通过含有神经干细胞的hydrogel（水凝胶）调节微环境，加速糖尿病伤口愈合

《Regenerative Therapy》：Accelerated diabetic wound healing via microenvironmental modulation treated by hydrogel encapsulated with neural stem cells

　　宋俊英|朱一夫|张玉飞|周宇|宋宝强
第四军医大学西京医院整形外科，中国西安市710032

**摘要**
**引言**
糖尿病伤口愈合是一个高度协调、多阶段的过程，严重依赖于促再生的微环境。最近，基于干细胞的疗法在再生医学中成为一个有前景的方向，这主要归功于它们固有的自我更新能力、多谱系分化潜能和促进修复的分泌组。尽管取得了这些进展，神经干细胞（NSCs）在皮肤伤口修复中的治疗潜力仍很大程度上未被探索。

**方法**
我们系统评估了NSCs对内皮细胞的促血管生成、抗氧化和线粒体调节作用。设计了一种受生物启发的水凝胶用于NSCs的封装，该水凝胶具有良好的初步生物相容性。然后，在糖尿病小鼠中评估了含有NSCs的水凝胶的体内促愈效能。

**结果**
NSCs增强了内皮细胞的血管生成、抗氧化能力和线粒体功能。这种工程化的水凝胶在封装NSCs方面表现出良好的初步生物相容性。该平台通过调节炎症、促进血管生成和发挥神经支持作用，加速了糖尿病伤口的愈合。

**结论**
这种载有NSCs的水凝胶平台为糖尿病伤口修复提供了一种有前景且具有临床相关性的策略。

**1. 引言**
糖尿病足溃疡是糖尿病最常见的严重并发症之一，由于其高致残率和死亡率而成为临床上的一大挑战[[1], [2], [3], [4]]。这些溃疡还具有较高的复发率，在3到5年内复发率为65%[4]。虽然有手术、负压疗法和高压氧疗法等传统治疗方法，但它们的临床应用往往受到高成本和患者依从性不佳的限制。糖尿病伤口愈合常受到多种相互关联的病理因素的影响，其中主要是血管生成不足和氧化应激增加[5]。越来越多的证据强调了神经调节在伤口修复中的重要性。例如，伤口边缘的施万细胞通过分泌TGF-β3来促进邻近细胞的迁移[6]。降钙素基因相关肽（CGRP）感觉神经元也通过调控神经-免疫轴来促进中性粒细胞和巨噬细胞表达TSP-1，从而促进愈合反应[7]。
因此，基于干细胞的再生疗法成为了一个有前景的治疗途径。干细胞的有效性主要来源于它们的自我更新能力、多谱系分化能力以及分泌促进修复因子。各种类型的干细胞，包括脂肪来源的干细胞[8,9]、骨髓来源的间充质干细胞[10]、外胚层间充质干细胞[11]和人脐带间充质干细胞[12]，已在糖尿病模型中显示出显著的促进伤口闭合的效果。然而，神经干细胞（NSCs）作为一种特殊的干细胞群体，在糖尿病伤口修复中的应用仍大部分未被探索，尽管它们在管理创伤性脑损伤[13]和脊髓损伤[14,15]等神经系统疾病方面已证明有效。NSCs的一个潜在优势在于它们固有的神经支持作用。
细胞疗法的一个关键转化障碍是细胞在恶劣的病理伤口环境中的迅速丢失[16,17]。水凝胶支架由于其高含水量和可调的三维结构，提供了一个理想的解决方案[[18], [19], [20]]。作为一种模拟细胞外基质（ECM）的水凝胶，它可以响应特定的病理信号。透明质酸是一种天然存在的线性多糖，也是人类ECM的关键成分，具有低免疫原性[[21], [22], [23]]。其分子链上丰富的官能团，特别是羧基和羟基，便于进行化学修饰和多种凝胶化策略。此外，透明质酸水凝胶的机械性能可以通过凝胶化条件进行精细调节，以适应不同的临床应用。
在本研究中，我们首先发现NSCs能够保护内皮细胞免受氧化应激并恢复线粒体功能。随后，我们设计了一种受生物启发的水凝胶系统用于NSCs的封装，以调节糖尿病伤口微环境。该水凝胶通过将苯硼酸修饰的透明质酸与聚乙烯醇交联，形成具有动态粘接特性的三维网络。这种载有NSCs的水凝胶系统作为一种新的联合治疗策略，经过全面的体外细胞相容性和体内生物安全性评估。在糖尿病小鼠模型中，我们的配方调节了免疫微环境，促进了血管生成，并发挥了神经支持作用，最终促进了伤口闭合。总之，我们的工作为NSCs提供了一种高效糖尿病伤口修复的水凝胶平台（图1）。

