使用MOF笼捕获的凝血酶进行开放式管状亲和毛细管电色谱法：在复杂系统中用于抗凝剂筛选的有效迁移率策略

《Talanta》：Open-Tubular Affinity Capillary Electrochromatography with MOF-Caged Thrombin: Effective Mobility Ratio Strategy for Anticoagulant Screening in Complex Systems

　　付新茹|田雅文|何瑶|夏志宁|江新辉|黄一珂
重庆医科大学药学院，重庆400016，中国

摘要：亲和毛细管电泳（ACE）是一种强大的药物-蛋白相互作用筛选工具，但传统的ACE存在分离常数（Kd）检测范围较窄（10-3–10-5 mol·L-1）的局限性。为克服这一限制，我们开发了一种基于血栓酶固定在中孔金属有机框架（meso-MOF-1）笼子内的亲和毛细管电色谱（ACEC）平台（Thr/meso-MOF-1@capillary）。通过有效迁移率比策略，该方法准确测定了盐酸苄胺（19 μM）的Kd，并成功区分了阿加曲班、盐酸苄胺和四种黄酮类化合物与血栓酶的相互作用强度。实验结果与分子对接分析的结论一致。此外，该方法的可靠性通过体外抗凝测试和对金银花提取物中抗凝成分的实际样本筛选得到了进一步验证。Thr/meso-MOF-1@capillary柱表现出优异的重复使用性（≥46次运行）和良好的酶活性（Km = 0.397 mM）。这项工作为从复杂系统中筛选抗凝活性成分提供了有效的工具。

引言
血栓性疾病，如急性心肌梗死（1）、（2）、缺血性中风（3）和深静脉血栓形成（4）、（5），仍是全球范围内的主要死亡和残疾原因。血栓酶（Thr）（6），（7），（8）是凝血级联反应中的关键丝氨酸蛋白酶，作为最终效应分子。作为血栓形成的重要介质，它特异性催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，这是血栓的主要结构成分。鉴于其高度保守的活性位点和在血栓调节中的不可或缺的作用，血栓酶长期以来一直被认为是开发新型抗凝剂的理想靶点。目前的抗凝剂，如华法林（9）和利伐沙班（10），主要通过抑制凝血级联反应中的关键步骤来发挥治疗效果。尽管这些药物能有效降低血栓风险，但它们仍存在显著的限制，特别是高出血风险和某些患者群体中出现药物抵抗的问题。因此，迫切需要更安全、更有效的抗凝候选药物。在这种情况下，通过靶向血栓酶发现和筛选具有提高效力和减少不良反应的高活性化合物具有重要的临床意义和实际价值（11）。

目前，已开发出多种基于药物和蛋白质之间分离常数（Kd）测量的药物筛选技术，包括表面等离子体共振（SPR）（12），（13）、等温滴定量热法（ITC）（14）、微尺度热电泳（MST）（15）、生物层干涉法（BLI）（16）、荧光极化（FP）（17），（18）和荧光共振能量转移（FRET）（19），（20）。这些技术为药物筛选提供了强大的平台，能够深入分析活性成分与目标蛋白之间的结合相互作用，并提供关键数据以支持药物候选物的合理设计和结构优化。尽管这些方法都能确定Kd，但它们无法表征蛋白质与多组分活性成分之间的相互作用，甚至无法表征复杂系统中物质的相互作用。

毛细管电泳（CE）是一种重要的药物筛选技术（21），（22），（23）。该技术只需要纳升级别的样品体积，并提供高分离效率。亲和毛细管电泳（ACE）是一种经典的分析方法，用于研究蛋白质和药物之间的相互作用（24），（25）。这种结合改变了分析物的电泳迁移率，从而实现分离、检测和Kd的测量。然而，传统的ACE使用自由溶液中的目标蛋白，其Kd的检测范围相对较窄，仅为10?3至10?5 mol·L-1。这一限制主要源于其依赖于测量配体结合到自由蛋白时引起的电泳迁移率变化（26）。对于高亲和系统，结合趋于饱和，迁移率变化不大；而对于低亲和系统，迁移率变化太小而无法准确量化。此外，自由蛋白容易发生变性和吸附，进一步缩小了可检测的Kd范围。因此，传统ACE在筛选药物时效率较低，尤其是来自复杂天然系统的药物（22），（27），（28），（29）。这些蛋白质的天然结构和活性容易受到pH值和温度变化等环境因素的影响（30），这可能导致蛋白质变性和活性丧失，从而影响实验的可重复性（29），（31）。

将蛋白质固定到固体支持物上可以有效克服传统ACE的局限性（32），（33）。将目标蛋白锚定到载体上制备复合固定相可以实现限制效应（34）。蛋白质限制（35），（36）是指通过物理封装、化学束缚或分子识别将蛋白质分子限制在特定的纳米环境中。这种策略利用空间位阻、局部微环境调节和分子间力来稳定蛋白质构象、限制迁移率并保持生物活性。稳定的限制优化了亲和毛细管电色谱（ACEC）中的固定相，扩大了结合常数测量的范围并提高了峰容量。因此，ACEC可以发展成为一个适用于分析复杂样品的强大而高效的筛选平台（37）。

