高通量一步法微量化学衍生化结合靶向脂质组学技术，用于分析细胞中的氧脂素

《Talanta Open》：High-throughput one-pot micro-volume chemical derivatization combined with targeted lipidomics for the analysis of oxylipins in cells

　　戴饶 | 吴宗源 | 秦作建 | 夏翔 | 陈宇 | 王丹 | Lv欣 | 唐唐 | 陈红 | 方伟
中国农业科学院油料作物研究所 lipid 化学与营养重点实验室、农业部油籽加工重点实验室，中国湖北省武汉市，430062

**摘要**
氧脂质由多不饱和脂肪酸（PUFAs）生成，对调节基本生理过程（如组织修复、免疫和炎症）至关重要。然而，它们在细胞内的浓度本身就很低，而且许多氧脂质会通过酶促或非酶促反应迅速转化或降解，导致半衰期极短。复杂的预处理过程（通常包括依次进行细胞裂解、溶剂萃取、固相纯化、蒸发和离线化学衍生化）降低了细胞中氧脂质分析的准确性。我们开发了一种高通量的一锅法微体积化学衍生化方法结合靶向脂质组学分析技术。首先使用流式细胞术将细胞分选到54孔微样品管阵列中，然后采用一锅法同时进行细胞破碎、氧脂质提取和 N,N-二乙基-1,3-二氨基丙烷（DEPA）标记。54个细胞样本的衍生化在室温下仅用1分钟完成，从而使整个预处理过程在10分钟内完成。最后利用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）对氧脂质进行表征。在1000个RAW 264.7细胞样本中鉴定出14种氧脂质，并在单细胞分析中成功检测到8种不同的氧脂质，包括12-HEPE、15-HEPE、12-HETE、PGD2和PGE2。该方法表现出高灵敏度（浓度范围为0.03–2.98 nmol/L）、优异的线性（R2 = 0.992–0.999）以及低至0.2 pmol/L的检测限，证明了其良好的准确性和精密度。该方案通过一步微体积反应消除了溶剂转移、蒸发和复溶步骤，大大减少了样本损失和氧化风险。整个工作流程在10分钟内即可完成54个样本的分析，并具有高灵敏度。该方法与流式分选细胞、自动化液体处理和在线质谱完全兼容，可从稀有原代细胞、临床活检样本或单个细胞中获取精确、可重复的氧脂质谱型，为单细胞脂质组学和精准医学研究开辟了新途径。

**1. 引言**
氧脂质主要来源于n-3和n-6多不饱和脂肪酸（PUFAs）[1]，它们通过三种酶促途径（环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450（CYP450）或非酶促自氧化过程合成[2,3]。氧脂质在正常生理功能中起着不可替代的作用，对组织修复、免疫[4]、炎症[5]等多种生理功能具有重要影响。脂质介质如二十烷酸类和其他来自花生四烯酸（ARA）的氧脂质在炎症中具有显著作用。例如，前列腺素E2（PGE2）和白三烯B4（LTB4）可通过刺激血流变化引发急性炎症反应[6]。来自n-3多不饱和脂肪酸的特异性抗炎介质具有多种抗炎和促炎作用。大量研究集中在二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）衍生的树脂素、保护素和马瑞素上。其中，羟基二十碳五烯酸（HEPEs）通过脂氧合酶（LOX）和非酶促氧化途径生成，在调节炎症中起重要作用[7,8]，特别是18-HEPE作为E系列树脂素（如RvE1和RvE2）的生物合成前体[7,8]。各种前体PUFAs及其酶促和非酶促氧化产物可生成多种氧脂质，但这些产物的化学结构相似性给分析带来了挑战。串联质谱/质谱（tandem MS/MS）与液相色谱（LC）结合的使用已被证明适用于多种生物样本中多种氧脂质的灵敏、选择性鉴定和定量。通常，分析物通过反相色谱（C18）分离，然后使用电喷雾离子化（ESI）在负离子模式下进行电离，随后在三重四极杆质谱仪（QQQ-MS）上通过多反应监测（MRM）进行定量[9,10]。K.M. Rund等人[11]描述了一种LC-ESI(-)-MS/MS方法，可在12分钟内同时定量来自六种不同PUFAs的异前列腺素（IsoP）和8种异呋喃（IsoF）。这些过程的复杂性和动态性凸显了需要能够详细分析氧脂质在细胞中的分布及其代谢命运的分析技术。