**2. 结果**
2.1. NSCs的治疗功能
从C57BL/6小鼠胚胎中分离出的NSCs在明场显微镜下显示出特征性的神经球形成（图S1）。通过免疫荧光染色鉴定Nestin和GFAP等典型标记物进一步确认了它们的表型（图1A）。

2.2. 载有神经干细胞的水凝胶的制备和表征
尽管NSCs的功能已得到证实，但直接将其悬浮液注入伤口部位会因细胞迅速丢失而受到限制。为克服这一限制，我们尝试使用水凝胶支架进行NSCs的封装。选择了苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA-PBA）作为骨架材料。通过与聚乙烯醇（PVA）交联，构建了水凝胶系统。引入的甲基丙烯酸基团还允许在405 nm蓝光下的光交联，从而精确调节水凝胶的机械性能。
在宏观层面上，水凝胶前体溶液在交联前保持液态。将HAMA-PBA与PVA混合并在405 nm蓝光下照射后，迅速发生凝胶化，形成稳定的水凝胶，倒置时不会流动，表明形成了坚固的三维网络（简称Gel）（图2A）。3D重建证实了NSCs在水凝胶基质中的成功封装和分布（图2B）。1H核磁共振（NMR）光谱确认了成功的 grafting，显示了甲基丙烯酸（标记为1）和苯硼酸（标记为2）团的特征性氢信号（图2C）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）进一步显示了与设计化学结构一致的特征吸收峰。通常，在HAMA和HAMA-PBA中观察到约1712 cm?1的独特伸缩振动，而在HA中则没有；同时，HAMA-PBA中出现了约1151 cm?1的B–O键特征峰（图2D）。压缩测试表明，该水凝胶在承受75.3%的压缩应变（相当于18,874 Pa的压缩应力） before failure（图2E）。扫描电子显微镜图像显示了蜂窝状的多孔形态，能量分散X射线光谱验证了C、N、O、P和B元素的存在，确认了所需的成分分布（图2F和2G）。体外降解测试表明，15天后仍有大约60%的水凝胶质量保留，证明其降解时间符合糖尿病伤口治疗的要求（图S4）。

2.3. 复合水凝胶的生物相容性和功能性
生物安全性是任何用于治疗应用的材料的基本前提。为了评估我们水凝胶系统的潜在细胞毒性，我们将HUVECs与不同处理组共培养，并在三个时间点（24小时、48小时和72小时）使用活/死染色评估细胞活力。所有组中的大多数细胞都表现出强烈的绿色荧光（表示活细胞），而红色荧光（表示死细胞）在整个培养期间都很微弱（图3A）。结果与CCK-8检测数据一致，显示出良好的细胞活力（图S5）。复合材料的良好初步生物安全性支持其进一步的治疗评估。

**3. 结论**
这种载有NSCs的水凝胶平台为糖尿病伤口修复提供了一种新颖且具有临床相关性的策略。此外，血液常规分析显示关键血液学参数没有显著差异，证实该水凝胶没有引起全身性的血液学改变（图S6）。总之，这些结果证实，在所测试条件下，开发的水凝胶没有明显的短期毒性，强调了其进一步治疗应用的潜力。此外，我们对复合水凝胶的功能性能进行了初步评估。结果显示，与对照组和仅含水凝胶的组相比，负载神经干细胞（NSC）的水凝胶能够调节氧化应激和线粒体膜电位，并促进血管生成，为后续的体内实验奠定了基础（图S7）。

2.4 水凝胶平台促进糖尿病小鼠的伤口愈合
基于NSC在体外显示出的促血管生成和抗压性特性，我们接下来在糖尿病小鼠伤口模型中评估了其效果。在每只小鼠的背部制造了一个全层切除伤口，并将动物分为四组：未经处理的对照组、仅含NSC的组、仅含水凝胶的组（简称Gel）以及负载NSC的水凝胶组（简称NSC@Gel）。通过数字成像和分析监测了12天内的伤口面积变化（图4A）。