近年来，金属有机框架（MOFs）作为酶固定的新型材料出现了（38），（39），（40）。例如，刘等人首次报道了使用UiO-66-NH2构建的MOF-IMER-CEC微分析系统，用于在线酶分析（41）。Gui等人开发了一种具有均匀介孔meso-MOF-1涂层的毛细管柱，该系统实现了多种分析物的高性能电色谱分离（42）。Yan等人进一步提出了一种基于分级多孔MOFs的IMER-CE系统，用于筛选酶抑制纳米材料（37）。最近，Zhou等人描述了一种开放式管状亲和毛细管电色谱方法（43），该方法使用PCN-333(Al)通过孔隙捕获固定牛血红蛋白进行研究药物-蛋白相互作用（44）。Chen等人采用ZIF-8作为固定相和底物固定牛血清白蛋白（32），建立了受体准固定亲和毛细管电泳策略，并成功测定了磺胺类药物与蛋白质之间的结合常数（32）。Qin等人开发了一种MOF/COF混合涂层开放式管状柱，用于六组类似物的高分辨率分离（44），基线分离在9.5分钟内完成。尽管取得了显著进展，但大多数现有的基于MOF的CEC系统主要关注提高分离性能或分析单一酶的动力学。尚未报道能够同时比较和筛选具有不同亲和力的活性成分之间相互作用的策略。

介孔金属有机框架（meso-MOFs）是血栓酶固定的理想支撑材料，因为它们很好地满足了蛋白质固定的结构和功能要求（45），（46），（47）。介孔MOFs具有可调的纳米孔和内在的框架孔隙，其大小可以针对性地匹配目标蛋白，从而实现有效的空间限制（48）。此外，它们优异的生物相容性和可调的微环境能够保持蛋白质的天然构象和酶活性，从而在很大程度上减少变性和失活（49）。此外，它们超高的比表面积和丰富的活性位点可以增强蛋白质的固定能力。当用作亲和毛细管电色谱中的固定相时，meso-MOFs可以显著提高整体检测性能（50）。

在这项研究中，使用meso-MOF-1（51），（52）作为高性能酶固定载体，构建了一种新型开放式管状亲和毛细管电色谱平台，用于高效筛选与血栓酶相互作用的活性成分。meso-MOF-1通过原位生长方法固定在毛细管内壁（42），并将血栓酶限制在其介孔孔隙内。系统地比较了Thr/meso-MOF-1@capillary柱、Bare@capillary柱、Thr@capillary柱和meso-MOF-1@capillary柱的分离效率和电泳性能。然后使用Thr/meso-MOF-1@capillary柱确定了血栓酶与阳性药物盐酸苄胺之间的Kd，以验证所建立方法的可行性。随后，采用有效迁移率比（Emr）策略作为定量指标，评估和排名MOF固定ACEC系统中不同化合物的结合亲和力，并进一步应用于筛选复杂的抗凝活性成分。筛选结果通过分子对接分析得到了验证。最后，通过体外抗凝试验和金银花提取物的筛选测试验证了所提出方法的可靠性和实际应用性。这项工作首次使用有效迁移率比作为定量参数，用于评估和排名复杂系统中多种活性成分与MOF固定目标蛋白之间的结合亲和力，实现了同时比较和筛选。制备的Thr/meso-MOF-1@capillary柱显示出优异的重复使用性，至少连续46次运行仍保持稳定性能，这一结果明显优于大多数报道的MOF-IMER-CEC系统。该策略在真实样品测试中进一步得到了验证。

将所提出的方法与其他分析方法进行比较（表S1），SPR和ITC具有较宽的检测范围，但需要大量的样品和较长的分析时间。传统ACE的检测窗口较窄，重复使用性有限。尽管MST和FP样品消耗量较低，但通常不可重复使用，并且对复杂基质的适应性中等。目前的方法实现了纳米级样品消耗量和短分析时间，同时显著扩大了检测范围，提高了对复杂基质的适应性，并增强了重复使用性，特别适用于从复杂系统中的天然产物中筛选抗凝活性成分。

**材料与设备**
材料和设备详见支持信息。

**血栓酶在meso-MOF-1上的吸附热力学和动力学**
对于酶吸附热力学实验，在室温下将2.0 mg的每种meso-MOF-1样品加入到不同浓度（0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 和 1.0 mg/mL）的血栓酶溶液中。对于酶吸附动力学实验，首先制备0.3 mg/mL的血栓酶储备溶液，然后在室温下将2.0 mg的最佳meso-MOF-1加入上述血栓酶溶液中。

**在不同合成条件下制备的血栓酶在meso-MOF-1上的固定**
为了选择最佳的meso-MOF-1材料用于血栓酶的限制固定，本研究研究了硝酸铜三水合物（Cu(NO3)2·3H2O）与H3TATAB的合成摩尔比对酶固定能力的影响。在Cu(NO3)2·3H2O（图2A）摩尔比从6:1降至5:1的系统中，血栓酶的固定能力从大约67 mg/g显著增加到96 mg/g。

**结论**
我们开发了一种新型亲和毛细管电色谱平台（Thr/meso-MOF-1@capillary），通过将血栓酶稳定限制在中孔MOF笼子内，克服了传统ACE检测范围较窄的局限性。有效迁移率比（Emr）策略能够定量排名复杂混合物中多个活性成分与血栓酶之间的相互作用强度，例如对阿加曲班、盐酸苄胺和四种黄酮类化合物的作用。该方法表现出优异的性能。

**作者贡献声明**
付新茹：撰写——原始草稿、验证、数据管理。田雅文：概念构思。何瑶：研究。夏志宁：监督、方法论。江新辉：软件。黄一珂：撰写——审稿与编辑、监督、方法论、概念构思。

**利益冲突**
作者声明没有已知的利益冲突。

**利益声明**
? 作者声明没有可能影响本文报道工作的已知竞争财务利益或个人关系。

**致谢**
本研究得到了国家自然科学基金（编号21974015和22204013）的支持。