芳基融合双环[3.1.1]庚烷的合成及其作为萘类生物异构体的验证

《Nature Chemistry》：Synthesis of aryl-fused bicyclo[3.1.1]heptanes and validation as naphthyl bioisosteres

　　摘要：尽管萘基结构在药物和先导化合物中很常见，但由于其平面且富含sp2杂原子的特性以及易受细胞色素P450介导的代谢影响，这些结构的开发潜力常常受到限制。本文报道了可衍生化的芳基耦合双环[3.1.1]庚烷（BCHeps）作为萘类及其他融合杂环芳香族化合物的sp3富集生物等效物的研究，包括那些较少被使用的β-萘基单元。通过可见光能量转移实现的分子内交叉[2+2]光环加成反应，可以高效地合成BCHeps，并进一步将其多样性化为多种不同的骨架结构。研究表明，将基于BCHeps的萘基等效物引入AhR拮抗剂ezutromid中，既保留了关键的几何构型，又减少了sp2碳原子的比例。重要的是，这些类似物仍保持生物活性，并对CYP1A介导的代谢具有更好的稳定性。固态结构分析、细胞实验和微粒体研究证实，BCHep替代有效地减少了活性代谢物的生成，证明了芳基耦合的BCHeps是meta-取代芳香烃和2-萘的理想生物等效物。

尽管萘基结构在药物和先导化合物中频繁出现，但由于其平面、富含sp2杂原子的特性以及易于被细胞色素P450催化的代谢作用，这些结构的开发受到了局限。本文研究了可衍生的芳基耦合双环[3.1.1]庚烷（BCHeps）作为萘类及其他融合杂环芳香族化合物的生物等效物，特别是那些较少被使用的β-萘基单元的替代品。BCHeps通过可见光诱导的能量转移实现的分子内交叉[2+2]光环加成反应高效合成，并进一步被多样化为多种不同的骨架结构。研究表明，将基于BCHeps的萘基等效物引入AhR拮抗剂ezutromid中，不仅能保留关键的几何构型，还能减少sp2碳原子的比例。这些类似物不仅保持了生物活性，还对CYP1A介导的代谢具有更好的稳定性。固态结构分析、细胞实验和微粒体研究证实，BCHep替代有效降低了活性代谢物的生成，证实了芳基耦合的BCHeps是meta-取代芳香烃和2-萘的理想生物等效物。

萘环是先导化合物和商业可用药物及候选药物中常见的结构单元，例如普萘洛尔、萘普生、ezutromid和特比萘芬。然而，萘基容易发生代谢降解，通常通过1,2-萘氧化物中间体进行，后者会转化为谷胱甘肽加合物、羟基萘衍生物或反式-1,2-二氢-1,2-二羟基萘产物。这些二醇可能进一步氧化为高电负性的1,4-萘醌，从而与蛋白质共价结合并引起毒性副作用。这些氧化途径在α-萘基和β-萘基衍生物中均有观察到，且通常由多种细胞色素P450（CYP）酶（包括CYP1A1和CYP1B1亚家族）催化。此外，富含sp2杂原子的萘基具有“平面”结构，导致熔点较高且溶解度较差，限制了其在药物中的应用。因此，在药物发现过程中经常对萘基进行生物等效替代，通常是将其中一个苯环替换为其他功能基团（图1a）。例如，Bristol Myers Squibb在开发用于治疗前列腺癌的BMS-641988时将萘环替换为含三氟甲基的苯环；Vertex公司在开发FDA批准的囊性纤维化药物Ivacaftor时，将早期萘基化合物替换为1,3-叔丁基苯单元。我们小组在开发用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的第二代utrophin调节剂时，也尝试将2-萘基替换为卤代苯或三氟甲基苯衍生物，得到了同样活性的化合物。

萘环是一种常见的结构单元，存在于许多药物和候选药物中，如普萘洛尔、萘普生、ezutromid和特比萘芬。然而，萘基容易发生代谢降解，通常通过1,2-萘氧化物中间体进行，后者可转化为谷胱甘肽加合物、羟基萘衍生物或反式-1,2-二氢-1,2-二羟基萘产物。这些二醇可进一步氧化为高电负性的1,4-萘醌，后者可与蛋白质共价结合并导致毒性副作用。这些氧化途径在α-萘基和β-萘基衍生物中均有观察到，通常由多种细胞色素P450（CYP）酶（包括CYP1A1和CYP1B1亚家族）催化。此外，富含sp2杂原子的萘基具有平面结构，导致熔点较高且溶解度较差，限制了其在药物中的应用。

