窝大小对胎盘立体形态特征的影响及其与犬新生儿结局的关系

《Theriogenology》：Influence of litter size on placental stereological characteristics and its relationship with neonatal outcome in dogs

　　卡米拉·因凡托西·范努基（Camila Infantosi Vannucchi）|莱蒂西亚·斯卡隆·迪亚斯·多斯·桑托斯（Letícia Scalon Dias dos Santos）|帕特里夏·蒙特罗·马凯蒂（Patricia Monteiro Marchetti）
巴西圣保罗大学兽医学院和动物科学系动物繁殖学系

**摘要**
尽管胎盘结构向子宫内膜层的发展受到有效组织重塑的驱动，但在多胎物种中，其在子宫表面的扩展是有限的。本研究旨在评估窝产仔数对胎盘形态特征以及新生儿期幼犬临床结局和身体发育的影响。将母犬及其幼犬分为两组：
- **大窝组**（n=8只母犬，n=16只幼犬；窝产仔数超过相应品种的参考值）
- **小/正常窝组**（n=7只母犬，n=12只幼犬）

收集胎盘并对其进行组织学和立体学处理，以计数不同结构。出生时、出生后5-10分钟及60分钟时，对幼犬的活力评分、脉搏血氧饱和度及乳酸血症进行检测，并在出生后10天和14天进行体格测量。组织学分析显示，大窝组胎盘的层状区域钙化程度较高（P=0.02），腺体区域出血也更为明显（P=0.05），而小/正常窝组的这些现象较轻。无论在哪个评估时间点，大窝组的幼犬活力评分和肌肉张力较低，同时出生时及出生后5-10分钟的呼吸频率和烦躁反应也较低。尽管新生儿第15天的体格测量有显著增长，但两组幼犬之间的差异不大。

**结论**
大窝组的胎盘具有与小/正常窝组不同的特征，但这并未影响新生儿期的进一步发育。尽管大窝组的着床点较多，但在胎盘结构上存在明显的形态学适应性改变，以增加母胎间的物质交换，从而保障胎儿的正常发育。

**1. 引言**
在犬类的带状胎盘和下皮绒毛膜胎盘中，只有内皮细胞将母体血液与胎儿组织分隔开，绒毛膜绒毛以带状且侵入性排列的方式聚集，这主要是由于合胞滋养层细胞的作用[1],[2]。滋养层在受精后约2周开始与子宫内膜紧密接触，导致子宫上皮破坏并发生上皮-间充质转化，这是蜕膜形成的关键过程[3]。

胎盘结构向子宫内膜层的发展受生长因子、组织重塑及细胞外基质金属蛋白酶的作用影响，但滋养层的扩展主要局限于子宫表面。例如，在单胎人类中，双绒毛膜双胞胎妊娠常伴随围产期并发症，如出生体重不一致和宫内生长受限（IUGR）。低出生体重的婴儿常伴有胎盘组织学异常，如选择性影响一个胎儿的子宫胎盘功能障碍[4]。此外，双绒毛膜胎盘组织的不同着床位置可能影响子宫血管化的功能完整性，这取决于滋养层侵袭因子的差异[5]。这些研究表明，胎盘着床位置及其在子宫层中的适当扩展对胎儿发育所需的营养和氧气供应至关重要。Sarli等人[6]发现大窝组的胎盘/幼犬重量比较低，但毛细血管密度较高，这可能抵消了某些不良影响。尽管已有研究探讨胎盘对犬胎儿发育的影响[6],[7],[8],[9],[10],[11]，但目前尚缺乏系统性的研究来阐明窝产仔数如何影响新生儿结局。