对小鼠巨噬细胞及其上清液中氧脂质的研究表明，脂多糖（LPS）通过线粒体β-氧化动态增强氧脂质的清除[12]。Wiley等人[13]发现衰老细胞会促进多种氧脂质的生物合成。尽管氧脂质具有多样的生理作用并对细胞功能至关重要[14,15]，但现有的细胞氧脂质分析方法仍存在局限性。其低浓度以及众多结构异构体和显著的异质性给细胞样本中的氧脂质分离和定量带来了挑战。此外，传统的细胞代谢分析方法通常涉及大量细胞（10^5–10^7个细胞）[18,19]。常见的预处理方法（如蛋白质沉淀和固相萃取（SPE）[20]往往耗时较长。这使得难以避免非生理条件对样品的影响。对于稀有细胞类型，如果能将细胞数量减少到数千个甚至单个细胞，将极大促进细胞异质性的研究。由于细胞内氧脂质浓度通常在皮摩尔到纳摩尔范围内，因此对少量细胞的定性和定量分析具有挑战性。因此，开发高度灵敏和高通量的分析方法对于克服这些挑战、充分发挥氧脂质在理解细胞机制和异质性方面的潜力至关重要。

为了解决传统细胞氧脂质分析方法的局限性，迫切需要创新方法来提高分析的灵敏度和通量。一些研究采用衍生化技术来增强质谱检测灵敏度[21,22]。衍生化是一种有价值的技术，可使ESI在正离子模式下使用，从而显著提高电离效率和分离效果[23]。一些试剂（如N-(4-氨基甲基苯）吡啶inium氯化物（AMPP）[24,25]和2-二甲基氨基乙胺（DMED）[26,27]被用于标记氧脂质。然而，这些用于羧基化合物的衍生化方法需要较高的反应温度和较长的反应时间。我们实验室之前的研究[28]使用DEPA进行氧脂质衍生化，从而将三级胺基引入分析物中（图S1），并在正离子模式下提高ESI源的电离效率。此外，该反应在室温下1分钟内完成。由于衍生化时间短且温度较低，DEPA更适合用于细胞中的氧脂质标记。然而，在这些方法中，提取和衍生化步骤是分开进行的，导致预处理过程繁琐，从而限制了大量细胞样本的氧脂质分析和筛选的通量。鉴于细胞中氧脂质含量低且易快速代谢，亟需一种既高效又经济、同时保持高灵敏度的分析方法。

为实现这些目标，我们提出的高通量分析平台结合了一锅法微体积衍生化技术和靶向UPLC-MS/MS分析。该方法利用流式细胞术（荧光激活细胞分选（FACS）系统的精度将细胞分选到微孔阵列中，然后同时进行细胞破碎、氧脂质提取和DEPA标记。这一简化方案不仅减少了样本损失和准备时间，还保证了高灵敏度和准确性。我们将该方法应用于参与炎症发生和消退的少量小鼠巨噬细胞，证明了其在氧脂质分析和揭示不同巨噬细胞状态代谢差异方面的有效性。这种高通量、靶向脂质组学方法对于深入了解氧脂质在细胞过程中的作用具有重大潜力，特别是在细胞数量有限的情况下。

**2. 材料与方法**
2.1. 化合物和试剂
所有107种氧脂质标准和5种同位素标记的氧脂质均购自Cayman Chemical Co., Ltd.（美国密歇根州）。这些标准的详细化学信息（包括系统名称和化学公式）见支持信息（SI）（表S1）。使用的同位素标记氧脂质包括：9S-羟基十八二烯酸-d4（9S-HODE-d4）、前列腺素E2-d4（PGE2-d4）、5S-羟基二十八四烯酸-d8（5S-HETE-d8）、11,12-环氧二十三烯酸-d11（11,12-EET-d11）和13-氧代十八二烯酸-d3（13-oxoODE-d3），作为内标（IS）。LC-MS级乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）和HPLC级甲酸购自CNW（德国杜塞尔多夫）。超纯水由Milli-Q水纯化系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）制备。1-[双（二甲基胺）亚甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶inium 3-氧化物六氟磷酸盐（HATU）和三乙胺（TEA）购自Sigma-Aldrich Laboratories, Inc.（美国密苏里州圣路易斯）。DEPA购自上海Aladdin Reagent Co., Ltd（中国上海）。HATU（20 μmol/L）、TEA（20 μmol/L）和DEPA（20 μmol/L）的储备溶液均用LC-MS级ACN配制，并储存于-20°C备用。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）以及0.25%胰蛋白酶-EDTA购自Gibco Co., Ltd.（美国卡尔斯巴德）。LPS购自Sigma-Aldrich Co.（美国密苏里州圣路易斯）。

2.2. 细胞采样
RAW264.7细胞在含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中37°C培养，置于5% CO2环境下。通常将细胞以5×10^5个细胞的密度接种到24孔培养板上过夜培养。24小时后，加入0.5 μg/mL LPS继续培养24小时。收获RAW264.7细胞后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，然后转移到离心管中，在4°C下离心3分钟。将细胞沉淀物用PBS稀释，准备进行流式细胞术分选。空白对照组中不添加LPS。

