利用定向噬菌体生物传感器快速电化学检测牛奶中的大肠杆菌

《Talanta》：Rapid electrochemical detection of Escherichia coli in milk using an oriented phage-based biosensor

　　

恩赫林·奥奇尔巴特（Enkhlin Ochirbat）|乔安娜·多林斯卡（Joanna Dolinska）|康拉德·吉津斯基（Konrad Gi?yński）|卡西亚里娜·鲁德科（Kaciaryna Rudko）|科斯蒂安廷·尼基福罗夫（Kostiantyn Nikiforow）|马尔钦·奥帕尔沃（Marcin Opa??o）|扬·帕切斯尼（Jan Paczesny）

波兰科学院物理化学研究所，卡斯普尔扎卡街44/52号，01224华沙，波兰

摘要

食品中的病原性大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）污染是一个重大的安全问题，尤其是在乳制品中，需要能够在复杂的样品体系中快速、选择性地检测到这种细菌。我们开发了一种基于电场辅助的噬菌体制生化传感器，可以在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和非脂牛奶中15分钟内检测出E. coli模型菌株。氧化铟锡（ITO）电极经过（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷和戊二醛处理，以实现T4噬菌体的共价结合。在噬菌体固定过程中，施加电场以使病毒颗粒定向，从而增加尾部受体结合蛋白的活性，提高捕获细菌的效率。检测方法采用差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry），使用外部氧化还原探针Fe(CN)₆^3-/4-。电场辅助的噬菌体定向使得电化学信号强度比未定向的噬菌体层提高约3倍，在10^4 CFU/mL浓度下比无噬菌体对照组高出约10倍。该生化传感器能够在PBS中定量检测从10到10^7 CFU/mL的E. coli，检测限为62 CFU/mL。该传感器对非宿主金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的响应强度几乎是E. coli的1/30，显示出高特异性。传感器在无需预富集样本的情况下，仍能在牛奶中实现12 CFU/mL的检测限。存储4°C两周后，传感器仍能保持其检测性能。结果表明，基于电场辅助的ITO噬菌体薄膜可以在模型溶液和复杂食品体系中实现简单、快速、选择性的E. coli检测。

引言

食品污染是一个持续存在的全球性挑战，对公共卫生和粮食安全构成严重威胁。据世界卫生组织估计，每年约有十分之一的人因食用受污染的食物而患病，导致42万人死亡[1]。在低收入和中等收入国家，因食用不安全食品引发的多种疾病每年造成的生产力损失和医疗费用至少达1100亿美元[2]。在各种细菌污染物中，大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）是最常见且最严重的食源性病原体之一，常与乳制品、肉类和新鲜农产品相关的疫情有关[3]、[4]、[5]、[6]。因此，快速可靠地检测食品中的E. coli对于防止大规模污染事件和确保消费者安全至关重要。

传统的微生物学和分子生物学方法，如培养基检测、聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），虽然准确性高，但存在实际操作上的局限性[7]、[8]。这些技术通常需要大量人力，操作人员需具备专业知识，并且可能需要数小时甚至数天才能得到结果[9]、[10]。这些限制阻碍了及时决策，使其不适用于食品行业的实时或现场监测。因此，迫切需要开发快速、灵敏、经济高效的检测方法，能够在不进行复杂样品处理的情况下直接检测出病原菌。

生化传感器作为一种有前景的分析工具，能够实现生物目标的快速、无标记、低成本检测[11]、[12]。然而，其性能严重依赖于与目标分析物发生特异性相互作用的生物识别元件[13]。传统的识别元件（如抗体、核酸和酶）虽然具有优异的选择性，但在环境条件下往往不稳定，生产成本较高，且重复使用次数有限[14]、[15]。相比之下，噬菌体（感染细菌的病毒）是一种高度特异性、稳定性强且能够自我复制的生物工具[16]、[17]。噬菌体能够以极高的精度识别宿主细菌，甚至能区分密切相关的菌株，使其成为病原体检测的理想选择[18]、[19]、[20]、[21]。基于噬菌体的生化传感器由于仅能感染活的、有活力的细菌细胞，因此假阳性风险较低[22]。

尽管有这些优势，基于噬菌体的生化传感器的实际应用仍面临技术挑战，尤其是噬菌体在电极表面的固定问题[23]、[24]。噬菌体在电极表面随机或低密度附着会限制细菌结合位点的可用性，降低捕获效率[25]、[26]、[27]。确保噬菌体尾部纤维可被宿主识别对其灵敏度至关重要[24]、[28]、[29]。因此，促进噬菌体在电极表面高密度、有序固定的策略对于充分发挥其诊断潜力至关重要。