胎盘功能不全（如子宫胎盘血流减少和IUGR婴儿的出生）与人类围产期不良后果相关，会导致胎儿-新生儿发病率和死亡率升高[12],[13]。胎盘功能障碍会影响出生体重低的新生儿的后期发育，因为其心肺系统、通气稳定性和外周组织灌注的适应机制不成熟[14]。在犬类中，出生体重不仅影响新生儿健康，还影响其行为特征——大品种的幼犬通常比小品种更活跃、更具探索性[15]。但由于犬类品种的多样性以及胎儿生长率和体重的差异（大品种幼犬的出生体重相对较低[16]，因此准确诊断胎盘功能不全较为困难。因此，宫内生长受限可能由多种因素共同导致，而不仅仅是胎盘效率的问题。窝产仔数和品种大小可能影响幼犬的出生体重和体重增长，其中窝产仔数直接受母犬体型、年龄和产次的影响[17]。因此，需要开发针对不同母犬体型范围的妊娠评估模型，以及考虑子宫容纳胎儿数量的能力。Tesi等人[9]指出，胎盘重量、转移区面积和总血管面积等宏观指标会影响幼犬的出生体重。然而，胎盘坏死、钙化、血栓形成和充血区域的微观观察与新生儿结局无关[18]。通过评估新生儿出生后一小时的主要生命体征（活力评分、肺部听诊、血液气体分析、乳酸血症和外周氧合情况），可以识别主要的新生儿风险因素，从而改善存活率[19]。

本研究假设，在多胎犬中，窝产仔数会影响胎盘形态和新生儿结局，导致新生儿早期的临床和身体表现存在差异。因此，本研究旨在评估窝产仔数对胎盘形态特征以及出生后两周内新生儿临床结局和身体发育的影响。

**2. 材料与方法**
本研究遵循圣保罗大学兽医学院和动物科学学院生物伦理委员会的指导原则（协议号6414140819）。

**2.1 动物与实验组**
本研究共纳入15只2至5岁的不同品种的母犬（表1）。这些母犬首次或多次分娩，已接种疫苗并驱虫，无妊娠疾病史。所有母犬均接受了择期剖宫产（排除紧急剖宫产情况）。排除表现出短头阻塞性气道综合征（如呼吸困难、打鼾、频繁张口呼吸和间歇性发绀）及妊娠并发症的母犬。

**表1. 实验组母犬信息**
| 品种 | 体重（kg） | 产次 | 每胎平均幼犬数 | 平均窝产仔数* |
|-------------|---------|---------|-----------|------------|
| 拉布拉多寻回犬 | 41.1 | 多胎 | 8 | 6.9±0.2 |
| 英国斗牛犬 | 34.6 | 多胎 | 8 | 5.4±0.4 |
| 波美拉尼亚犬 | 11 | 多胎 | 8 | 2.4±0.1 |
| 斯塔福德郡斗牛梗 | 23 | 多胎 | 7 | 5.6±0.2 |
| 法国斗牛犬 | 9.9 | 初产 | 6 | 4.7±0.6 |
| 法国斗牛犬 | 12.5 | 初产 | 6 | 5.2±3.1** |
| 美国斗牛犬 | 21.8 | 初产 | 9 | 5.2±3.1** |
| 斯塔福德郡斗牛梗 | 29 | 多胎 | 10 | |
| 小/正常窝组 | 45.5 | 多胎 | 5 | 6.9±0.2 |
| 纽芬兰犬 | 60 | 多胎 | 6 | 6.5±0.4 |
| 英国斗牛犬 | 19.5 | 多胎 | 6 | 5.4±0.4 |
| 英国斗牛犬 | 24 | 初产 | 2 | |
| 斯塔福德郡斗牛梗 | 17.2 | 初产 | 6 | 5.6±0.2 |
| 斯塔福德郡斗牛梗 | 22.6 | 多胎 | 1 | |

每只母犬最多产下2只幼犬（1只位于子宫右侧角，1只位于左侧角），共28只幼犬。排除胎粪染色和先天性畸形的幼犬。根据窝产仔数，将母犬分为两组：
- **大窝组**（n=8只母犬，16个胎盘-幼犬单位；窝产仔数超过相应品种的参考平均值和标准误差）
- **小/正常窝组**（n=7只母犬，12个胎盘-幼犬单位；窝产仔数符合相应品种的参考平均值和标准误差）

**2.2 统计分析**
使用SAS Power and Sample Size（PSS）软件（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）进行功效分析，选取了新生儿呼吸率、层状区域钙化程度和腺体区域出血程度等变量。功效测试结果分别为0.86、0.97和0.83，表明统计功效高于0.80，确保实验结果具有科学价值。为确定最佳手术干预时间，监测了分娩启动或准备阶段的指标（如血清孕酮浓度下降<2 ng/dL、体温下降和分娩准备迹象）。所有母犬均接受标准化麻醉方案：术前给予肌注曲马多（2–4 mg/kg），随后静脉注射丙泊酚（5–7.5 mg/kg），腰椎硬膜外麻醉（吗啡0.1 mg/kg+利多卡因4 mg/kg），维持麻醉使用0.8%异氟烷。术后镇痛使用二吡酮（25–30 mg/kg）和曲马多（2–4 mg/kg）。