2.3. 用FACS分选细胞
将54个注射瓶（每个1.5 mL）放入54孔样品板中，每个瓶中含有溶解在50 μL冷乙腈中的4 nmol/L内标（IS）。将54孔微样品管阵列放置在托盘上，等待细胞分选。使用MoFlo XDP高速流式细胞分选仪（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州）对细胞群体进行分选和分离。分选仪配置了100 μm CytoNozzle喷嘴和405、488、561、640 nm波长的激光，选择单细胞分选模式。鞘流压力设置为25 psi，鞘液由0.9% NaCl和去离子水组成。激光1和激光2的延迟时间分别设置为5000 ns和2500 ns。获得单细胞的分选策略见图S2。在加载前，使用300目（50μm）无菌过滤器过滤细胞悬浮液，随后根据所需细胞数量（如1、10、100等）将细胞分选到54孔微样品管中。最终将54孔微样品管阵列储存于-80°C备用。

2.4. 一锅法微体积化学衍生化
从上一步取出54孔微样品管阵列，直接浸入冰水浴中。随后使用超声破坏器在冰水浴中同时处理54组细胞样本，以确保细胞内容物充分释放。破坏后，用氮气冲洗系统快速干燥样品，为下一步反应做好准备。接着使用六通道移液器（Eppendorf Research? plus）依次向每个含细胞样本的管中加入2 μL HATU（20 μmol/L）、4 μL TEA（20 μmol/L）、2 μL DEPA（20 μmol/L）和2 μL ACN。这种连续加样过程确保了所有54个样本的反应条件一致。

将54孔微样品管阵列涡旋混合以促进均匀衍生化反应，然后在室温下在超声水浴中孵育1分钟，确保氧脂质完全标记。在此过程中，通过1200 W功率和60 kHz频率的超声波同时实现细胞破碎。之后，54组细胞样本中的氧脂质被DEPA完全标记。最后，将样品阵列直接转移至液相色谱-质谱注射托盘。最后，每次取5 μL标记样本进行UPLC-MS/MS分析。

2.5. UPLC-MS/MS分析
使用UPLC-MS/MS系统对DEPA衍生的氧脂质进行分析。该系统配备了一台QTrap 6500+质谱仪（Sciex，加拿大），该质谱仪配备了ESI源；以及一台UPLC LC-30AD系统（Shimadzu Corp.，京都，日本），该系统包含两个30AD泵和一个SIL-30AC自动采样器，该自动采样器配备了可更换的自动采样架和54孔微样品管阵列。样品架保持在4°C。色谱分离使用反相Zorbax Eclipse Plus C18柱（内径4.6 × 100 mm，粒径1.8 μm，Agilent）进行，流速为0.5 mL/min。流动相为0.2%甲酸水溶液（v/v）作为溶剂A，0.2%甲酸乙腈溶液（v/v）作为溶剂B。梯度程序如下：0-2分钟25% B，2-4分钟25-35% B，4-20分钟35-60% B，20-22分钟60-99% B，22-26分钟99% B，26-28分钟99-60% B，28-30分钟60-25% B，30-35分钟25%。柱温为45°C。所有37种目标氧脂素在20分钟内完全洗脱完毕，剩余时间用于柱子清洗和重新平衡。质谱检测采用正离子化模式下的MRM扫描技术。最佳ESI条件如下：碰撞气体压力设定为中等；帘幕气体压力35.0 psi；离子喷雾电压5500V；温度550°C；离子源气体1为40 psi；离子源气体2为45 psi；去簇电位（DP）为75 V；碰撞能量（CE）为35 V；MRM检测窗口为120秒。MRM转换数据详见支持信息（表S1）。具体而言，增强产物离子（EPI）扫描的覆盖范围是m/z 50至700，扫描速率为4000 amu/s，同时使用陷阱进行动态填充。鉴定出的数据进一步使用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）进行统计分析。

2.6 方法验证
使用浓度分别为0、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10 nmol/L的氧脂素标准品生成标准曲线。这些曲线是通过将峰面积比（分析物/内标）与氧脂素浓度进行回归得到的。检测限（LODs）定义为信号噪声比（S/N）为3时的分析物浓度；定量限（LOQs）定义为S/N为10时的浓度。根据Schebb等人的最新指南（https://doi.org/10.1126/scisignal.adw1245），[S/N]值是根据未经平滑处理的原始色谱图计算的，其中信号定义为高于平均基线噪声的峰高。噪声定义为在分析物峰附近的代表性基线区域内测得的峰谷幅度。空白鞘液是从不含细胞的FACS仪器中收集的，其衍生化和样品处理过程与实际样品相同，用作空白样品以监测潜在的背景干扰。准确度和精密度基于回收率和日内及日间相对标准偏差（RSDs）进行评估。这些指标是使用加入1000个RAW264.7细胞的氧脂素标准品在三种不同浓度（0.1、1和5 nmol/L）下计算的。每个浓度水平重复三次实验，同时分析了未添加样品的细胞。样品的日间准确度和精密度在三天内进行评估。通过向基质样品中加入已知量的分析物并进行彻底提取来评估提取回收率（n = 3）。每次实验前通过分析质量控制样品（氧脂素标准溶液）来评估仪器性能。我们将标准样品中检测到的各个氧化脂质的峰面积和保留时间与之前实验中运行的对照样品进行比较，以确保方法的稳定性。

