利用低渗细胞膨胀 technique，通过倾斜角度的声流控方法分离活体和死体的新生大鼠心室肌细胞

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Tilted-angle acoustofluidic separation of live and dead neonatal rat ventricular myocytes using hypotonic cell swelling

　　

穆斯塔克·阿里（Mushtaq Ali）|曲竹姬（Qu Zhuji）|诺敏-埃尔登·奥云巴塔尔（Nomin-Erdene Oyunbaatar）|李龙龙（Li Longlong）|李东元（Dong-Weon Lee）|朴金秀（Jinsoo Park）

韩国光州全南国立大学机械工程系，邮编61186

摘要

细胞群体中存在死亡细胞会损害后续的生物分析结果和治疗效果，因此需要可靠且温和的分离策略。这一挑战对于原代细胞（如新生鼠心室肌细胞NRVMs）尤为重要，因为这些细胞在从心脏组织中分离过程中不可避免地会混入死亡细胞。本文介绍了一种声流体平台，该平台结合了可控的化学渗透调节和倾斜角度行波表面声波（taTSAWs），实现了无需标记且生物相容性的活细胞与死亡细胞分离。我们研究了NRVMs对氯化钠溶液的化学刺激反应，在低渗、等渗和高渗条件下的表现，发现轻微的低渗条件可以显著改变细胞大小，同时保持细胞存活能力。基于这些发现，使用50 mOsm/kg的轻度低渗浓度选择性地触发活细胞的体积膨胀，使其平均直径从约15.2 μm增加到约19.2 μm，而死亡细胞由于膜完整性受损，直径基本保持不变（约16.2 μm）。随后，将这种经过大小调节的细胞群体置于taTSAW产生的声辐射场中，使其在微流控通道内发生持续横向偏移，从而实现高效分离。该平台达到了高纯度分离效果，并通过孵育和生长检测确认了分离后细胞的存活能力。通过结合温和的化学刺激和无标记的声波驱动技术，本研究建立了一种可扩展且生物相容的原代细胞纯化方法。

引言

在众多生物医学和生物技术应用中，活细胞与死亡细胞的分离是一个关键步骤，因为死亡细胞的存在会显著影响实验结果和治疗效果[1]。对于原代细胞而言，这一挑战尤为重要，因为它们能密切反映天然组织的生理特性，但在组织分离和处理后往往会形成异质性细胞群[2]。在原代细胞类型中，新生鼠心室肌细胞（NRVMs）被广泛用作体外心肌细胞模型，用于研究电生理学、收缩性、药物引起的心脏毒性及疾病机制[3][4]。传统的酶法分离技术是分离NRVMs的最常用方法，但不可避免地会产生包含活细胞和死亡细胞的异质性细胞悬浮液[2][5]。死亡NRVMs的存在会严重影响后续分析，包括基因表达分析、蛋白质组学研究和功能检测，因为污染会导致结果失真[6][7]。

目前已有多种分离活细胞和死亡细胞的技术。一种常用的实验室方法是将在培养皿中培养细胞样本，活细胞附着在培养皿表面，而死亡细胞悬浮在培养基中，随后通过磷酸盐缓冲盐水冲洗去除[8]。流式细胞术和荧光激活细胞分离技术通常依赖荧光染料来根据细胞膜完整性区分和分离细胞[9][10]。其他分离策略则通过对心肌细胞进行化学标记来实现分离，例如使用亚硝酸钠处理使其具有顺磁性，从而便于磁分离[11]，或暴露于超顺磁氧化铁颗粒以实现磁富集[2]。然而，许多已报道的标记方法主要是基于诱导多能干细胞而非原代细胞进行的[12][13][14]。这些方法通常需要昂贵的仪器和技术支持，并且使用的荧光或磁性物质可能会影响细胞存活或干扰后续分析[15][16]。

目前已提出多种用于活细胞和死亡细胞分离的微流控方法，包括惯性微流控、介电泳和声流体技术（详见表S1）。螺旋微通道利用基于大小的惯性聚焦原理去除死亡细胞[17]，而基于刚度的微结构则利用活细胞与死亡细胞之间的机械性质差异[18]。然而，这些惯性方法通常缺乏按需调节能力，并且对流动条件、流体性质和通道几何形状非常敏感[19]。一些电泳方法通过利用活细胞与死亡细胞之间的电学性质差异实现细胞存活性区分[20][21][22]，但仍存在焦耳加热、场优化和生物相容性等方面的挑战[23]。