通过腹部切开术进入子宫，进行子宫切开和胎儿取出。手动破膜后清洁口鼻部，并夹住脐带。新生儿由新生儿科团队即时护理和评估。母犬恢复麻醉后，让幼犬与母犬团聚以促进母子识别和初乳摄入。

**胎盘评估**
收集每个子宫角最前端位置的胎盘（n=28个）。去除羊水和绒毛尿囊膜后，用数字分析天平称量胎盘重量，用30厘米尺测量面积、宽度和长度。主观评估胎盘的整体外观和颜色（特别是母体面和胎儿面）、边缘血肿及带状结构（图1A和B）。

**胎盘体积测量**
根据阿基米德原理，通过将胎盘浸入含0.9%生理盐水的量筒（100 mL）中测量总体积（Vtotal, cm3）。评估胎儿体重对胎盘质量的影响时，将胎盘重量（g）表示为新生儿出生体重的百分比。计算胎盘比重（将胎盘重量除以总体积Vtotal, cm3）。胎盘组织固定后，首先在10%甲醛溶液中保存24小时，再转移到70%乙醇中24小时以备后续立体学和组织学处理。固定后的胎盘带状部分进行随机取样。使用醋酸纤维素网格切取2厘米厚的切片。根据胎盘大小可能需要额外取样。由于犬胎盘的各向异性，采用垂直切片方式保持组织方向。以母体面为水平面进行切片（图1D）。

