定时批量输入可为酶级联反应带来显著更高的产率

《Nature Chemistry》：Timed batch inputs unlock substantially higher yields for enzymatic cascades

　　摘要
无细胞酶促反应网络（ERNs）能够在单一反应中生产出高附加值的化合物。然而，别构相互作用、产物抑制、可逆性和对共享辅因子的竞争只有在ERN组装完成后才会显现出来。这些新兴的动态特性会形成动力学障碍，限制了整体产率。在这里，我们提出了一种基于模型的最优设计策略，用于生成批量反应的时变“配方”，其中每个组分都可以在任何时间以指定量反复添加。我们将该方法应用于两个ERN：戊糖磷酸途径和分支核苷酸回收途径。在戊糖磷酸途径中，优化后的输入使得AMP的产率提高了5.7倍，并将葡萄糖到产物的转化率从对照组的约12%提高到了约48%。在回收途径中，时变剂量平衡了竞争分支，使UTP的产率相对于一次性添加的所有组分提高了约21倍。定时批量添加提供了一种通用方法，用于优化复杂的反应序列。通过增加额外的激活或抑制项，或使用Hill型动力学模型，并没有改善模型的性能（见补充章节5.2和补充图18及19）。经过训练的模型能够处理时间依赖的批量输入。使用参数化适当的模型，我们切换到批量模式，并测试了核心假设，即时间依赖的试剂添加可以克服动力学障碍并显著提高ERN的产率。为了在整个反应过程中保持有利条件，优化过程在输入的时间和频率上没有限制，允许每5分钟添加新的酶、辅因子或底物。

图4a显示了三个优化的输入序列，每个序列采样不同的储备液浓度，以扩展探索的设计空间（见补充章节4.2和补充表4）。y轴表示添加的体积，x轴表示时间（以分钟为单位）；每种颜色对应一种特定的酶或底物（HK、G6PDH、6PGDH、PRI、PRPPS、葡萄糖、ATP或NADP）。这些非直观的给药计划涉及在不同时间和数量下重复添加多种成分。图4b将模型预测（橙色）与对照反应（绿色）进行比较，在对照反应中所有试剂都在t=0时添加。模拟和实验都显示最终产物浓度有显著增加。阴影区域表示预测的不确定性（标准差为2）。图4c显示了120分钟后测量的腺苷单磷酸（AMP）浓度，相对于对照实验提高了5.6倍（实验3）。最后，图4d报告了总产率，表示为葡萄糖转化为AMP的百分比。在实验2中，产率从对照组的约12%提高到优化后的时间依赖给药下的约48%。

图4：时间依赖批量实验的结果。

这种图像的替代文本可能是使用AI生成的。

全尺寸图像：
a. 三个时间序列显示了每种输入物质在ERN中的添加情况：HK、G6PDH、6PGDH、PRI、PRPPS、ATP、NADP和GLU。y轴表示添加到反应器中的体积（单位为μl），x轴表示添加时间。算法允许每5分钟添加一次输入物质，每个实验（1-3）从不同的储备液溶液中取样。
b. 时间序列图显示了模型对时间依赖批量实验（橙色）及其对应的对照实验（绿色）的预测（n=10，95%置信区间）。
c. HPLC测量的最终产物AMP的浓度（单位为μM）的条形图。时间依赖的批量实验（橙色）的最终AMP浓度明显高于对照实验（绿色），实验3的最终浓度相比对照实验增加了5.6倍（橙色条形上方的数字）。额外的对照实验表明，自发的ATP水解不会影响结果（见补充图13）。
d. 产率表明，在所有实验中，初始底物葡萄糖转化为AMP的比例显著高于对照组（产率=100 n(AMP)final/n(glucose)added）。值得注意的是，在实验2中，几乎一半的输入底物转化为了产物。

**图5：通过硅基优化输入方案降低成本**

在图5中，我们通过展示可以通过优化输入方案来在硅基上降低成本，从而针对每单位更有价值的输出分子PRPP的成本进行优化（AMP作为实验上可观测的代理）。图5a显示了时间依赖的批量运行与静态给药在t=0时的等效对照实验之间的硅基比较。每个橙色圆圈的大小反映了对照组与优化反应之间的倍数变化。y轴表示每毫克生产的成本；x轴表示最终产物浓度。平均而言，时间依赖的给药导致成本大幅降低（基于440个输入空间样本；见图5b）。当我们比较表现最佳的对照实验与表现最佳的时间依赖实验时，成本降低了约16倍（见图5c）。我们使用Sigma-Aldrich的价格列表作为此研究的参考（见补充章节5.3）。

**图5：通过蒙特卡洛采样输入空间对批量模式优化的成本进行硅基分析**

**全尺寸图像：**
a. 440个硅基实验的散点图：橙色表示优化的时间依赖输入，绿色表示t=0时的等效静态剂量对照。优化点的大小代表了对照组与时间敏感剂量之间的比率差异。y轴表示每毫克单位的对数成本（单位为欧元）；x轴显示反应达到稳态后产物AMP或PRPP的最终浓度。
b. 440个时间依赖实验和440个等效对照实验的平均成本（每毫克）。误差条表示优化实验和对照实验的平均值的标准误差（n=440）。
c. 在表现最佳的时间依赖实验和表现最佳的对照实验中发现的最低成本实验。

