认H₂O₂是否作为信号分子直接调节副血链球菌的亚硝酸盐摄取，或者PoxL本身是否影响摄取，研究人员测量了在外源性H₂O₂存在下甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白Spaf_1142的表达。虽然Spaf_1142的表达在外源性H₂O₂和NaNO₂同时存在时增加，但外源性过氧化物未能恢复ΔpoxL突变体的Spaf_1142基因表达。此外，外源性H₂O₂未能将ΔpoxL突变体降低的细胞内NO₂^-恢复到野生型水平。这些结果表明，PoxL活性和H₂O₂的产生共同调节了副血链球菌的亚硝酸盐摄取，突显了H₂O₂的氧化还原活性、PoxL功能与NO₂^-转运之间独特的调节相互作用。

副血链球菌的代谢活动在亚硝酸盐存在下增加

在其他链球菌物种中，PoxL同源物SpxB已被表征为调节其下游蛋白的活性。为了确定副血链球菌PoxL如何影响亚硝酸盐摄取和生物膜发育，研究人员利用质谱分析了浮游和生物膜蛋白裂解物。在ΔpoxL突变体中观察到约35 kDa蛋白标记处的蛋白丰度显著降低，而外源性亚硝酸盐恢复了这一降低。质谱分析显示，L-乳酸脱氢酶(Ldh)、磷酸甘油酸激酶(Pgk)、乙酸激酶(AckA)和丙酮酸激酶(Spaf_0783)在暴露于外源性NO₂^-的ΔpoxL突变体细胞中比未处理的突变体细胞增加。尽管poxL突变体显示出轻微的生长优势，但这些结果表明，PoxL的缺失可能会降低负责NADH和ATP产生的代谢活动。研究人员观察到浮游和生物膜poxL突变体细胞中的细胞内ATP产生减少，但添加2 mM NaNO₂恢复了ATP产生的减少。这些发现揭示了亚硝酸盐依赖性增加的副血链球菌代谢活动和ATP产生可能恢复了PoxL缺陷的生物膜，并可能导致了WT和ΔpoxL细菌菌落的形态学差异。

讨论

作为口腔的共生菌和主要定殖者，副血链球菌通过产生H₂O₂拮抗口腔病原体，后者可与唾液NO₂^-反应生成RNS。本研究的结果揭示了PoxL介导的H₂O₂产生与NO₂^-之间独特的相互作用，这种作用控制了副血链球菌适应性的重要方面。PoxL的缺失导致与野生型细胞相比的生长优势，无论是否有亚硝酸盐，这表明副血链球菌的生长受益于氧化还原活性的降低，但以生物膜发育和细菌定殖为代价。

先前的研究表明，副血链球菌的生物膜发育是由细胞表面粘附素Fap1和BapA1介导的。然而，本研究揭示了PoxL和亚硝酸盐在副血链球菌生物膜发育中的作用。PoxL的同源物SpxB已被证明影响肺炎链球菌中细菌粘附素的表达。虽然Fap1和BapA1已在副血链球菌中得到很好的表征，但许多粘附素仍未表征，目前尚不清楚这些粘附素如何受亚硝酸盐影响以促进生物膜发育。研究人员观察到poxL突变体细胞内亚硝酸盐减少，且外源性过氧化物的存在未能恢复，这揭示了PoxL、H₂O₂产生和亚硝酸盐转运在细菌粘附中的独特作用。

硝酸盐感应和氧化还原活性通过调节生物膜基质等各种成分影响生物膜发育。在肺炎链球菌中，spxB的缺失导致代谢活动失调，影响碳水化合物可用性和荚膜生产。本研究表明，poxL的缺失导致糖酵解酶减少，这些酶对副血链球菌的代谢至关重要，但在亚硝酸盐存在下增加。具体而言，磷酸甘油酸激酶(PGK)和丙酮酸激酶(PK)的增加是关键，它们负责ATP产生和丙酮酸。此外，研究还显示L-乳酸脱氢酶(LDH)和乙酸激酶增加，这已被证明可增加ATP产生并在调节变异链球菌的环境应激反应和口腔定殖持久性中起关键作用。这进一步支持了亚硝酸盐在促进副血链球菌在口腔中适应性的重要性。

总之，这项研究揭示了一种氧化还原信号和亚硝酸盐转运之间的调节相互作用，这种作用协调了副血链球菌的关键功能。研究人员描述了PoxL和亚硝酸盐通过调节副血链球菌中的亚硝酸盐转运和代谢通量在生物膜形成中的关键作用，这影响了ATP产生和生物膜基质。推测：1)过氧化氢作为一种信号分子控制细胞内亚硝酸盐；2)PoxL可能直接调节亚硝酸盐转运蛋白的表达和/或副血链球菌对亚硝酸盐的下游消耗。总体而言，PoxL不仅对副血链球菌的过氧化氢产生至关重要，而且调节生物膜发育和亚硝酸盐转运，这对于口腔中的微生物适应性和竞争至关重要。