《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Cooperative protein–ligand antioxidant activation: Sulforaphane binding to HIgG enhances neuroprotection in spinal cord neurons via structural and functional modifications
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余珊珊|周旭曦|李硕|谭大|王丹华|王伟|张金晶|吴芬赞|林天津|黄立春中国浙江省宁波市温州医科大学慈溪人民医院慈溪生物医学研究所，315300摘要氧化应激在神经退行性损伤的进展中起着核心作用，包括脊髓损伤（SCI），其中过量的活性氧（ROS）产生导致神经元功能障碍和细胞死亡。尽
余珊珊|周旭曦|李硕|谭大|王丹华|王伟|张金晶|吴芬赞|林天津|黄立春
中国浙江省宁波市温州医科大学慈溪人民医院慈溪生物医学研究所，315300
摘要
氧化应激在神经退行性损伤的进展中起着核心作用，包括脊髓损伤（SCI），其中过量的活性氧（ROS）产生导致神经元功能障碍和细胞死亡。尽管小分子抗氧化剂如萝卜硫素具有神经保护潜力，但其临床效果往往受到不稳定性和生物利用度低的限制。在这项研究中，我们探索了一种蛋白质-配体协同策略，使用人血清免疫球蛋白G（HIgG）作为萝卜硫素结合和抗氧化调节的动态支架。通过结合多光谱、分子对接、分子动力学（MD）模拟和体外神经元实验的综合性方法，研究了结合机制和抗氧化活性。光谱分析证实，萝卜硫素与HIgG之间存在自发和中等程度的结合，主要通过Fab区域的氢键和范德华相互作用驱动。MD模拟和CD数据表明，配体结合会引起微妙的但显著的局部构象重组，提高了芳香族和氧化还原活性残基的溶剂可及性和灵活性。功能上，在H?O?诱导的氧化应激下使用脊髓神经元的体外实验表明，HIgG-萝卜硫素复合物提供的细胞保护和ROS抑制作用明显优于单一成分。总之，这些发现揭示了一种协同抗氧化机制，其中HIgG-萝卜硫素复合物有助于增强神经保护活性。这项工作强调了蛋白质-配体协同性作为设计下一代抗氧化系统的一种有前景的策略。
引言
氧化应激是多种神经退行性和创伤性疾病的中心病理驱动因素，包括脊髓损伤（SCI），其中过量的活性氧（ROS）产生会导致不可逆的神经元损伤、炎症和功能障碍[1]。尽管已做出了大量努力来减轻氧化损伤，但由于小分子抗氧化剂的稳定性差、代谢快和生物利用度不足，其临床应用仍受到限制。这些挑战促使人们越来越关注能够在生理条件下稳定生物活性化合物并增强其功能效果的替代策略[2]。
一种有前景的方法是使用蛋白质作为动态分子支架，能够结合、保护和调节小分子生物活性配体。特别是血清蛋白，在调节内源性和外源性化合物的分布、稳定性和活性方面起着关键作用[3]。其中，人血清免疫球蛋白G（HIgG）是一种结构复杂且高度可适应的生物分子，具有独特的Fab和Fc结构域、内部空腔以及多种功能性残基[4]。虽然HIgG传统上不被认为是药物递送载体，并且不易穿过血脑屏障，但其构象灵活性和配体结合能力可能使其在结合小分子后能够实现结构和抗氧化功能的协同调节，使其成为研究蛋白质-配体相互作用的理想模型。
基于异硫氰酸酯的生物活性物质已被用于调节神经元的氧化应激[5]。例如，研究表明，烯丙基异硫氰酸酯能够減轻体内创伤性脑损伤的氧化应激和炎症[6]，或者4-(α-鼠李糖氧基)-苄基异硫氰酸酯可用于预防体内SCI的继发性损伤[7]。萝卜硫素（C6H11NOS2），1-异硫氰酰-4-(甲基磺酰)丁烷，是一种来自十字花科蔬菜的异硫氰酸酯，其前体葡萄糖苷配体葡萄糖萝卜硫素广泛存在于西兰花、西兰花芽、卷心菜和羽衣甘蓝中[8]。研究表明，萝卜硫素可以作为有前途的抗氧化剂，对抗神经退行性信号通路的激活[9]。然而，小分子抗氧化剂的效力往往受到不稳定性的限制，在高浓度时还存在潜在的细胞毒性[10]。
最近的研究探讨了萝卜硫素与模型蛋白质（如牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，表现出相对较弱的结合亲和力，并表明在这种系统中的稳定性有限[11]。然而，结构不同的蛋白质（如HIgG）能够提供有利的协同结合环境，以及这种相互作用是否能够调节蛋白质和配体的功能特性，目前仍很大程度上尚未探索。
因此，我们假设萝卜硫素与HIgG的结合可能是一个协同事件，其中蛋白质和配体都经历了耦合的结构和/或功能适应，从而产生超出单一成分的抗氧化活性和增强的神经保护作用。
为了验证这一假设，我们采用结合光谱、分子对接和分子动力学（MD）模拟的综合性方法研究了HIgG与萝卜硫素之间的相互作用。这些技术被用来表征结合行为、热力学参数和配体诱导的结构重排，特别关注蛋白质-配体相互作用如何调节抗氧化活性。此外，还在氧化应激下使用脊髓神经元模型进行了体外实验，以确定这种相互作用是否在细胞水平上转化为协同抗氧化活性，表现为神经保护和细胞内ROS的抑制。
章节摘要
材料
人血清免疫球蛋白G（HIgG）（目录编号I4506，SDS-PAGE纯度≥95%）和萝卜硫素（目录编号S4441，HPLC纯度≥90%）购自Sigma-Aldrich（美国）。HIgG溶解在Tris-HCl缓冲液中（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4），这种缓冲液提供了生理相关的离子强度，并在接近中性的条件下保持蛋白质稳定性。萝卜硫素储备液制备在无水甲醇中，以确保完全溶解并防止水解
荧光研究
荧光光谱是一种广泛用于研究受体-配体相互作用相关参数的技术。使用Stern-Volmer方程[21]分析受体荧光的淬灭机制，可以揭示配体结合机制。结合常数和热力学参数可以从修改后的双对数Stern-Volmer图和van't Hoff图中得出[22]。此外，荧光分析还可以揭示微环境
结论
本研究表明，HIgG与萝卜硫素之间的相互作用不仅仅是一个被动结合事件，而是一个增强抗氧化性能的协同功能过程。光谱和热力学分析证实，萝卜硫素在HIgG的明确腔室内稳定结合，主要通过亲水相互作用驱动。重要的是，分子对接和MD模拟显示，配体结合诱导了局部结构灵活性
CRediT作者贡献
余珊珊：概念构思、方法学、研究、数据管理、初稿撰写、审阅与编辑
周旭曦：概念构思、方法学、研究、数据管理、初稿撰写、审阅与编辑
李硕：软件、方法学、可视化、初稿撰写
谭大：数据管理、研究、可视化、初稿撰写
王丹华：软件、方法学、可视化、初稿撰写
王伟：软件
伦理批准
所有动物实验均经过浙江省平阳县第二人民医院（温州）的机构伦理委员会审查和批准。所有程序均按照美国国立卫生研究院（NIH）的《实验室动物护理和使用指南》以及AVMA的《动物安乐死指南》进行。该研究还遵循了ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南。
资助
宁波市自然科学基金（2024 J470）和慈溪市公共福利科学技术计划项目（CN2023012）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能会影响本文所报告的工作。