**组织学分析**
对每个胎盘的9个切片进行全面组织学分析（n=252张），评估所有显微视野（100%）。重点观察边缘血肿和带状区域的细胞组成和形态变化（胎儿面和母体面，包括腺体区、交界区和层状区）。细胞组成和形态改变按0（无）、1（轻微）、2（中度）、3（重度）分级。为了最小化主观解释的差异，对于每个胎盘特征，所有的组织学切片都进行了同时分析，并且对实验组进行了盲法处理。命名遵循国际兽医组织学命名委员会的标准[22]。边缘血肿被评估了红细胞簇、红色血栓、炎症细胞、含铁血黄素和血红蛋白颗粒的存在。在腺体区，分析了坏死、出血、子宫内膜腺体（图2A）、疏松结缔组织、红细胞簇、纤维蛋白网、红色血栓、含铁血黄素、血红蛋白、巨型滋养层细胞、炎症细胞、钙化以及退化红细胞。在交界区，评估了类似的参数以及细胞碎片、棘细胞、合胞体结节和细胞变性。在层状区，评估了凝缩的合胞体滋养层细胞（图2B）、坏死、红细胞簇、棘细胞、裂细胞、中性粒细胞的边缘移动和渗出、混合血栓、纤维蛋白网、Zahn线、含铁血黄素、血红蛋白（图2C）、巨型滋养层细胞、炎症细胞、合胞体结节、细胞滋养层细胞肿胀和出血性渗出。下载：下载高分辨率图像（335KB）下载：下载全尺寸图像图2. – 犬胎盘迷宫区域的组织学分析。(A) 腺体区中的子宫内膜腺体（粗箭头）。(B) 层状区中的合胞体滋养层细胞（箭头）。(C) 层状区中的血红蛋白色素（黄色箭头）。对于胎盘的立体学评估，使用点计数方法[23]估算了边缘血肿区域、胎盘迷宫区域（如果存在的话）以及交界区域的体积分数（Vv，%）。组织学切片使用Olympus BX61VS?系统以低倍物镜（2倍）进行扫描，可以在一张图像中分析整个组织切片。使用Image J软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）生成点网格系统，每个点对应4平方毫米的面积，并将其叠加在垂直方向上的切片上。计算与每个胎盘区域（Ptregion）和整个胎盘（Ptplac）相交的点数之和，从而得出每个胎盘区域的体积分数（Vv，%）。随后，通过将每个区域的体积分数（Vv，%）乘以整个胎盘的体积（VTplac，cm3）来估算每个胎盘区域的总体积（VTregion，cm3）。为了更详细地分析胎盘迷宫区域，这是母体与胎儿之间最重要的交换发生的地方，随机选择了10张40倍放大的显微照片[24]。在每张显微照片上叠加一个包含490个点的网格，以估算滋养层、无细胞层、钙化（图3A）、胎盘血管（图3B和C）、炎症区域（图3D）、血肿、坏死、血红蛋白和含铁血黄素颗粒的体积贡献。通过将每个结构（∑Ptstruct）与与胎盘迷宫（∑Ptlab）相交的点数之和除以，计算每个结构的体积分数（VVstruct），然后通过将体积分数（VVstruct）乘以迷宫的总体积（VTlab）来确定每个结构的总体积（VTstruct）。下载：下载高分辨率图像（851KB）下载：下载全尺寸图像图3. 胎盘迷宫的立体学分析（40倍）。(A) 钙化区域（黑色箭头）。(B) 母体（*）和胎儿（★）胎盘血管。(C) 拱与胎儿和母体血管以及母体-胎儿表面的交点。(D) 炎症区域（粗箭头）。为了估算母体-胎儿接触的表面积，计算了胎盘迷宫的血管表面密度（SV）。在每张40倍放大的随机选择的10张显微照片上叠加了一个 cycloid 弧网格系统[25]，[26]。将 cycloid 弧与母体和胎儿血管内皮的交点（图3C）相加，并使用以下公式进行计算：；其中 ∑intersec 是 cycloid 弧与血管内皮之间的总交点数，lp 是 cycloid 弧的长度（图像比例尺为22.64 μm），∑Pt 是与迷宫相交的总点数。通过将表面密度（SV）乘以迷宫的总体积（VTlab）来确定绝对表面积（Ssurf，cm3）。使用滋养层体积（Vtro）和血管表面积（Ssurf）计算了血-绒毛膜屏障厚度（Ta）：考虑到母体和胎儿的毛细血管是圆柱形的，根据以下公式从总血管体积（VTvas）和血管表面积（Ssurf）估算每个胎盘的平均血管口径（Ctvas）：对于依赖于母狗体型的变量，如胎盘重量、胎盘尺寸和新生仔犬体重，根据Bailey等人的公式[27]进行了标准化计算：其中 BV 代表母体体积，W 是右肩胛-肱关节与左肩胛-肱关节之间的距离（cm），L 是从肩胛骨背缘到胸骨下纵隔在心脏轮廓水平处的距离（cm），C 是从肩胛-肱关节到同侧坐骨结节的距离（cm）。

新生儿评估
出生后立即对每只新生仔犬进行常规刺激，通过仔细吸引清理鼻腔或口部的羊水，并通过有力的胸部按摩刺激初次呼吸。根据它们的胎盘对新生仔犬进行存活能力分类（活体或死产），并基于各自的胎盘进行编号。在刺激的同时，使用Silva等人之前描述的方法[28]，在出生后、5-10分钟和60分钟时，通过体检和临床状况对新生仔犬进行评估。每只新生仔犬都进行了脉搏血氧饱和度、乳酸血症、体重增加和身体测量的评估。通过适用于小狗大小的Neonatal OxiMax N65?血氧仪，在大腿内侧的股动脉处测量了通过脉搏血氧饱和度评估的外周氧饱和度。评估在出生后1-2分钟、5-10分钟和60分钟进行。在出生后1至5分钟以及出生后6小时进行了乳酸血症（mmol/L）的测量。使用无菌24G针头和1 mL一次性注射器从颈静脉采集血液样本，并立即使用Accutrend? Lactate设备（罗氏诊断公司）进行分析。在出生后60分钟以及出生后的第10天和第14天对新生仔犬进行了生物测量，此时新生仔犬处于胸骨或侧卧位。使用卷尺进行了三次测量：肩峰高度（从肩胛间区域的最高点到手掌端）、身体长度（从肩峰到坐骨结节的尾部）和胸围（腋窝区域的胸腔外周）。通过在出生后60分钟以及出生后的第10天和第14天使用精密数字秤（SF-400 JFZ?）称重三次来确定新生仔犬的生长速率。