2.7 数据分析
所有数据均使用Analyst 1.6.3软件采集，并通过Quantitative Wizard（AB/SCIEX，加拿大）进行定量处理。方差分析（ANOVA）用于评估LPS处理过的RAW264.7细胞与对照细胞之间氧脂素含量的差异显著性。进一步使用独立样本t检验评估单个氧脂素的统计显著性。所有比较的统计显著性阈值设定为p < 0.05。为了便于数据差异的可视化，预处理后的代谢组学数据集被上传到基于网络的平台MetaboAnalyst 6.0（http://www.metaboanalyst.ca）。随后进行了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和变量重要性投影（VIP）分析，以识别分类中最具影响力的变量。

3 结果与讨论
3.1 高通量单锅微量化学衍生化
在使用UPLC-MS/MS方法分析少量细胞（大约1000个或更少）中的代谢物时，防止样品损失和提高质谱强度对于获得有意义的数据至关重要。由于细胞长时间暴露于非生理环境中，因此也需要一种高效且快速的预处理方法来展示代谢物的变化。在这项研究中，我们开发了一个54孔微样品管阵列制备平台（图1），并采用了一种方法，即将FACS基础的细胞分离与DEPA标记相结合（图S1），然后直接进行UPLC-MS/MS氧脂素检测。

下载：下载高清晰度图片（423KB）
下载：下载全尺寸图片
图1. 结合UPLC-MS/MS的单锅微量化学衍生化示意图，用于分析细胞样本中的氧脂素。
FACS在获取单个细胞方面非常可靠，且干扰最小，被广泛用于单细胞组学研究[18,30,31]。当使用0.9% NaCl的去离子水作为鞘液时，FACS分离出的细胞滴液非常稳定，这可以在低pH缓冲液中准确地将细胞分类到微样品管中，从而可能减少色谱分析中的问题[30]。DEPA被用于衍生氧脂素，以提高ESI源中的电离效率和检测灵敏度（正离子模式）。我们实验室之前的工作[28]已经验证，氧脂素的最佳DEPA标记条件是在室温下持续1分钟，并采用HATU/TEA/DEPA的摩尔比为1:2:1进行超声处理。大多数用DEPA标记的氧脂素的标准品的衍生化效率超过了99%。考虑到这种方法的衍生化时间较短且温度较低，DEPA适合用于标记氧脂素。
我们采用上述方法分析了细胞中的氧脂素。此外，在追求灵敏和高效的氧脂素分析过程中，我们使用了七种不同的氧脂素标准品，包括13-HODE、14,15-EET、15-HETE、18-HEPE、9-oxoODE、LTB4和Resolvin D1（RVD1），以研究不同化学试剂添加方法对质谱中峰面积的影响。在一组实验中，预先配置好的HATU、DEPA和TEA溶液按最佳比例混合后，使用6通道移液器加入到54孔微样品管阵列中进行氧脂素标准品的标记。在另一组实验中，HATU、DEPA和TEA溶液按照最佳比例逐步加入到相同浓度的氧脂素标准品中。通过比较不同添加方法得到的LC-MS信号，我们发现使用“逐步”方法得到的七种不同氧脂素标准品的峰面积普遍大于使用“混合”方法得到的峰面积，大约高出41.6 ± 5.9%（图S3）。因此，逐步添加化学试剂的方法产生了更有效的衍生化效果。
我们应用所选的分析方法来确定细胞中的氧脂素。对于细胞样本而言，改进的样品准备效率可以促进大规模临床样本中氧脂素及其他与疾病研究相关的代谢物的分析。高通量单锅微量化学衍生化过程可以分为三个步骤（图1）。首先，使用FACS在几分钟内快速将细胞分类到54孔微样品管阵列中。然后，提取并衍生细胞中的氧脂素。依次向微样品管中加入HATU、DEPA和TEA溶液，并在室温下对阵列进行1分钟的超声处理。最后，立即对54孔微样品管阵列进行UPLC-MS/MS分析。流式细胞仪在细胞分选方面非常高效，它们通过将细胞封装在鞘液中来保持细胞的完整性。每个样品注射瓶含有250 μL的玻璃样品管，放置在一个54孔板上形成微样品管阵列。在这个阵列中，细胞通过超声处理裂解，然后直接加入衍生化试剂。这种方法减少了转移操作的需要，从而最小化了样品损失和代谢物组成的变化。此外，高效的衍生化过程不需要较长的反应时间。因此，与基于流式细胞术分选方法的其他细胞代谢物分析方法相比，我们将每个样品的预处理时间从30-60分钟减少到了10分钟内处理54个样品（表1），从而显著提高了效率。此外，这些针对少量细胞的研究主要关注代谢物的筛选，但关于具有重要生理功能的氧脂素的数据有限。在我们的研究中，我们在1000个巨噬细胞中检测到了14种氧脂素，在单个细胞中检测到了8种氧脂素，提供了对细胞中氧脂素的全面分析，补充了其他研究中缺乏的氧脂素分析。

