《Sensors and Actuators B: Chemical》：A Collective Sensing Strategy for Total Pesticide Residues Detection Based on ALP Controlled MNAzyme Assembly
编辑推荐：
吴旭新|丁月|李吉|薄晓雅|李群贤|蒋大峰|齐光兆|张景敏|王文瀚|王新峰|马传江|高希宝|丁胜勇|黄超中国山东大学齐鲁医学院公共卫生学院物理与化学检验系，济南250000摘要传统的核酸生物传感器主要用于检测农药，其识别机制依赖于适配体对单个目标的特异性识别，这限制了它们在同时检
吴旭新|丁月|李吉|薄晓雅|李群贤|蒋大峰|齐光兆|张景敏|王文瀚|王新峰|马传江|高希宝|丁胜勇|黄超
中国山东大学齐鲁医学院公共卫生学院物理与化学检验系，济南250000
摘要
传统的核酸生物传感器主要用于检测农药，其识别机制依赖于适配体对单个目标的特异性识别，这限制了它们在同时检测多种农药残留物毒性方面的应用。本文利用碱性磷酸酶（ALP）作为广谱指示剂，提出了一种用于检测总农药残留物的集体生物传感策略。该策略创新地将多种农药的毒性转化为ALP活性的抑制，进而通过多组分DNA酶（MNAzyme）介导的荧光信号放大来实现农药残留物的检测。具体而言，ALP可以生成抗坏血酸，将Cu(II)还原为Cu(I)，并催化两个DNA片段的点击化学共价连接。连接产物促使MNAzyme组装，高效切割荧光团-淬灭剂标记的发夹底物，从而引发明显的荧光增强。具有ALP抑制活性的农药会抑制这一级联反应，导致荧光信号随剂量增加而减弱，从而实现多种农药的同时检测。该策略对氯吡硫磷、溴氰菊酯和2,4-D的检测性能良好，其检测限分别为34.8 nM、55.0 nM和26.0 nM。由于采用了集体设计模式，该策略在真实样品分析中表现出优异的多农药残留物检测能力。此外，选择性实验证实其对有机磷农药、合成拟除虫菊酯和苯氧羧酸类除草剂具有特异性响应。这项工作系统地提出了一种新的总毒性检测生物传感策略，展现了其在食品安全监测和环境保护中的巨大潜力。
引言
现代农业中广泛使用各种农药以提高全球作物产量[1]。然而，农产品中农药残留物的持续存在对食品安全、生态平衡和公共卫生构成了重大风险[2][3]。值得注意的是，多种农药残留物的共存及其潜在的协同毒性可能会产生比单一化合物更严重的健康影响。研究表明，三种常用农药在HepG2细胞中表现出协同性细胞毒性和凋亡，这为多种农药的增强毒性效应提供了直接实验证据[4]。因此，开发新型的多农药残留物同时检测分析方法对于有效的食品安全监测和准确的风险评估至关重要。传统的农药残留物分析技术，如高效液相色谱-质谱和气相色谱-质谱，因其高准确性和灵敏度而被视为参考方法[5][6][7]。尽管这些方法可靠性较高，但它们通常需要复杂的仪器设备、耗时的样品制备以及高度专业的人员，因此不适用于现场筛查和快速高通量分析[8][9][10]。
相比之下，基于功能性核酸（FNAs）的生物传感器作为有吸引力的替代方案，展现出敏感、准确和简便的分析潜力[11][12][13][14]。FNAs的高度可编程性、可预测的沃森-克里克碱基配对性能以及出色的化学稳定性，使得能够合理设计高度特异性的识别探针和构建稳健的传感平台。特别是引入等温核酸扩增技术，如DNAzyme、催化发夹组装（CHA）、杂交链反应（HCR）、DNA步行器以及CRISPR/Cas系统，使得无需复杂的热循环仪器即可实现极高的灵敏度[15][16][17][18]。例如，钟的研究团队开发了一种基于CRISPR/Cas12a的电化学发光生物传感器，用于高灵敏度检测乙酰吡虫啉[19]；朱和宋利用功能性核酸介导的DNA步行器实现了马拉硫磷的超灵敏检测[20]；王等人则创建了一种基于DNA水凝胶的适配体传感器，通过切割酶介导的扩增来检测氯吡硫磷[21]。尽管这些先进方法对特定目标表现出优异的性能，但它们主要依赖于“一种适配体对应一个目标”的识别模式。虽然这种特异性确保了对单个分析物的高准确性[22][23][24]，但在尝试同时检测多种潜在农药残留物时却成为根本限制，而这正是有效预警所必需的。因此，迫切需要开发敏感、用户友好且最重要的是多组分响应的生物传感策略，以满足对农药污染早期预警的迫切需求。