电化学转导是一种非常有吸引力的生物传感方法，因其高灵敏度、简单性和与微型系统的兼容性[30]、[31]、[32]。在许多无标记的基于电化学的细菌传感器中，分析信号并非基于细菌本身的电活性，而是基于溶解在样品中的外部氧化还原探针与电极表面之间的电子转移变化。当目标细菌与固定在电极上的受体结合时，会形成一层部分绝缘层，阻碍氧化还原探针的接近，从而减慢界面电子转移速度。这种现象通常表现为循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）中的峰值电流下降，或者通过电化学阻抗谱（EIS）测得的电荷转移电阻（Rct）增加。尽管EIS具有高灵敏度，但其重复性会受到电极表面性质或外部噪声的微小变化的影响[33]、[34]。相比之下，DPV具有较高的信噪比（相对于CV），并且在灵敏度、重复性和操作稳定性之间取得了最佳平衡，使其成为细菌检测的首选方法[35]、[36]、[37]。电极材料的选择也很重要。贵金属有利于电子与氧化还原探针之间的快速传递，纳米复合材料虽然可以提供额外的表面功能，但会显著增加制造成本和复杂性[38]。覆有氧化铟锡（ITO）的玻璃片是一种低成本、透明且易于改性的材料，可以用于与噬菌体等生物材料结合，而不影响电化学性能[39]、[40]。

在这项研究中，我们在化学改性的ITO电极上开发了一种基于噬菌体的电化学传感器，利用DPV方法快速检测E. coli。选择裂解型T4噬菌体作为实验用噬菌体，因为它具有稳定的结构和对E. coli BL21的高特异性。此外，T4噬菌体具有永久性的偶极矩，头部带负电，尾部纤维带正电，这使得在表面修饰过程中可以通过电场辅助实现定向。因此，我们采用电场辅助沉积技术，使噬菌体形成密集的、头部朝下、尾部朝上的排列方式，从而增加细菌与噬菌体结合的概率。捕获细菌后，结合的细菌会阻碍外部氧化还原探针与电极的接触，导致DPV峰值电流变化增大。此外，通过循环系统输送样品有助于提高物质传输到传感表面的效率，从而缩短检测时间和减少样品体积。本研究的新颖之处在于将噬菌体在ITO表面的定向固定与DPV检测相结合，实现了在缓冲液和牛奶中的快速、灵敏检测。该策略也可很容易地应用于其他具有尾部的噬菌体，以检测其他细菌种类。

内容片段

材料与方法

材料、化学试剂、细菌和噬菌体的制备过程、噬菌体沉积细节、使用X射线光电子能谱（XPS）对电极进行表征、使用扫描电子显微镜（SEM）对电极进行表征、生化传感器的特异性、传感器的稳定性以及本研究中使用的分析物循环系统等内容详见补充材料。

结果与讨论

在本研究中，我们开发了一种基于噬菌体的电化学传感策略，可适用于不同类型的细菌。该策略利用了带尾噬菌体的一个固有特性——永久性的偶极矩和各向异性电荷分布[41]、[42]，使它们对外加电场产生响应[43]。通过电场在电极表面定向噬菌体，我们希望增加可结合位点的数量，从而提高检测灵敏度。

结论

我们开发了一种基于噬菌体的电化学传感器，用于检测E. coli BL21菌株，采用固定在化学改性的ITO电极上的T4噬菌体。电场辅助的固定技术使噬菌体定向排列，使得信号强度比未定向的噬菌体层提高3倍，比无噬菌体电极提高10倍（在10^4 CFU/mL浓度下）。DPV测量结果证实了传感界面的逐步形成过程。

CRediT作者贡献声明

扬·帕切斯尼（Jan Paczesny）：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金争取、数据分析、概念构思。马尔钦·奥帕尔沃（Marcin Opa??o）：撰写、审稿与编辑、概念构思。科斯蒂安廷·尼基福罗夫（Kostiantyn Nikiforow）：实验研究、数据分析。卡西亚里娜·鲁德科（Kaciaryna Rudko）：实验研究。康拉德·吉津斯基（Konrad Gi?yński）：软件开发、实验研究、数据分析。乔安娜·多林斯卡（Joanna Dolinska）：撰写、审稿与编辑、项目监督、软件开发、方法设计、实验研究、数据分析、概念构思。恩赫林·奥奇尔巴特（Enkhlin Ochirbat）：撰写、审稿

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在研究过程中，作者使用了ChatGPT 5.2版本来改善语法和语言表达。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的修订，并对出版物的内容负全部责任。

资助

本项目由波兰国家科学中心（National Science Centre）资助，项目编号为PRELUDIUM BIS 2020/39/O/ST5/01017。为了实现开放获取，作者对所有提交的接受稿件采用了CC-BY公共版权许可。KG的工作得到了JTC 2022 Water4All Partnership（WATER4ALL/I/20/STARDUST/2024）项目的支持。

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。