3.2 DEPA衍生化氧脂素的片段化和保留行为
DEPA的氨基选择性地标记了氧脂素的羧基，形成了三级氨基，在碰撞诱导解离（CID）过程中可以释放特征性的中性丢失（NL）片段N,N?二乙胺（NL 73Da）。基于之前研究的结论，我们使用氧脂素标准品来探索其衍生产物的片段化模式。对于单羟基氧脂素（如12-HEPE（羟基位于C12）、15-HEPE和18-HEPE（羟基分别位于C15和C18）异构体（图2A），在反相液相色谱条件下使用C18柱即可实现充分分离。图2B中可以清楚地看到m/z 431.3的前体离子。m/z 413.1的片段离子是由于失去了H2O ([M+H-18]+）而形成的。m/z 340.1的片段离子是由于进一步失去了DEPA的特征性N,N-二乙胺（NL 73 Da） ([M+H-91]+）而产生的。对于用DEPA标记的双羟基和三羟基氧脂素，会有额外的相应片段离子，分别失去2H2O或3H2O，并且共同失去73Da的中性片段。此外，我们还观察到了m/z 139.1的片段离子，这是由于α-碳和β-碳键与羟基相连的断裂而产生的。15-HEPE和18-HEPE作为12-HEPE的位置异构体，具有相同的质谱片段规则（图2C和图S5），并且明显观察到了m/z 99.1和m/z 59.0的片段离子。因此，这些异构体可以被准确识别。