基于声波的方法因其无需标记、操作温和且具有固有的生物相容性而受到关注。静止表面声波平台通过化学诱导的尺寸改变实现活细胞与死亡细胞的分离[24]，但此类刺激方法通常需要较高的溶质浓度，可能对细胞健康造成影响[25]。静止声波系统通过改变声学对比系数来利用声学机械性质的差异[26][27]。在静止声波配置中，波长依赖的力场限制了分离距离和效率。此外，生成静止声场装置通常需要反射器或成对的换能器，以及精确对准压力节点与微通道的几何结构，这增加了系统的复杂性[28]。此外，大多数关于活细胞和死亡细胞分离的微流控技术主要是基于永生化细胞系进行的。而且，活细胞与死亡细胞在大小和物理性质上仅有微小差异[26]，这使得直接的单阶段声波操作具有挑战性，通常需要多阶段或混合平台才能达到足够的纯度。

我们提出了一种混合声流体平台，该平台将可控的化学渗透调节与倾斜角度行波表面声波（taTSAWs）结合，在蛇形微通道中实现活细胞与死亡NRVMs的无标记高效分离。首先研究了NRVMs对渗透刺激的生物物理响应，发现低渗、等渗和高渗三种条件可显著改变细胞大小，同时保持细胞存活能力。因此，该方法在低渗条件下使用生物相容的渗透调节来维持细胞分离过程中的完整性。在低渗条件下，活细胞会发生体积膨胀，而死亡细胞由于渗透调节受损而保持不变，从而产生可控制的尺寸对比。随后，利用taTSAW产生的声辐射力实现连续高效的分离。与传统交叉型或并行声流体配置相比，倾斜角度设计引入了不对称的力分量，实现了长距离的横向偏移和更高的分离效率[29][30][31]。分离后的孵育和生长测试证实了恢复的原代细胞的存活能力和功能完整性。这项工作为生物相容性原代细胞纯化提供了一种温和且无标记的声流体方法，对生物医学研究和细胞疗法具有重要意义。

部分摘录

设备配置与操作

图1展示了用于通过低渗膨胀分离活细胞和死亡NRVMs的声流体平台。该平台由聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道和锂铌酸盐（LiNbO?）压电衬底组成。微通道具有两个用于输入细胞悬浮液和低渗溶液的入口，以及两个用于收集分离后的细胞和排除废液的出口。PDMS微通道通过……与PDMS膜不可逆地粘合

渗透刺激对NRVM细胞的影响

我们首次系统地研究了可控渗透刺激对新生鼠心室肌细胞（NRVMs）的影响，以诱导活细胞和死亡细胞之间的体积差异。这种方法引入了一种非侵入性的物理机制，用于选择性地调节细胞体积，扩展了传统的生化方法用于评估细胞存活能力[49][52]。通过改变氯化钠（NaCl）的浓度来调节溶液的渗透压

结论

在本研究中，我们开发了一种混合倾斜角度声流体平台，通过结合温和的低渗调节和行波表面声波，在一次性微通道中实现活细胞和死亡细胞的无标记分离。低渗刺激选择性地诱导活细胞体积膨胀，同时保持细胞完整性，从而产生有效的尺寸对比，便于声层析分离。倾斜角度配置使得细胞能够持续进行横向迁移

数据获取

本研究的数据可在合理请求下向通讯作者获取。

CRediT作者贡献声明

朴金秀（Jinsoo Park）：撰写——审核与编辑、监督、资金申请、概念构思。曲竹姬（Qu Zhuji）：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析。穆斯塔克·阿里（Mushtaq Ali）：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析。李龙龙（Li Longlong）：撰写——初稿、实验设计。诺敏-埃尔登·奥云巴塔尔（Nomin-Erdene Oyunbaatar）：实验设计、数据分析。李东元（Dong-Weon Lee）：撰写——审核与编辑、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

致谢

本工作得到了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）项目（RS-2020-NR049568、RS-2023-00210891和RS-2025-02316565）的支持。微流控装置由全南国立大学能源聚合核心设施的掩膜对准器（MDA-400S, MIDAS）制作。

第一作者穆斯塔克·阿里（Mushtaq Ali）是韩国全南国立大学机械工程系的博士后研究员。他的研究重点是开发适用于生物医学应用中的生物相容、高效和高通量的细胞和液滴分离方法。他的主要研究方向包括声流体技术、粒子与细胞操控以及利用表面声波进行无标记细胞分离。