针对死亡受体3（DR3）调节剂的高通量筛选检测方法的建立

《SLAS Discovery》：A High Throughput Assay to Identify Modulators of Death Receptor 3 (DR3)

　　

TNF样细胞因子1A（TL1A）与死亡受体3（DR3）的结合触发了T细胞内的信号级联反应，导致促炎基因产物的表达因激活蛋白-1（AP-1）和核因子-κB（NF-κB）介导而增加。TL1A/DR3信号的失调是许多自身免疫性疾病、癌症和其他病症的主要诱因，然而目前缺乏该通路的小分子调节剂。在此，研究人员报道了一种基于细胞的针对8000种化合物的高通量筛选，结果从中鉴定出12种该通路的拮抗剂，但未发现激动剂。

该研究聚焦于死亡受体3（DR3）信号通路在炎症与肿瘤微环境调控中的关键作用，旨在建立一套能够同时筛选激动剂和拮抗剂的细胞表型检测方法。研究人员通过构建稳定表达DR3及NF-κB响应元件调控分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）报告基因的HEK-Blue细胞系，成功开发并优化了适用于1536孔板的高通量筛选（HTS）平台。通过对7689个化合物（包括Sigma LOPAC库及大环化合物库）的初筛及随后的剂量反应验证，研究人员发现该检测方法具有极高的稳健性（激动剂模式Z'值为0.91±0.02）。尽管在初筛中未发现具有纳摩尔级活性的激动剂，但研究人员成功鉴定出12种对TL1A/DR3通路具有亚型选择性的小分子拮抗剂。其中，天然产物南昌霉素（Nanchangmycin）表现出显著的抑制活性（半数抑制浓度IC₅₀= 14.8 nM），且在细胞毒性实验中证实其抑制作用并非源于细胞毒性。该研究证实了利用该细胞表型检测方法进行大规模药物筛选的可行性，为开发治疗慢性炎症性疾病及炎症驱动型癌症的新型药物提供了重要的先导化合物及工具平台。该研究成果发表于《SLAS Discovery》。

为实现上述目标，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，利用InvivoGen公司的HEK-Blue细胞系，通过转染DR3表达载体构建了TL1A响应细胞模型，并以未转染DR3的亲本细胞（HEK-BLUE-Null）作为反筛对照以消除非特异性信号；其次，建立了基于SEAP报告基因活性的吸光度检测体系（OD_640nm），并利用Quantiblue试剂进行显色；随后，将检测方法从96孔板微型化优化至1536孔板格式，通过细胞滴度及激动剂EC₉₀滴定确定最佳反应条件；最后，结合单次点高通量筛选与10点剂量反应曲线（CRC）重测，配合四参数逻辑方程拟合计算半数有效浓度（EC₅₀）及IC₅₀，并利用MTT法评估化合物对细胞的代谢毒性。

在材料与方法部分，研究人员详细阐述了细胞模型的构建与验证。通过利用BioRaptr2分液仪及Kalypsis pin-tool点样系统，研究人员确立了840个细胞/孔及50 nL化合物点样的1536孔板检测方案。通过对重组TL1A及抗TL1A抗体进行剂量反应测试，确定了激动剂模式下的EC₅₀约为42 pM，拮抗剂模式下抗TL1A的IC₅₀约为2.3 nM。同时，利用HEK-BLUE-Null细胞系及鞭毛蛋白（Flagellin）/抗TLR5A抗体组合验证了反筛系统的有效性，确保了筛选结果的特异性。

在初步筛选（Pilot Screen）阶段，研究人员对7689个化合物进行了单次点（9.1 μM）三复孔测试。结果显示，激动剂模式的信噪比（S:B）高达29.7±2.0，筛选出21个活性化合物，但在随后的滴定实验中无一达到EC₅₀小于1 μM的标准。相比之下，拮抗剂模式表现更为出色，筛选出82个初筛命中物，经滴定验证后有23个化合物IC₅₀小于1 μM，其中12个在HEK-BLUE-Null反筛中无活性，显示出对TL1A/DR3通路的高度选择性。

在针对活性化合物的深入分析部分，研究人员重点研究了天然产物南昌霉素。数据显示，南昌霉素在TL1A刺激的细胞模型中表现出14.8 nM的高效价抑制活性，而在Null细胞对照中的IC₅₀高达5.8 μM，显示出超过350倍的选择性指数。为了排除抗菌特性导致的假阳性，研究人员进行了MTT细胞活力实验。结果表明，在高达2.5 μM的浓度下，TL1A细胞仍保持100%的代谢活力，且在TL1A或鞭毛蛋白存在下细胞存活率未发生显著改变。这证实了南昌霉素对TL1A/DR3信号通路的抑制是一种真实的药理效应，而非由于细胞毒性所致。

在讨论环节，研究人员指出DR3在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等急性损伤中具有保护上皮屏障的功能，而在哮喘等慢性炎症状态下则促进上皮间质转化（EMT）及纤维化，因此抑制该通路具有重要的治疗潜力。虽然本次小规模筛选未发现激动剂，但这归因于激动剂需要诱导受体发生精确的构象变化以激活下游信号。该检测方法的Z'值高达0.9，证明了其完全具备推进至全库筛选的能力。最终鉴定出的12个选择性拮抗剂，特别是具有低纳摩尔活性的南昌霉素，为抗炎药物研发计划提供了极具价值的先导分子。尽管HEK细胞模型可能无法完全重现原代免疫细胞的复杂生理环境，但该平台已被证明是研究免疫刺激的可靠工具。总而言之，该研究建立了一套稳健的高通量筛选方法，填补了TL1A/DR3通路小分子调节剂发现的空白，为开发新型口服生物可利用药物奠定了基础。