下载：下载高清晰度图片（755KB）
下载：下载全尺寸图片
图2. DEPA衍生的HEPEs、oxoODEs和PGs的提取离子色谱图和MS/MS片段化谱。（A）DEPA衍生的12-HEPE、15-HEPE和18-HEPE的代表性色谱图。（B）和（C）DEPA衍生的12-HEPE和15-HEPE的MS/MS片段化谱。（D）DEPA衍生的9-oxoODE和13-oxoODE的代表性色谱图。（E）和（F）DEPA衍生的9-oxoODE和13-oxoODE的MS/MS片段化谱。（G）DEPA衍生的PGE?和PGD?的代表性色谱图。（H）和（I）DEPA衍生的PGE?和PGD?的MS/MS片段化谱。
对于酮基氧脂素，9-oxoODE（酮基位于C9）和13-oxoODE（酮基位于C13）是异构体。根据图2D，它们被有效分离。m/z 407.1的前体离子和m/z 334.1的片段离子是通过失去DEPA的特征性N,N?二乙胺（NL73 Da） ([M+H-73]+) 在MS/MS谱中清晰可见（图2E和2F）。我们还观察到了m/z 151.0和m/z 336.0的片段离子，这些片段离子是通过α-碳和β-碳键与酮基的断裂产生的。与羟基氧脂素相比，酮基氧脂素没有失去H2O的片段离子。对于前列腺素E1和D2，在DEPA标记后，它们的前体离子相同，均为m/z 465.4。提取离子色谱图（图2G）显示PGE2和PGD2的保留时间分别为6.27分钟和6.55分钟。在图3H和3I中，m/z 447.1的片段离子是通过失去H2O ([M+H-18]+) 和m/z 374.4的片段离子是通过失去DEPA的特征性N,N?二乙胺（NL73 Da）和H2O ([M+H-91]+) 在MS/MS谱中清晰可见。此外，我们观察到了碎片离子m/z 356.0，这是由于进一步失去H2O ([M+H-109]+) 而产生的。如图2所示，在当前的分析条件下，质量谱中没有观察到显著的Na?或K?加合物峰。衍生化策略提高了氧脂素的检测灵敏度，而MRM提高了分析选择性，从而减轻了来自核酸和蛋白质等生物大分子的潜在基质效应。下载：下载高分辨率图像（174KB）下载：下载全尺寸图像图3. 1000个RAW264.7细胞中氧脂素的定量和统计分析。两组细胞之间氧脂素的直方图。所有数据以平均值±SEM表示（LPS组n=6，对照组n=5）。3.3. UPLC-MS/MS分析方法验证通过UPLC–MS/MS分析，在106个RAW 264.7细胞中鉴定了37种氧脂素。因此，将这些37种氧脂素标准品以0.1、1和5 nmol/L的浓度加入到1000个RAW264.7细胞中，以评估在小数量细胞中的分析准确性、精确度和灵敏度。它们的提取离子色谱图显示在图S4中。在最佳条件下进行的该方法验证总结在表S2中，包括前体离子、产物离子、内标物、线性范围、R2、LODs和LOQs。使用五种不同的同位素标记氧脂素（9S-HODE-d4、PGE2-d4、5S-HETE-d8、11,12-EET-d11和13-oxoODE-d3）作为内标物。结果显示，获得了良好的线性，相关系数（R2）从0.9921到0.9995不等。37种氧脂物的LODs和LOQs分别位于0.2?27.78 pM和0.66?92.59 pM范围内。在ESI+模式下建立的方法对于这37种氧脂素的灵敏度远高于之前使用未衍生化ESI-分析的方法，检测限（LOD）提高了8到3520倍[25,33]（表2）。该方法显示出良好的精确度，所有化合物的日内和日间RSD均小于20%（日内为3.28% –23.09%，日间为1.56% –22.85%），这在可接受范围内（表S3）。这些结果表明，所提出的方法具有良好的准确性和精确度，可用于少量细胞中氧脂素的定量分析。表2. 我们开发的方法与之前报道的基于MS的分析方法得到的氧脂物LODs的比较[25,33]。分析物LOD（pM）使用DEPA衍生化LOD（pg）使用DEPA衍生化LOD（pg）不使用衍生化[25,33]增加倍数12-HHT 1.90.0 0.756 6913-oxoODE 0.60.0 23.82156 39-oxoODE 0.80.0 32.949029(s)-HODE 1.50.0 63.2653113-HODE 1.50.0 60.81309(10)-EPOME 1.70.0 73.2346412(13)-EPOME 1.30.0 52.184109(10)-DiHOME 3.70.0 162.3614918-HEPE 2.70.0 121.5913715-HEPE 27.80.1200.95812-HEPE 4.40.0 190.482514(15)-EpETE 40.0170.915312-HETE 3.10.0 130.292211-HETE 2.70.0 120.332814,15-EET 2.10.0090.353811.12-EET 10.0040.112515-HETE 1.60.0070.22325-HETrE 0.20.0010.9103415(S)-HETrE 0.80.0030.925811-HEDE 0.40.0020.653729(s),10(s),13(s)-TriHOME 0.80.0040.051417-HDHA 2.10.0101.3414013-HDHA 0.60.0030.13616-HDHA 2.50.0110.97914-HDHA 3.70.0170.5231PGE3 1.70.00818.81238815-keto-PGE2 1.70.0082.126711β-PGE2 2.60.0120.97415-keto-PGF2α 4.20.0203154PGF3α 2.60.01242.583520PGD 29.90.04623.25505PGE2 1.40.00717.542692PGD112.30.05742.82745PGE13.70.01730.921788PGF2α 0.50.0026.27268415-keto-PGF1α 2.90.0149664PGF1α 14.90.07036.765263.4. 氧脂素谱型与巨噬细胞生物功能的关联本研究利用所提出的方法来检查LPS诱导极化后RAW264.7细胞中氧脂素的组成和数量的变化。首先，通过结合传统预处理方法和107种氧脂素标准品（表S1）建立的靶向脂质组学策略，在未经LPS处理的和LPS处理的RAW264.7细胞中鉴定了一组共37种氧脂素（表S2）。随后，利用我们建立的方法，研究了LPS处理组和对照组RAW264.7细胞之间氧脂素谱型的差异。此外，我们还评估了LPS处理对RAW264.7细胞中氧脂素的组成和数量的影响。分析了1000个LPS处理过的细胞样本（称为LPS组）和含有1000个细胞的对照样本（称为C组）。氧脂素的定性分析涉及在相同的LC-MS条件下比较保留时间、m/z和MS/MS碎片模式与化学标准品。在整个1000个细胞样本集中，共确定了14种氧脂素，包括9种单羟基氧脂素、2种酮氧脂素、2种前列腺素和1种三羟基氧脂素。此外，这些氧脂素也在106个RAW264.7细胞中被检测到。图3中的直方图直观地展示了两组之间观察到的氧脂素含量的差异。在LPS组中，15-HEPE和11-羟基二十二碳二烯酸（11-HEDE）的含量最高和最低，分别为1.81 ± 0.86 nmol/L和0.09 ± 0.01 nmol/L。在对照组中，氧脂素的最高和最低含量分别为11-HEDE和PGE2，分别为0.25 ± 0.04 nmol/L和0.10 ± 0.03 nmol/L。图3显示了在这两组中都存在的五种氧脂素：12-HHT、11-HEDE、13-HODE、PGD2和PGE2。在LPS处理组中，检测到了八种独特的氧脂素：18-HEPE、15-HEPE、12-HEPE、12-HETE、13-oxoODE、9(s),10(s),13(s)-三羟基十八碳二烯酸（9(s),10(s),13(s)-TriHOME）、9-oxoODE和9(s)-HODE，这些在对照组中不存在。