在评估多只新生仔犬的母狗时，临床评估的结果被认为是来自同一母狗的小狗们的算术平均值。

统计分析
数据使用SAS for Windows（SAS Institute Inc.，美国北卡罗来纳州卡里）进行分析。对于新生仔犬的临床评估，通过PROC MIXED程序评估了实验组的效果、评估时间以及这些因素之间的相互作用。如果没有观察到显著的相互作用，则通过合并所有时间点来分析组的效果；相反，通过组合所有组来比较时间点；否则，在考虑两种效果的情况下进行比较。如果这些假设中的任何一个不成立，则使用Guided Data Analysis工具评估残差正态性和同方差性。如果这些假设中的一个不成立，则对数据进行了转换。当转换不成功时，应用了非参数方差分析（NPAR1WAY）。
组间差异使用Student’s t检验（参数变量）或Wilcoxon检验（非参数变量：腺体区中的坏死强度、出血、红色血栓、血红蛋白颗粒、巨型滋养层细胞、钙化和退化红细胞；边缘血肿中的炎症细胞和血红蛋白；交界区中的坏死、红色血栓和含铁血黄素；层状区中的出血性渗出；以及钙化、血肿、炎症面积和坏死体积贡献）进行评估。基于时间的差异使用LSD检验进行比较。对于响应变量，考虑实验组为主要因素，合并所有时间点，进行了Pearson相关性分析。为了考虑到多重检验可能导致的第一类错误风险增加，我们对所有相关性分析应用了Bonferroni校正。这种调整确保了更严格的显著性阈值，即原始p值乘以同时比较的数量。只有保持校正后p值低于我们 alpha 水平（通常为0.05）的相关性才被视为统计学上显著，从而确保了报告关联的可靠性。
结果以未转换的平均值±标准误差（参数变量）和中位数（四分位数Q1 – Q3）（非参数变量）的形式表示。显著性水平为P ≤ 0.05。

3. 结果
在所有胎盘和新生仔犬变量中，只有新生仔犬反射性易激惹评分（P=0.04）观察到实验组（大体型窝vs. 小/正常体型窝）和评估时间点（出生、5-10分钟和60分钟）之间的显著相互作用（表1 – 附加材料）。

3.1. 胎盘评估
总体而言，胎盘在其全长上显示出裂隙，在切片前后均可见。迷宫区域的母体表面呈现海绵状外观，苔绿色，并且有些组织有脱屑现象。胎盘组织的主观组织学分析显示，大体型窝组的层状区钙化强度更高（P=0.02），被归类为中等程度钙化，而在小/正常体型窝组中，钙化程度较轻（图4A）。大体型窝组的腺体区出血强度更高（P=0.05），主观上被认为是中度，而在小/正常体型窝组中较轻微（图4B）。在边缘血肿、层状区、腺体区和交界区评估的其他组织学特征方面，实验组之间没有显著差异（表2 – 附加材料）。

3.2. 新生仔犬评估
与大体型窝组的小狗相比，出生后10分钟的存活能力评分倾向于较低（P=0.08），并且出生时的存活能力也低于预期（存活能力评分 > 7）。大体型窝组的存活能力在后期显著增加（图5A）。大体型窝组在出生时（P=0.08）和出生后10分钟（P=0.02）的呼吸率也显著低于小/正常体型窝组的小狗，尽管仍在新生仔犬的正常参考范围内（图5B）。大体型窝组的小狗在出生后10分钟的肌肉张力和易激惹评分也较低（P=0.04和P=0.005）（图6）。在不同评估时间点之间，各组之间没有其他显著差异（表2）。

图5. – 小/正常体型窝组和大体型窝组的新生儿临床评估。(A) 不同时间点新生儿存活能力评分（0-10）的平均值 ± 标准误差；(B) 整个实验期间呼吸频率（mpm）的平均值 ± 标准误差。a-b 同一组内不同时间点之间的统计差异（P≤0.05）；* 同一时间点内不同组之间的差异。