本文利用碱性磷酸酶（ALP）作为广谱指示剂，基于ALP活性的总体抑制来开发一种集成的、标准化的多农药残留物毒性检测生物传感策略。研究表明，农药可以通过与ALP活性位点上的关键残基（包括Gln375、Thr413、Asp55和Ser56）形成氢键来抑制ALP活性，从而阻断底物结合并干扰催化过程[25][26][27]。该方法通过多组分DNA酶（MNAzyme）的组装将ALP活性的抑制转化为放大的荧光信号。传感机制始于ALP催化的抗坏血酸生成，随后将Cu(II)还原为Cu(I)，生成的Cu(I)离子驱动两个指定DNA片段的点击化学共价连接。这种连接产物是后续模板导向的活性MNAzyme自我组装的关键。组装好的MNAzyme作为高效催化剂，能够持续切割荧光团-淬灭剂标记的发夹底物，引发显著的荧光增强。这种级联设计确保了具有ALP抑制活性的农药的有效抑制，导致信号随剂量增加而减弱。因此，这项工作建立了一个多用途且灵敏的平台，用于集体评估农药残留物，为监测应用中的早期预警和风险评估提供了有力工具。
节片段
概述
寡核苷酸、试剂、仪器和详细的实验方案见支持信息。
首先，在PBS缓冲液（0.02 M，pH 7.4）中将两种单链序列（DNA1和DNA2）等量退火，形成DNA1-DNA2探针。混合物加热至95°C保持5分钟，然后缓慢冷却至室温。使用前的其他DNA也采用相同的退火程序，不立即使用的DNA则存储在4°C。
集体传感策略的原理
总之，我们提出了一种基于测量ALP活性抑制的集体和标准化生物传感策略，用于同时检测多种残留物的毒性。该方法通过多组分DNA酶（MNAzyme）的组装，将ALP活性的抑制转化为放大的荧光信号。具体而言，设计了四种核酸探针：DNA1、DNA2、DNA3和DNA4。DNA1和DNA2杂交形成双链探针，其钝端的其中一端经过修饰
结论
总之，我们提出了一种基于ALP控制的MNAzyme组装的集体传感策略，用于检测总农药残留物。该方法通过MNAzyme组装将ALP活性的抑制转化为放大的荧光信号。通过将多种农药残留物与ALP活性相关联，提出了一种新的集体生物传感策略，展现了其在食品安全监测和环境方面的巨大潜力
CRediT作者贡献声明
蒋大峰：项目管理、概念构思。李群贤：验证、数据管理。薄晓雅：可视化、数据管理。黄超：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、可视化、监督、项目管理、资金筹集、概念构思。李吉：可视化、方法学、研究、数据分析。丁胜勇：撰写-审稿与编辑、监督、资源协调、资金筹集、数据分析、概念构思。丁月：
我们声明与提交的工作无关任何可能构成利益冲突的商业或关联利益。
所有作者均未披露任何相关关系。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划[项目编号2024YFC3505800]、山东省自然科学基金[项目编号ZR2023MH249和ZR2023QE331]、中国博士后科学基金[项目编号2025M773938]、山东省中医药科技计划[项目编号M20241840]以及山东省中医药临床药学研究专项基金[项目编号]
吴旭新是山东大学公共卫生学院物理与化学检验系的研究员，她的研究方向为分析化学和新型食品安全监测生物传感器的开发。