因此，在药物发现过程中经常对萘基进行生物等效替代，通常是通过替换其中一个苯环来实现（图1a）。例如，Bristol Myers Squibb在开发BMS-641988时将萘环替换为含三氟甲基的苯环；Vertex公司在开发FDA批准的囊性纤维化药物Ivacaftor时，将早期萘基化合物替换为1,3-叔丁基苯单元。我们小组在开发用于治疗杜氏肌营养不良症的二代utrophin调节剂时，也尝试将2-萘基替换为卤代苯或三氟甲基苯衍生物，得到了同样活性的化合物。

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图1：芳香环系统的生物等效替代策略。a. 萘基环的常见生物等效替代策略，通常涉及将一个苯环替换为其他功能基团或环系统。b. 苯基环的生物等效替代策略，包括BCP和BCHep结构。c. 本研究：BCHep萘基生物等效物的开发。

其他替代策略还包括将萘基环替换为杂芳香环，如喹啉、异喹啉、酞嗪、茚、苯并噻吩、吲哚等。饱和衍生物如四氢萘也已被使用，它们保留了原始萘基环的刚性及尺寸，同时增加了三维结构和潜在的溶解度。然而，目前的萘基替代物普遍缺乏通用性，并且物理化学性质较差。融合的杂环系统可能与母体化合物具有显著的不同性质，如脂溶性、极性表面积和氢键基团，这可能导致生物活性丧失。事实上，药物分子中较高的sp3杂化碳原子比例（更高的饱和度）被认为能提高临床成功的可能性，这通常与溶解度的提高或更有效地填充三维靶空间有关。将萘基替换为取代苯环时，几何结构与母体结构的重叠较差，替代可能性有限。用富含sp3杂原子的小环笼状碳氢化合物替代sp2富集的芳香环已成为改善候选药物物理化学和药代动力学性质的有希望的方法。特别是双环[1.1.1]戊烷（BCP）结构被广泛用于替代para-取代芳香烃，多个实例显示出更好的药物性质。最近，Anderson及其同事报道了双环[3.1.1]庚烷（BCHep）衍生物的合成和结构分析，证明了其作为meta-取代芳香烃的替代结构的有效性。然而，还需要进一步研究BCHep含药物的生物活性，以评估其作为真实生物等效物的潜力。此外，可以考虑将BCHep结构与六元芳香环融合，以形成萘、喹啉或喹唑啉等融合环系统的几何等效物。芳基耦合的BCHeps非常罕见，目前仅见于专利文献或虚拟分子中，尚未有正式的研究将其作为生物等效物使用。

本文报道了芳基耦合BCHep骨架的制备，并证实β-萘基的几何结构在BCHep中得以保持。我们将系统的应用范围扩展到多种环替代模式和杂环结构，为萘类、（异）喹啉和喹唑啉的生物等效替代提供了化学工具箱。作为概念验证，我们将utrophin调节剂ezutromid的萘基环替换为多种芳基耦合的BCHeps，证明其保持了生物活性并提高了对CYP酶的代谢稳定性。研究表明，芳基耦合的BCHep骨架可作为meta-取代芳香烃和萘的理想生物等效物。

结果与讨论：与“简单”的meta-芳香烃等效物相比，2-萘基的BCHep衍生物具有三种可能的区域异构体（图2a，彩色标注），从而允许精细调节分子性质。我们设想通过使用二乙烯基前体与BCHep进行分子内交叉[2+2]环加成反应来合成这些融合环系统（见补充信息中的完整合成步骤）。令人惊喜的是，我们能够通过铱催化的[2+2]光环加成反应在可见光诱导下生成芳基耦合的BCHep框架（作为17的等效物），该方法借鉴了Kwon及其同事的研究成果。作者认为这些反应通过激发的苯乙烯中间体进行，随后与电子缺乏的烯烃发生正式的[2+2]加成，高选择性源于稳定的苯基自由基中间体。铱催化剂对这些底物具有合适的三重态能量（60.1 kcal mol?1）和较长的三重态寿命（τ = 2,300 ns）。