然而，11-HETE仅在对照组中被检测到。采用聚类热图（图4A）分析来评估两组之间氧脂素的分布。正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型用于确定LPS处理组和对照组之间氧脂素的差异。OPLS-DA结合了正交信号校正（OSC）和偏最小二乘-判别分析（PLS-DA），通过消除不相关的差异来进一步显示组间差异。OPLS-DA得分将样本分为不同的簇，表明RAW264.7细胞中的氧脂素存在显著差异（图4B）。从交叉验证的OPLS-DA模型（图4C）中得出的VIP得分用于排名个别氧脂素对组分离的贡献。以p < 0.05（ANOVA）和VIP ≥ 1为标准，可以识别出在两组细胞样本之间表现出显著差异的氧脂素，包括11-HETE、11-HEDE、9(s)-HODE、9(s),10(s),13(s)-TriHOME、13-HODE和PGD2。下载：下载高分辨率图像（547KB）下载：下载全尺寸图像图4. LPS对RAW264.7细胞中氧脂素的影响。(A) 两组细胞之间氧脂素成分的层次聚类热图分析。(B) 对照组（红色）和LPS处理组（绿色）中氧脂素的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。(C) RAW264.7细胞中氧脂素的VIP得分图。3.5. 氧脂素谱型与炎症激活之间的关联靶向氧脂素谱型揭示了LPS刺激的巨噬细胞中的明显代谢变化，主要涉及脂氧合酶（LOX）和环氧化酶（COX）途径。氧脂素对于调节炎症反应和许多其他生理功能至关重要。12-羟基十七碳三烯酸（12-HHT）是一种17碳的羟基脂肪酸，可以由血栓烷合酶（TXAS）和细胞色素P450生物合成。12-HHT被发现是一种内源性BLT2激动剂，可诱导肥大细胞迁移并促进过敏性炎症[2,35]。两组之间的含量没有统计学上的显著差异；然而，LPS组的水平略高于对照组（图5A）。下载：下载高分辨率图像（400KB）下载：下载全尺寸图像图5. A. 两组细胞中呈现的氧脂素直方图。所有数据以平均值±SEM表示。（LPS组n=6，对照组n=5；“**”和“***”分别表示差异显著（P<0.01）和（P<0.001），“ns”表示两组之间没有显著差异）。B. 在不同数量细胞样本中进行的UPLC-MS/MS分析：1个细胞（粉红色线）、10个细胞（蓝色线）、100个细胞（红色线）和1000个细胞（空白线）；峰A：9(s),10(s),13(s)-TriHOME，峰B：15-HEPE，峰C：13-oxoODE，峰D：9-oxoODE。几种单羟基氧脂素12-HEPE、15-HEPE、18-HEPE和12-HETE在LPS处理组中显著上调，这与报道的结果一致，表明它们在极化的巨噬细胞中广泛存在[4,36,37]。值得注意的是，新生儿中性粒细胞衍生的12-HETE对小鼠肺发育过程中肺泡巨噬细胞的自我更新和维持至关重要[38]。18-HEPE通过CYP途径从EPA形成，可以进一步转化为E系列树脂素（例如，树脂素E1）[39]。相反，11-HETE是COX途径的ARA衍生物，仅在对照组中被检测到，表明被LPS抑制。前列腺素是在M1和M2巨噬细胞与病原性大肠杆菌或金黄色葡萄球菌孵育过程中产生的主要氧脂素[40]。PGD2和PGE2都来自ARA，在暴露于氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的巨噬细胞中积累量较高[41]。在我们的研究中，LPS组的PGD2浓度显著升高，而PGE2仅显示出不显著的增加趋势（图5A）。这种差异调节可能表明这两种前列腺素在调节炎症反应中具有不同的作用，它们之间的平衡可能有助于限制免疫损伤[39,40,42,43]。此外，11-HETE在对照组中的含量显著高于LPS组（图S6），这加强了LPS在RAW 264.7巨噬细胞中广泛重新编程ARA代谢的观点[29]。亚油酸（LA；C18:2）可以通过酶（由LOX）和非酶途径氧化，产生HODEs[44,45]，这些HODEs能够引起血管扩张、抑制细胞增殖并导致细胞凋亡[46]。9-HODE和13-HODE是两种主要的HODE异构体，在炎症的亚慢性阶段，它们在发炎的组织和相应的背根神经节中显著增加[47]。这些羟基氧脂素可以脱氢生成酮衍生物，如oxoODEs。LA还可以转化为三羟基十八碳二烯酸[48]，并在哮喘和慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病中被发现失调[49]。在这项研究中，我们在两组细胞中都检测到了13-HODE，其在LPS处理组中的含量远高于对照组，而9(s)-HODE和9(s),10(s),13(s)-TriHOME仅在LPS组中被检测到。我们还在RAW264.7细胞中检测到了9-oxoODE和13-oxoODE，这与先前的研究一致[50]。需要指出的是，未检测到并不一定意味着绝对不存在；这可能只是因为浓度低于检测限。3.6. 使用建立的方法对单个细胞中的氧脂素进行分析我们还在LPS处理的单个细胞样本中发现了8种氧脂素，包括12-HEPE、15-HEPE、18-HEPE、9-oxoODE、13-oxoODE、9(s)-HODE、9(s),10(s),13(s)-TriHOME和12-HETE，这与氧脂素可以在单个细胞中被检测到的事实相符[51]。它们的响应强度在大多数样本中超过了定性限（图5B），并且随着细胞数量的增加，峰强度逐渐增加。其中，9-oxoODE和13-oxoODE的峰强度较高，这可能是由于衍生化显著提高了它们的分析灵敏度（分别提高了902倍和1563倍）（表2）。值得注意的是，氧脂素仅在LPS处理的单个细胞样本中被检测到，而在对照组的单个细胞样本中未检测到。这表明对照组中单个和群体细胞中的氧脂素存在变异性。这也是细胞异质性的反映，用于描述与大多数细胞不同的单个细胞的重要生物学现象。这强调了单细胞分析的重要性。这八种潜在的氧脂素进一步进行了经典的单变量ROC曲线分析，结果显示有五种氧脂素的AUC >0.7（包括12-HETE、18-HEPE、9(s),10(s),13(s)-TriHOME、13-oxoODE和9-oxoODE）（表S4）。因此，这些氧脂素有可能作为单极化巨噬细胞的生物标志物，值得进一步研究。与基于毛细管捕获后进行衍生化的单细胞代谢物分析方法[52]相比，该协议使用54孔微量样本管阵列显著提高了分析通量（表1）。DEPA衍化的温和反应条件（室温，1分钟）防止了与长时间衍生化相关的氧脂素变化。最终在单个细胞中分析了8种氧脂素。因此，我们的协议提供了稳定可靠的单细胞分析能力。该实验采用高通量和高灵敏度的方法揭示了少量RAW264.7细胞中氧脂质的分布。该协议有助于开展大量旨在阐明氧脂质细胞代谢的研究，从而可能减少对稀有细胞类型和耗时实验的需求。4. 结论在分析细胞氧脂素的过程中，平衡灵敏度、精确度和通量是一个重大挑战。通常，为了其他考虑而牺牲通量，导致大规模样本分析效率低下，并且有额外的风险，即代谢物可能因环境影响而发生改变。在这项工作中，我们开发了一种高通量的一锅法微量化学衍生化方法，结合了靶向脂质组学，以实现细胞氧脂素的高通量和高灵敏度分析。细胞通过流式细胞术进行分类，然后使用一锅法在54孔微量样本管阵列中提取和衍生化氧脂质，随后进行靶向脂质组学分析。该方法能够在10分钟内完成54个细胞样本的预处理工作，显著提高了处理效率，并大幅提升了氧脂素的检测灵敏度（提升了3000多倍）。衍生化产物也表现出优异的质谱（MS）检测灵敏度。此外，通过在1000个细胞水平上分析氧脂素类型和含量的显著差异，该方法有效地区分了经LPS处理的巨噬细胞与对照组巨噬细胞。另外，在单细胞样本中检测到了8种氧脂素，其中5种氧脂素的AUC值大于0.7。这项研究深入探讨了氧脂素在生物学中的作用，并有助于识别与巨噬细胞不同生理状态相关的特异性生物标志物。我们预计，所提出的方法将对有限细胞样本的预处理和分析以及单细胞分析起到重要的补充作用。