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图4. 复合水凝胶处理的小鼠糖尿病伤口加速愈合。（A）本研究中动物实验的示意图。（B）伤口床的代表性宏观图像。（C）追踪伤口面积变化。棕色：第0天；蓝色：第3天；橙色：第6天；绿色：第12天。（D）残留伤口面积的量化（n = 5）。（E）伤口后12天的伤口长度量化（n = 5）。（F）伤口后12天的胶原蛋白沉积量量化（n = 5）。（G）伤口后12天的伤口组织HE染色（比例尺 = 1000 μm）。（H）伤口后12天的伤口组织Masson染色（比例尺 = 100 μm）。统计显著性通过单因素ANOVA确定，并表示为??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。简单大小n表示每次评估中包含的伤口数量。

在伤口后的第3天和第6天，未经处理的组仍然有明显的未愈合区域。相比之下，NSC单独治疗和水凝胶单独治疗都导致不同程度的伤口缩小，其中复合水凝胶组表现出最明显的伤口收缩。在第12天，对照组显示出大量的未愈合区域，而仅用NSC或水凝胶治疗的组也检测到可见的伤口残留。值得注意的是，NSC@Gel组在第12天显示出 superior 的伤口闭合效果（图4B、4C、4D，图S8）。H&E染色组织学评估显示对照组有明显的未愈合区域。NSC或水凝胶单独治疗部分促进了伤口闭合，而NSC@Gel组表现出明显减小的伤口长度和更成熟、均匀形成的表皮。与对照组和仅含水凝胶组中观察到的稀疏毛囊结构相比，仅用NSC治疗增加了毛囊密度，而复合水凝胶组显示出更密集分布的毛囊（图4E和4G）。此外，Masson三色染色显示，NSC@Gel处理的伤口组织中胶原蛋白沉积显著增加且排列更整齐，表明细胞外基质重塑得到改善（图4F和4H）。

2.5 负载NSC的水凝胶在糖尿病伤口中发挥炎症调节、促血管生成和支持神经的作用
为了阐明水凝胶促进糖尿病伤口愈合的机制，本研究重点关注组织修复中的几个关键事件：炎症调节、血管生成和支持神经的作用。

白细胞介素-6（IL-6）被选为关键的炎症标志物，因为它在炎症级联反应中起着核心作用。在愈合的伤口中，NSC@Gel组显示出IL-6免疫荧光强度显著降低，而仅用NSC或水凝胶治疗未能充分缓解炎症（图5A和5F）。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）被用作血管再生的指标。在对照组中，α-SMA的表达可以忽略不计。仅含水凝胶的组（缺乏治疗负载）和仅用NSC治疗的组（可能由于缺乏支架介导的封装而快速细胞丢失）仅显示出有限的α-SMA阳性信号。相比之下，复合水凝胶（NSC@Gel）组显示出丰富的α-SMA表达（图5B和5G）。CD31特异性标记内皮细胞，允许初步量化微血管密度。我们的结果显示，对照组和仅含水凝胶组的血管密度较低，而复合水凝胶组的血管密度最高，优于仅用NSC的组（图5C和5H）。

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图5. 不同处理方法对伤口组织的免疫荧光染色。（A）IL-6（比例尺 = 80 μm）、（B）α-SMA（比例尺 = 50 μm）、（C）CD31（比例尺 = 50 μm）、（D）CGRP（比例尺 = 100 μm）和（E）NF200（比例尺 = 50 μm）在治疗后第12天的免疫荧光图像。（F）IL-6相对荧光强度的量化（n = 5）。（G）α-SMA阳性信号的量化（n = 5）。（H）血管数量相对量化的量化（n = 5）。（I）CGRP相对荧光强度的量化（n = 5）。（J）NF200相对荧光强度的量化（n = 5）。统计分析使用单因素ANOVA进行，显著性定义为?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。简单大小n表示每次评估中包含的伤口数量。