在我们的研究中，我们制备了β-萘基等效物18，该化合物具有方便的桥头酯基团，可用于进一步的官能团转化。尽管粗反应混合物的1H NMR谱显示杂质较少（且未观察到区域异构的双环[3.2.0]庚烷副产物），但产率相对较低。我们通过1H NMR光谱监测反应进展，发现反应时间长达18小时后，产率仅为28%至40%。改变催化剂或溶剂也无法提高产率（补充表1）。长时间观察发现，反应物的消耗速率明显快于产物形成（补充图175），这表明发生了起始材料的寡聚化。在加入过量的吡啶条件下反应时，产率提高至56%（补充表2）。我们推测这可能是由于吡啶的三重态-三重态湮灭转化机制，导致二烯底物吸收吡啶的P型延迟荧光，从而直接形成单重态激发态并发生分子内环化。在没有吡啶的情况下，激发态底物需要通过系统间跃迁达到环闭合所需的单重态，从而导致寡聚化成为主要途径。

在适当的条件下，我们制备了具有不同取代模式的芳基耦合BCHep，以丰富系统的潜在构型（涵盖三种可能的2-萘基区域异构体），并引入了关键的官能团用于进一步衍生化（最高达到2 mmol规模）。环加成反应对苄位点的取代具有耐受性，例如醇19和酮20所示。双取代桥头位置的BCHep产率较低且混合物复杂，纯化困难。对于未取代的桥头底物24和25，产率较高，与Kwon的观察结果一致。我们推测这可能是由于吡啶氮的碱性所致。加入25%的二苯基磷酸有助于吡啶氮的质子化，从而生成相应的杂环衍生物。最后，我们使用醚衍生物29取得了与其他底物相似的产率，表明[2+2]方法具有广泛的应用性。通过添加吡啶，我们提高了酯类18、19和29的产率，而三重态湮灭剂对酮类底物20、24和25的产率没有影响。

掌握了合适的条件后，我们进一步探索了芳基耦合BCHep的衍生化，以提供更多构建块（图3a-c）。在酸性条件下，可以将芳基酮24和25高效转化为29a和29b，后者具有方便的卤基官能团用于交叉偶联。对于杂环衍生物26–28，需要先通过醇类将其还原为酮类，再通过脱氧反应获得饱和的偶联伙伴32和33。异喹啉等效物33通过Suzuki偶联反应与34反应，生成高度结晶的硝基芳烃35，并通过X射线晶体学表征。桥头处的角度为119°，与Anderson及其同事最初的报道一致，表明融合芳香环的添加并未影响桥头等效物的几何结构。

为了拓展功能，我们尝试将桥头官能团衍生化为β-萘基等效物库（图3b）。18的水解产生的中间体36可与苯胺偶联，用于制备ezutromid衍生物（补充方案13）。还可以将酸36转化为伯胺37，预计其安全性将优于常见的有毒芳胺基团34；37也可以转化为酰胺衍生物（见补充方案12）。BCHep衍生物也与桥头的自由基化学反应兼容，酸36可以通过铱催化的脱羧溴化反应生成溴化物38，而N-羟基酞亚胺39可以通过Minisci脱羧反应生成杂环衍生物40（参考文献36）。我们还成功地将18转化为Weinreb酰胺41，后者可以很容易地生成酮42。这种底物在温和条件下可以被溴化，从而得到溴酮43，这是合成杂环化合物的多功能构建块37。我们还探讨了通过从二硫烷45制备单氟和二氟衍生物44和46来阻断苯基CH2（图3c）位点的可能性，这突显了通过CYP介导的苯基氧化进一步抑制这些芳基融合BCHeps的潜力33。最后，我们生成了醚29的自由酸47，通过X射线衍射（XRD）来阐明氧对键角的影响。我们观察到β-萘基角度从120°降低到111°，而桥头距离增加到了127°。这突显了全碳骨架在促进几何异构性方面的重要性，同时也允许调整萘基异构骨架内的角度。