图6. – 不同时间点小/正常体型窝组和大体型窝组的新生儿临床评估。(A) 肌肉张力评分（0-2）的中位数（四分位数范围 – Q1 Q3）；(B) 易激惹反射评分（0-2）的中位数（四分位数范围 – Q1 Q3）。a-b 同一组内不同时间点之间的统计差异（P≤0.05）；* 同一时间点内不同组之间的差异。新生儿的各项指标（均值±标准误差[95%置信区间]和中位数（四分位距 – Q1 Q3）在小型/正常体型和大型胎盘中，无论评估时间点如何。临床评估如下：

| 评估时间点 | 小型/正常体型胎盘 | 大型胎盘 |
| ---------- | ------------ | --------- |
| 0分钟 | 198±5.94 | 198±7.98 |
| 10分钟 | 171±15.3 | 174±15.44 |
| 60分钟 | 184±19.7 | 203±6.14 |
| 心率（bpm） | [123 – 180] | [134 – 209] |
| 心脏评估得分（0-2） | 1.25（1 – 1.75） | 2.0（2.0 – 2.0） |
| 黏膜得分（0-2） | 1.0（0.75 – 1.5） | 1.2（1 – 1.5） |
| 呼吸评估得分（0-2） | 1.0（1.0 – 1.0） | 2.0（1.0 – 2.0） |
| 乳酸血症（mg/dL） | 4.67±0.65 | 4.46±0.89 |
| 体温（°C） | 33.77±0.38 | 33.77±0.46 |
| 血氧饱和度（%） | 81.4±4.21 | 84.4±3.45 |

注：表中带*的数值表示置信区间（CLM），不同上标表示统计差异（P=0.06，适用于出生后60分钟时两组之间的呼吸评估得分差异；a、b表示同一组内不同评估时间点之间的统计差异（P<0.05）。

表3. 新生儿各项生物指标的均值±标准误差及95%置信区间，无论评估时间点如何。

| 评估时间点 | 小型/正常体型胎盘 | 大型胎盘 |
| ---------- | ------------ | --------- |
| 肩高（cm） | 13.2 ± 0.96 | 12.25 ± 0.53 |
| 体长（cm） | 11 ± 0.47 | 10.49 ± 0.44 |
| 胸围（cm） | 18.8 ± 1.28 | 19.14 ± 0.87 |
| 体重（g/cm3） | 0.006 ± 0.0007 | 0.01 ± 0.002 |

大型胎盘的新生儿在出生后10分钟内氧饱和度显著增加，而小型/正常体型胎盘的新生儿则没有变化。此外，小型/正常体型胎盘的新生儿更早出现黏膜颜色变化。尽管在15天内新生儿各项生物指标有所增加，但实验组之间的比较未显示出显著差异。

3. 相关性分析：
- 新生儿体重与腺体出血强度呈正相关（r=0.75；P=0.04），与凝缩性合胞滋养层细胞强度呈负相关（r=-0.94；P=0.001）。
- 胎盘交界区的棘细胞强度与新生儿呼吸和黏膜评分呈负相关。
- 新生儿活力评分与胎盘交界区血素颗粒强度呈正相关，与变性红细胞强度呈负相关。
- 新生儿呼吸频率与胎盘血管体积、边缘血肿体积和胎盘总体积呈正相关。
- 胎盘滋养层体积与新生儿心率、呼吸频率和活力评分呈正相关。

表4和表5进一步详细列出了小型/正常体型胎盘组和大型胎盘组的相关性分析结果。

讨论：
本研究基于“犬类胎盘大小决定胎盘效率及新生儿健康状况”的假设，探讨了胎盘大小对新生儿早期阶段及出生后14天内生理发育的影响。比较正常体型和大型胎盘的胎盘结构，发现胎盘密度和总体积无显著差异，表明无论每个子宫内膜表面的着床点数量如何，胎盘尺寸都保持一致。在非融合盘双绒毛膜妊娠中，胎儿与胎盘的重量比（每克胎盘支撑的胎儿重量）与单胎妊娠中的观察结果相似。母体组织的血管生成对于建立维持胎儿发育的母胎交换界面至关重要。细胞滋养层和合胞滋养层细胞以及母体上皮细胞和内皮细胞中高度表达血管生成和血管生成相关因子，这些因子能激活胎盘血管中的一氧化氮，从而导致血管扩张。因此，我们可以推断犬类胎盘的局部血管和基质重塑机制会根据子宫内膜表面积的不同而有所不同，大型胎盘中这种机制更为活跃，以维持良好的母胎交换。大型胎盘的胎盘血管体积与新生儿血氧饱和度显著相关，这可能有利于新生儿氧合。事实上，大型胎盘的胎盘腺体区出血更为严重，这是由于滋养层侵袭导致子宫内膜深层逐渐扩展所致。胎盘血管化程度的增加可能促进新生儿氧合。此外，大型胎盘的胎盘钙化程度较高，可能与胎盘功能相关。