我们通过将其应用于第二个ERN来证明工作流程的通用性：该ERN是一种分支NSP，通过五种酶（APRT、UPRT、AK、PK和UMPK）和十个对照输入，将PRPP与腺嘌呤或尿嘧啶转化为ATP和UTP（见扩展数据图1和补充章节4.1）。首先，我们按照上述方法绘制了这个网络的动力学图（见扩展数据图2）。训练好的模型被用来生成批量模式的实验时间依赖协议，平衡了底物输入和辅因子的可用性。实验验证显示，UTP的产率和PRPP的转化率比作为内部参考的匹配成分同时添加的对照实验提高了约21倍（见扩展数据图3和补充章节4.2）。一个负对照实验验证了模型的预测能力。这个测试案例表明，这种工作流程可以有效地应用于分支的、竞争性的网络，并且时间依赖的控制可以引导这些ERN通过不同的生产状态。

**结论**

优化复杂ERN的性能仍然具有挑战性，因为当酶在网络中一起运作时，常常会出现隐藏的相互作用和不利的动力学障碍。通过在优化过程中引入时间作为一个明确的维度，我们将可设计的空间扩展了多个数量级，超出了仅改变初始条件的传统静态方法。例如，假设有八个成分，每个成分的剂量在1到10个任意水平之间，可以产生10^8种可能的实验。当引入时间依赖的给药，允许24次连续添加（如图4a所示，每5分钟一次）时，这个空间增长到了10^192种可能的输入序列。在这个庞大的空间中，存在一些非直观的给药轨迹，这些轨迹可以显著提高产率，然而，当酶和辅因子成本高昂或数量有限时，彻底的实验探索是不可行的。为了有效地访问这个空间，预测模型是必不可少的。因此，我们使用了一种主动学习的工作流程，设计了极具信息量的脉冲实验，使得在单次OED迭代内就能快速完成模型参数化。尽管流动反应器由于其支持连续扰动的能力而成为这些实验的理想平台，但原则上，如果可以获得足够的动态和多物种时间序列数据，这种方法也可以适应其他反应器格式。这意味着动力学表征和生产都可以以批量模式进行。

所得到的模型捕捉了控制ERN动态的关键敏感性，并允许系统地探索时间依赖的输入策略。利用这个模型，我们设计了批量模式的添加计划，最小化了抑制性相互作用，并将可逆反应的转化率提高了5到21倍，相对于传统的静态给药方法。尽管我们的实验专注于最大化总产率，我们还在硅基上展示了同一框架可以通过识别一条产率低16倍的路径来适应多个目标。

总体而言，我们的结果表明，模型引导的时间依赖输入设计可以克服复杂生化网络固有的动力学瓶颈。因为我们的工作流程是数据驱动的，并且是基于机制的，而不是特定于途径的，所以原则上它是与网络无关的。随着预测建模和自动化实验的不断进步，这种时间依赖的“配方”有望解锁最高效和最具成本效益的增值化合物的生产路线。

**方法**

**微流控反应器和控制单元**

一个CSTR（PPP实验的第一和第二次迭代的体积分别为121 μl，NSP实验的体积为158 μl），由聚（甲基丙烯酸甲酯）制成，配备了四个或五个入口，这些入口通过Y连接器增加到了八个或十个。出口管在实验之间不同，各自的体积也不同（PPP实验的第一和第二次分别为109 μl和69 μl，NSP实验为69 μl）（见补充图4和5）。酶和底物的输入流量由Cetoni neMESYS注射泵和Hamilton注射器控制，并且每12或15分钟改变一次。PPP实验和NSP实验的最低和最高流量范围分别为97–1,670、297–988和97–1,670 μl/h。PPP实验和NSP实验的停留时间范围分别为4–75、7–24和6–98分钟。通过收集出口处的液滴（PPP实验的第一和第二次分别为39 μl和29 μl，NSP实验为27 μl）来采样反应器内容物，并使用红外（IR）检测器记录每个液滴的时间（见补充图5）。IR传感器安装在分流收集器头部，以精确监测液滴收集的时间；控制软件可以在参考文献62中找到。PPP样品从CSTR出口管直接滴入盐酸胍溶液（8 M，PPP实验的第一和第二次分别为117 μl和87 μl），样品与盐酸胍的比例为1:3，并立即淬灭。NSP样品直接滴入甲酸溶液（30 V%，3 μl），样品与甲酸的比例为9:1，并立即淬灭。淬灭后的样品在6,708g的离心机中离心5分钟，上层清液（PPP样品为30 μl，NSP样品为20 μl）转移到HPLC小瓶的微插入管中，并通过HPLC进行测量。PPP样品使用方法1进行测量，而NSP样品使用方法2进行测量。有关流动设置的更多信息，请参见补充章节2.2，流动实验的储备液浓度可以在补充章节4.1中找到。