接下来，我们试图通过用BCHep基团替换ezutromid中的萘环来验证这些骨架确实是真正的萘基异构体（见图4）。Ezutromid是一种同类首创的utrophin调节剂，曾在二期临床研究中用于治疗DMD38。DMD是一种由编码结构肌蛋白dystrophin的基因多个功能丧失突变引起的疾病。已知Ezutromid通过上调肌肉中的utrophin蛋白来发挥作用，无论疾病突变类型如何，都可以补偿DMD患者的缺失dystrophin10。重复剂量的临床研究表明，在24周内，Ezutromid显示出了有希望的数据，肌肉纤维损伤显著减少，utrophin水平升高，首次证明了靶点的参与和作用机制。然而，在治疗48周后，Ezutromid未能达到其主要或次要终点，进一步的开发因此停止39。后续研究表明，Ezutromid疗效不足可能是由于萘单元容易受到肝脏CYP介导的氧化10（见图4a）。我们之前报告过，长期使用Ezutromid会导致CYP1A活性 paradoxically 增加，从而随着时间的推移减少药物暴露，并增加了无活性的二氢二醇代谢物48和49的产量，解释了其疗效随时间降低的原因10。因此，我们设想用异构的BCHep类似物50a–c替换萘环可以抑制CYP1A介导的萘环氧化（见图4b），可能绕过Ezutromid遇到的问题。50a是通过36的酰胺偶联然后缩合生成苯并噁唑得到的，而区域异构体50b和50c则是通过29a和29b的C-H活化/交叉偶联协议获得的（见补充方案13）。

图4：Ezutromid的代谢脆弱性及其与BCHep类似物的结构比较。

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a. Ezutromid的CYP1A介导的氧化。
b. BCHep-ezutromid衍生物列表。
c. 50a的X射线固态结构。
d. 50b的X射线固态结构。
e. ezutromid的X射线固态结构（晶胞包含两个“向下”朝向的萘构象，每个构象都呈现出独特的砜构象）。
f. 50a（绿色）的BCHep单元与ezutromid（灰色）的堆叠固态结构。
g. 50b（绿色）的BCHep单元与ezutromid（灰色）的堆叠固态结构。
RMSD值是使用Pymol中的“pair-fit”函数计算得出的，并映射了萘和BCHep碳原子。

为了比较BCHep基团与母体化合物的几何结构，我们制备了区域异构体50a和50b以及ezutromid的单晶，并通过X射线晶体学进行了分析（见图4c–e）。令我们高兴的是，β-萘基和桥头取代基保持了预期的约120°角度，而meta-取代模式之间的距离与萘基异构体的原始几何结构相差在5%以内。将50a和50b的BCHep部分与ezutromid的萘单元叠加后，显示了约0.1 ?的根均方偏差（RMSD）（见图4f,g），这突显了这些基团的高度几何异构性。即使将整个药物分子的固态结构叠加，仍然显示出良好的结构相似性（见补充图177）。此外，50a和ezutromid的计算电势图也显示出高度相似性（见补充图180和181）。

受到这些结果的鼓舞，我们评估了衍生物50a–c相对于ezutromid的生物活性。为此，我们决定测量ezutromid及其类似物对ezutromid主要靶标的活性，该靶标最近被鉴定为芳烃烃受体（AhR）40。这种核转录因子在通过靶向核DNA来上调多种CYP酶（如CYP1A异构体）的表达从而参与外源性小分子的代谢中起着关键作用（见图5a）。因此，可以通过测量这些基因的相对表达来监测AhR的抑制作用，CYP1A1 mRNA水平越低，表明AhR的拮抗作用越强。

图5：AhR拮抗作用及BCHep类似物的生物评估。

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a. Ezutromid如何拮抗AhR，阻止其进入细胞核并随后上调CYP1A1酶的示意图。因此，AhR的抑制作用可以通过CYP1A1表达的下降来评估。
b. 50a–c作为AhR拮抗剂的评估结果，与ezutromid进行比较。数据是通过定量RT-qPCR获得的，并使用2???Ct方法进行分析。所得值已标准化为对照（DMSO 1%），并以平均值±标准误差表示。IC50值是根据生物重复实验得到的，化合物50c和ezutromid则是根据两次实验重复测得的。

为了确定化合物50a–c作为AhR拮抗剂的活性，我们在与人肝细胞系HepG2共培养4小时后，通过定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）测量了CYP1A1 mRNA的水平。所有类似物在10 μM浓度下均保持生物活性，显示出CYP1A1表达的显著降低（见补充图178），尽管与ezutromid相比效力较低（见图5）。有趣的是，浓度-反应分析显示50a–c的每个区域异构体之间存在明显的活性差异，这表明可能存在构象偏好和/或在苯并噁唑2位保留2-芳基取代基的偏好，这与之前的SAR研究一致38。最有效的区域异构体是50b（半最大抑制浓度（IC50）为2.12 ± 0.3 μM，而ezutromid的IC50为0.27 ± 1.5 μM）。固态结构显示，最有效衍生物50b的BCHep单元是向下指向的（在噁唑的氧侧），而活性较低的50a的萘基异构体则朝向上方（在噁唑的氮侧）；这表明向下构象可能更适合实现更高的活性。这与高活性的ezutromid一致，其固态晶胞是一个含有两个“向下”朝向萘构象的无序结构（见补充图183）。同样，活性较低的50a和50c的计算结构显示出倾向于“向上”的BCHep构象，而最有效的50b则是向下的，这与固态结构一致（见补充图183）。对于ezutromid，两种萘构象在能量上没有区别。