综上所述，大型胎盘的胎盘结构变化和血管重塑可能有利于新生儿健康，尽管其出血程度较高，但钙化现象也表明胎盘间质区域发生了变化。钙化灶的存在可能是胎儿宫内生长受限的重要原因之一。人类双胎妊娠中的胎盘钙化与胎儿出生异常无关，这表明钙化可能与胎盘功能受损无直接关联。此外，人类双胎妊娠中的胎盘钙化并不总是导致器官功能障碍的标志。研究表明，胎盘钙化与新生儿呼吸频率和心率呈正相关，可能与胎盘成熟过程有关，而非组织损伤的表现。尽管大型胎盘的胎盘发生了显著变化，但其新生儿适应能力并未降低。在皇后犬这种多胎物种中，幼崽出生体重与窝仔数量之间存在反比关系，这为具有内涵膜绒毛膜胎盘的物种提出了“子宫拥挤理论”[37]。通过分析出生后前14天的身体发育情况，我们旨在观察大型窝仔中新生儿在胎儿-新生儿过渡期间的任何持久性影响。然而，在大型或小型/正常窝仔中，幼崽的体重（按母体体积标准化）和生物测量指标没有差异。另一方面，Schrank等人[16]报告称，大型窝仔的出生体重较低，出生后前两周的发育速度也较慢。虽然这些作者将其发现归因于母体和品种因素，但我们精确地考虑了新生儿的身体长度、胸围和肩高，以尽量减少不同犬种之间的身体结构差异，而不仅仅是幼崽的体重。然而根据我们的相关性分析，在小型/正常窝仔中，新生儿体重与腺体出血呈中度正相关，同时新生儿肩高与胎盘连接区的红细胞聚集强度也呈强正相关。因此，我们可以推测，在没有子宫拥挤的情况下，存在一种高效的胎儿血液供应机制来影响子宫内生长。此外，在大型窝仔中，新生儿体重与层状区内凋亡的合胞滋养层细胞和巨型滋养层细胞的强度呈负相关，这进一步支持了我们的观点，即当子宫内膜最终缺乏足够的胎盘交换面积时，胎盘会通过增加侵袭性来发挥补偿作用。与Tesi等人[9]对玩具犬品种胎盘的研究结果类似，较高的血管化可能是整体较小胎盘的潜在补偿机制。

这项研究存在几个潜在的局限性。由于其观察性性质，只能从研究中建立关联关系。此外，研究样本量相对较小，且没有包括更多不同品种的母犬，因此无法考虑犬种间的差异。因此，应对我们的新生儿发育数据持谨慎态度，因为本研究中的母犬存在与品种相关的结构差异，这些差异需要考虑在内。尽管我们通过定义胎儿在子宫内的位置来实现了实验标准化，但仍需考虑窝内个体间的差异，尤其是胎盘特征可能因着床位置的不同而有所差异。尽管目前的数据无法对具体机制作出明确结论，但仍有一些推测，但这些推测需要通过未来的研究来验证。

总之，大型窝仔的胎盘与小型/正常窝仔的胎盘具有显著差异，但这并不影响新生儿在整个新生儿期的发育。尽管大型窝仔的着床位置较多，我们认为胎盘结构在血管和形态变化方面可以进行调节，以确保胎儿的正常发育和生长。

**作者贡献声明：**
Patricia Monteiro Marchetti：方法学、研究
Letícia Scalon Dias dos Santos：方法学、研究、数据分析、数据整理
Camila Infantosi Vannucchi：写作——审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源协调、项目管理、资金申请、数据分析、概念化

**伦理批准和参与同意：**
本研究遵循动物使用伦理委员会（CEUA）制定的动物使用标准进行，协议编号为6414140819，并在所有者签署知情同意书后实施。

**发表同意：**
不适用。

**数据和材料的可用性：**
本研究中使用和分析的数据集可应要求向相应作者索取。

**利益冲突声明：**
作者声明没有利益冲突。

**资助：**
本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP）的Grant 2021/02773-3项目资助。