**HPLC测量**

HPLC分析是在Shimadzu Nexera X3仪器上进行的。条件如下：Inertsil ODS-4 C18柱（孔径3-μm，长度150 mm × 4.6 mm；GL Science）和一根保护柱（孔径3-μm；长度10 mm × 4.6 mm），温度为40°C。分析基于参考文献55。

**PPP样品的方法1：**
我们准备了洗脱液A，即50 mM的磷酸钾水溶液（pH 6.0），通过0.22-μm膜过滤；洗脱液B为100% MeOH。方法1的洗脱梯度如下：100%洗脱液A 2分钟，0–12.5%的B溶液线性梯度8分钟，12.5%的B溶液2分钟，12.5–40%的B溶液线性梯度6分钟，40%的B溶液2分钟，40–0%的B溶液线性梯度3分钟，100%的A溶液7分钟。流速保持在1 ml/min；注射体积分别为批量实验的10 μl、15 μl和20 μl。紫外检测波长为254 nm。

**NSP样品的方法2：**
我们准备了洗脱液A，即100 mM的磷酸钾水溶液（pH 6.4），其中含有8 mM的离子对试剂四丁基胺硫酸盐，通过0.22-μm膜过滤；洗脱液B为70%的A溶液和30%的乙腈。方法2的洗脱梯度如下：100%的A溶液13分钟，0–77%的B溶液线性梯度22分钟，77–100%的B溶液1分钟，100%的B溶液15分钟，100%的A溶液4分钟。流速保持在1 ml/min；注射体积分别为批量实验和流动实验的3 μl和1 μl。紫外线检测的波长为254纳米。有关HPLC和检测到的化合物的更多信息，请参见补充章节1.3。

**质粒制备**
(1) **PRI**
PRI基因通过引物从E. coli K12衍生的XL-1蓝色感受态细胞中扩增（加粗和下划线表示用于克隆到pET28a表达载体的限制性位点）：
RpiA-Fw: 5′TTAGTCAGTCATATGACGCAGGATGAATTGAAAAAAGCAGTAGG
RpiA-Rv: 5′ATAGATAGCCTCGAGTCATTTCACAATGGTTTTGACACCGTCAG
DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies，为标准去盐样品。

(2) **PRPPS**
PRPPS质粒来源于参考文献63。

(3) **UMPK**
UMPK基因通过引物从E. coli K12衍生的XL-1蓝色感受态细胞中扩增：
UMPK-Fw: 5′GCATGACGTAGTACATATGGCTACCAATGCAAAACCCGTCTATAAACGC
UMPK-Rv: 5′ACTGGTACGCCTCGAGTTATTCCGTGATTAAAGTCCCTTCTTTTTCACCC
DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies，为标准去盐样品。

(4) **APRT和UPRT**
APRT和UPRT酶的质粒是由Arthur和Dayie的实验室提供的赠品，来源于参考文献54。
相关材料可通过联系相应作者获取。有关质粒制备的更多信息，请参见补充章节2.3。

**初步批次实验**
在批次实验中，将五种PPP网络酶（HK、G6PDH、6PGDH、PRI和PRPPS）与底物葡萄糖以及辅因子ATP和NADP一起混合在缓冲液中（100 mM HEPES、10 mM MgCl2和1 mM CaCl2，pH 7.8），并在30°C下振荡反应120分钟。在反应时间点0、5、10、20、40、60和120分钟时，从每个反应管中取20 μl样本，用8 M的胍氯化物（60 μl）进行淬灭（样品与胍氯化物的比例为1:3），然后涡旋混合。之后，所有样本在6708 g的离心力下离心5分钟，取上清液（30 μl）进行HPLC分析。初步批次实验的条件和结果详见补充章节2.1。

**时间依赖性批次实验**
优化后的时间依赖性输入实验和对照实验是在批次条件下进行的，在对照实验中所有输入物质均在t=0时加入；而在优化实验中，输入物质在特定时间和体积下加入，具体见图4a（PPP）和扩展数据图3（NSP）。酶和底物的储备浓度详见补充表4。在反应时间点120分钟（PPP实验1-3）、370分钟（NSP实验1）和355分钟（NSP实验2）时，从对照组和优化组反应管中取样，按照补充章节1.3的方法进行淬灭和测量。时间依赖性批次实验的条件以及酶和底物的储备浓度详见补充章节1.2。

有关优化程序的详细描述，请参见补充章节3.1。有关算法和软件的更多信息，请参见补充章节3.2和3.3。有关进一步分析以评估最优设计效用的信息，请参见补充章节5。

**研究报告总结**
有关研究设计的更多信息，请参阅与本文关联的《自然》杂志报告总结（Nature Portfolio Reporting Summary）。