最后，我们将最有前途的衍生物在鼠肝微粒体（MLMs）中进行了代谢稳定性研究，这是一个验证药物第一相代谢的模型（表1）。为了研究这些类似物是否容易受到CYPs的代谢影响，我们在存在3 μM α-萘黄酮（ANF）的条件下重复了这些测试。ANF是一种已知的CYP1A酶抑制剂，它负责ezutromid中萘环的CYP氧化代谢41。有趣的是，这些衍生物显示出与ezutromid相似或更高的代谢稳定性，半衰期也相当。特别是，化合物50a的代谢半衰期比ezutromid增加了约2倍（见表1）。最有前途的化合物50b的半衰期略有下降。重要的是，BCHep类似物在MLMs中的稳定性不受ANF的影响，表明这些生物异构体成功避免了阻碍ezutromid持续疗效的CYP1A介导的代谢（表1）。50b的代谢分析证实，其主要的生物转化涉及BCHep部分的单氧化（见补充图179和180），很可能是通过不受AhR控制的其他酶（例如CYP3A4）进行的。这些发现支持了BCHep替代可以减轻与ezutromid相关的代谢负担的策略，既保留了代谢稳定性，又避免了CYP1A介导的代谢。

表1：类似物50a–c的代谢稳定性

结论：
目前用于替代萘环的生物异构体缺乏通用性，并且物理化学性质较差。我们描述了一系列易于衍生的sp3丰富的芳基融合BCHeps的制备方法，这些BCHeps可以作为多种双环（杂）芳香族化合物（包括萘、（异）喹啉和喹唑啉）以及较少见的β-萘基单元的生物异构体。通过可见光诱导的能量转移进行分子内交叉[2+2]光环加成，可以高效地获得这些环骨架，并且可以轻松地转化为具有各种取代模式的双环异构体构建块。将BCHep异构体引入到受CYP1A介导的代谢影响较大的AhR拮抗剂ezutromid中，得到了代谢稳定性改善的类似物，特别是限制了CYP1A的代谢。借助固态结构、细胞测定和MLMs中的代谢稳定性研究，我们证明芳基融合的BCHep衍生物在几何结构上与母体化合物相似，保持了有趣的生物活性，并且相对于它们的萘基对应物显示出更高的代谢稳定性。代谢分析确认，BCHep替代减轻了母体化合物特有的反应性代谢产物的形成。在这些化合物中，化合物50b保留了有意义的AhR拮抗活性，同时成功解决了关键的代谢问题，使其成为进一步优化的有希望的候选物。

这项研究代表了将BCHep异构体成功整合到潜在药物候选物中的过程，同时改善了药代动力学性质并保持了与细胞靶标的结合。这些发现验证了BCHep作为meta-取代芳烃和萘的潜在生物异构体基团的可行性，提供了代谢稳定性和生物活性的平衡优化，为未来药物化学研究开辟了广泛的应用途径。

方法：
所有试剂和溶剂均从商业来源购买，无需进一步纯化。必要时，溶剂通过MBraun MPSP-800柱子干燥并用氮气脱气。三乙胺从氢氧化钾中蒸馏并储存。柱层析在Merck硅胶60上进行，使用氮气正压。当使用溶剂混合物时，比率以体积报告。NMR光谱是在Bruker AVIII 400、Bruker AVII 500（带冷冻探头）、Bruker NEO 600（带宽带氦冷冻探头）和Bruker AVIII 500光谱仪上记录的。化学位移以百万分之一的δ值报告。质谱是在Waters Micromass LCT和Bruker microTOF光谱仪上进行的。

NMR时间过程实验：
环化底物Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbbpy)PF6（1 mol%）和内标（二甲基砜，1当量）溶解在脱气的CD2Cl2（0.70 ml）中，并转移到NMR管中。容器在发射光二极管（LED）灯（Kessil PR160L-440nm—最高设置）的照射下（距离约2 cm）进行冷却，同时暴露在恒定流量的N2中。1H NMR光谱定期获取，产率通过相对于内标的积分确定。