作者贡献：
- Rao Di：撰写原始草稿、方法学设计、实验设计、数据分析。
- Wu Zongyuan：方法学设计、实验设计。
- Qin Zuojian：方法学设计、实验设计。
- Xiang Xia：方法验证、概念化。
- Chen Yu：实验设计、数据整理。
- Wang Dan：实验设计、数据分析。
- Lv Xin：方法学设计、数据整理。
- Tang Tang：实验设计、概念化、方法学设计。
- Chen Hong：数据可视化、实验设计。
- Wei Fang：研究指导、撰写与审核编辑、方法验证。

利益冲突声明：
作者声明不存在任何利益冲突。

补充信息：
该文章的补充数据可在线获取。

关于作者贡献的详细说明：
- Rao Di：撰写原始草稿、方法学设计、实验设计、数据分析。
- Wu Zongyuan：方法学设计、实验设计。
- Qin Zuojian：方法学设计、实验设计。
- Xiang Xia：方法验证、概念化。
- Chen Yu：实验设计、数据整理。
- Wang Dan：实验设计、数据分析。
- Lv Xin：方法学设计、数据整理。
- Tang Tang：方法学设计、实验设计、概念化。
- Chen Hong：数据可视化、实验设计。
- Wei Fang：撰写与审核编辑、方法验证、研究指导、实验设计。