鉴于对伤口修复中神经和感觉调节作用的日益认识，我们进一步评估了NSC的支持神经作用。在对照组和仅含水凝胶组中几乎检测不到CGRP的免疫荧光，而NSC治疗显著增强了CGRP阳性区域。NSC@Gel组显示出CGRP表达增加，这可能是由于NSC的神经元分化和神经营养因子的分泌（图5D和5I）。此外，还进行了NF200的免疫染色。结果显示，仅用NSC治疗的组表现出相对明显的NF200表达，而在对照组和仅含水凝胶组中很少观察到。值得注意的是，复合水凝胶组显示出最显著的NF200表达，表明神经分布增加（图5E和5J）。

这些发现共同表明，负载NSC的水凝胶系统通过协调调节炎症微环境、促进血管生成和支持神经的作用来促进糖尿病伤口愈合。

3. 讨论
糖尿病伤口愈合是一个高度复杂的生物过程。有效的修复需要强大的血管生成来恢复营养和氧气供应，以及足够的细胞韧性来抵御恶劣的伤口微环境[28,29]。高血糖会加剧氧化应激，严重损害细胞功能，特别是线粒体稳态。感觉和神经支配在细胞行为中的关键调节作用受到了广泛关注，从而激励了针对神经微环境以积极加速伤口修复的策略[[30], [31], [32], [33]]。基于干细胞的疗法在再生医学中代表了重大进展。NSC具有强大的分化能力和强大的分泌组，可以调节炎症、促进血管化和保护细胞免受氧化损伤。在氧化应激下，NSC通过减少细胞内ROS和线粒体超氧化物水平以及恢复线粒体膜电位来提供细胞保护，从而在模拟的糖尿病环境中提高细胞适应性。为了提高其在糖尿病伤口中的转化效用，我们将NSC嵌入水凝胶基质中。我们在糖尿病小鼠的全层皮肤伤口模型中评估了这种水凝胶的治疗效果，明显加速了伤口愈合。组织学分析显示，复合水凝胶通过免疫调节和促血管生成活性创建了一个有利的微环境。它同时上调了CGRP和NF200的表达。与其他类型的干细胞（如脂肪来源的干细胞或骨髓间充质干细胞）相比，NSC在神经再生相关功能上可能具有优势，部分原因是它们在移植后能够在体内存活、整合和分化。这些综合效应突显了NSC在协调慢性伤口修复程序中的潜力。

未来研究可以进一步加强这项研究的几个方面。通过应用诸如体内细胞追踪等技术，可以更全面地了解移植NSC的命运，从而深入了解它们的保留、长期生存、整合和分化潜力。通过与间充质干细胞的实验比较，可以进一步证明该平台的治疗优势。此外，未来关于基于水凝胶的NSC递送的研究应包括自由细胞注射和水凝胶基方法之间的细胞持久性的直接比较。这些知识对于优化递送策略和最大化治疗效果至关重要。此外，还需要更全面的机制研究来阐明NSC介导的治疗效果的途径，特别是炎症调节、血管重塑和神经调节的作用，通过扩展免疫-神经-血管标志物的面板。阐明这些机制不仅将加强基于NSC的疗法的机制基础，还将为组合策略的合理设计提供依据。

虽然小鼠糖尿病伤口模型被广泛接受为标准的临床前平台，但需要注意的是，小鼠的伤口闭合受到收缩的严重影响，这一过程与人类观察到的愈合过程有很大不同。因此，未来的研究将受益于使用夹板策略来最小化这种混淆效应，从而更好地模拟人类伤口愈合，并在感染的慢性伤口模型中进行验证。最后，将这种负载NSC的水凝胶平台转化为临床应用将需要对其长期安全性、功能结果、微环境响应性和体内降解特性进行更全面的评估。通过对这些参数进行更大样本量的全面评估，将为这种方法在临床环境中的可行性和安全性提供关键证据。

总之，我们提出了一个多功能、具有转化相关性的基于水凝胶的平台，利用NSC的修复功能进行糖尿病伤口治疗，强调了将干细胞生物学与生物材料设计相结合以解决慢性伤口复杂病理生理学的潜力。

伦理批准和参与同意
本研究根据赫尔辛基宣言进行，并得到了第四军事医科大学伦理委员会的批准（批准编号20260004）。

作者贡献声明
Song Junying：撰写 - 原始草案、方法学、研究。
Zhu Yifu：研究、可视化。
Zhang Yufei：方法学。
Zhou Yu：撰写 - 审阅与编辑、监督。
Song Baoqiang：撰写 – 审阅与编辑、方法学、资金获取。