光化学反应装置：
反应烧瓶或小瓶固定在搅拌板上。LED灯（Kessil PR160L-440nm—最高设置）垂直放置在反应烧瓶的侧壁（距离约2 cm）。搅拌板和LED被光保护罩和铝箔包围。反应烧瓶通过直接暴露在恒定流量的N2中冷却。有关装置的图片，请参见补充信息。

晶体学数据：
晶体通过蒸汽扩散法生长。化合物（2-5毫克）溶解在极少量的CDCl3中，然后通过棉花过滤器转移到一个小试管中。试管盖上盖子，并用小针刺一个小孔，随后将其放入含有戊烷或己烷的较大试管中。所有结构的单晶XRD数据均在100 K下使用Rigaku Synergy-DW diffractometer进行收集。CrysAlisPro软件用于数据整合和吸光度校正。结构通过Superflip15软件进行初步解析，随后使用CRYSTALS16、17软件进行精细化处理，具体方法详见补充信息（CIF）。

**细胞培养及处理**
人肝细胞癌（HepG2）细胞系购自Abcam。细胞在添加了10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基或Minimum Essential Medium Eagle中培养，培养环境为5%二氧化碳、37°C。处理时，将细胞以每孔50,000个细胞的数量接种到96孔透明培养板中，待细胞生长至80%汇合度。48小时后，用磷酸盐缓冲 saline清洗细胞，然后分别加入待测化合物（50a-c，浓度为0.1、1或10 μM，含1% DMSO；技术重复样本）、阳性对照剂（ezutromid，浓度为0.1、1或10 μM，含1% DMSO；技术重复样本）或载体溶液（1% DMSO，技术重复样本）。对于剂量效应分析，将细胞以每孔250,000个细胞的数量接种到六孔板中。24小时后，移除培养基，并加入待测化合物（50a-c，浓度为1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1 μM、3 μM、10 μM或30 μM，含0.3% DMSO；技术重复样本）、阳性对照剂（ezutromid，浓度为10 μM，含0.3% DMSO；技术重复样本）或载体溶液（0.3% DMSO，技术重复样本）。细胞孵育4小时后进行裂解和RNA提取。

**RNA提取及cDNA合成**
总RNA的提取使用MagMAX?-96 Total RNA Isolation Kit（Thermo Fisher Scientific）或RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN，74136）按照制造商说明书进行。具体步骤包括：使用提供的裂解液裂解细胞，然后利用核酸捕获磁珠提取RNA；使用TurboDNAse kit（Thermo Fisher Scientific）去除磁珠上的基因组DNA；通过多次洗涤步骤纯化RNA，最后将其洗脱到八管PCR试剂管中并置于-20°C过夜保存。提取RNA的质量和数量通过NanoDrop One Microvolume或Lite Plus UV–Visible Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）进行检测。互补DNA（cDNA）的合成方法如下：使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher）从200 ng总RNA中合成，或使用QuantiTect Reverse Transcription Kit (200)（QIAGEN，205313）从250 ng总RNA中合成，具体操作参照制造商的协议。

**定量逆转录PCR分析**
RT-qPCR分析使用Fast SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在384孔板中进行，实验设备为LightCycler 480 II（Roche）；或在96孔板中进行，实验设备为Applied BiosystemsTM 7500 Fast RT-qPCR System（Thermo Fisher Scientific）。每个反应重复两次，所用cDNA来自两个独立孔。扩增所用引物对由Merck公司提供：hS13（内参基因）：正向引物—CTGATCTTCCTGAAGATCTCTAC，反向引物—GGCAGAGGCTGTAGATGATTCA；hCYP1A1（目标基因）：正向引物—GCTCCAAGAGTCCACCCTTCCC，反向引物—CTGAGGTCTTGAGGCCCTGATTACC。

**数据分析**
定量PCR扩增得到的数据通过2^-??CT方法进行分析，以计算相对于载体组的倍数差异。为便于数据可视化，将结果归一化到载体对照组，并转换为百分比，从而准确评估AhR抑制作用与CYP1A1下调程度之间的正比关系。共计进行了四次独立实验（n=4）。数据分析采用GraphPad Prism v.8.0.2（GraphPad Software）进行单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较测试。

**报告摘要**
有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关联的Nature Portfolio Reporting Summary。