《Theriogenology》：The potential role of the Sox9a protein in regulating cyp19a transcription and ovarian development in the olive flounder (Paralichthys olivaceus)
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常抒|刘建娟|邹宗聪|谭雄刚|邹旭霞|吴志豪|刘艳|吴巧婉|王玲|王国宇|李泽|冯友中国科学院海洋研究所育种生物技术与可持续水产养殖国家重点实验室，中国青岛266000摘要了解鱼类的性腺分化和发育对于基础生物学和水产养殖都至关重要。Sox9基因与鱼睾丸的确定及其后续发育有关。在硬
常抒|刘建娟|邹宗聪|谭雄刚|邹旭霞|吴志豪|刘艳|吴巧婉|王玲|王国宇|李泽|冯友
中国科学院海洋研究所育种生物技术与可持续水产养殖国家重点实验室，中国青岛266000
摘要
了解鱼类的性腺分化和发育对于基础生物学和水产养殖都至关重要。Sox9基因与鱼睾丸的确定及其后续发育有关。在硬骨鱼类中，基因组复制事件产生了两个sox9基因的共线同源物，即sox9a和sox9b。然而，它们在蛋白质水平上的确切作用仍缺乏直接证据。在这项研究中，我们从亚洲重要的海水养殖鱼类——橄榄鳎鱼Paralichthys olivaceus中获得了具有生物活性的重组Sox9a蛋白。表达分析显示，橄榄鳎鱼的Sox9a蛋白表现出性别二态性表达，其水平在睾丸的Sertoli细胞中较高，在卵巢卵母细胞中较低。体外实验表明，Sox9a抑制了cyp19a并上调了dmrt1，同时伴随着性激素水平的改变，包括17β-雌二醇（17β-E2）、睾酮（T）和11-酮睾酮（11-KT）。此外，细胞共转染实验显示，橄榄鳎鱼的Sox9a能够抑制Nr5a2介导的cyp19a转录，并与Dmrt1和Amh协同作用增强这种抑制作用。随后对雌性鱼类进行重组Sox9a蛋白的腹腔注射，降低了雌性偏向基因cyp19a、foxl2和nr5a2的表达，同时上调了雄性偏向基因dmrt1以及HPG轴调节基因arβ。组织学分析显示，接受该蛋白处理的鱼类中有12.5%（1/8）出现了卵巢发育异常。这些结果提供了新的证据，表明Sox9a可能在鱼类中作为cyp19a的转录抑制因子发挥作用。这种调节可能与性激素的产生变化有关，并可能影响卵巢的发育。
引言
性别决定和性腺发育的复杂机制长期以来一直受到发育生物学家的关注[1]。性腺的发育由性别决定过程启动[2]。鱼类的性别决定机制表现出极大的多样性，涉及遗传、内分泌和环境因素的复杂相互作用，这些因素以显著的可塑性调节性腺分化[3],[4]。一旦具有双潜能的性腺原基决定成为睾丸或卵巢，性别分化通过特定的基因网络和调控途径进行，以确保性腺的正常形成、发育和维持[2]。
sox（SRY相关HMG框）基因家族是一组进化上保守的转录调节因子，在鱼类性腺分化和发育中起着核心作用[5]。在这个家族中，sox9是哺乳动物软骨形成和睾丸决定的关键转录因子基因[6],[7]，而其抑制作用对卵巢发育至关重要[1]。在全基因组复制事件之后，鱼类的sox9基因演化出了两个同源物sox9a和sox9b。这些同源物在不同鱼类物种中发挥不同的功能，反映了它们的功能特化[8]。已经证明sox9a在鱼类性别决定和性腺分化中起重要作用[9]。在斑马鱼Danio rerio中，sox9a主要在发育中的和成熟的睾丸中表达，促进睾丸分化[8]。Sox9a激活amh同时抑制cyp19a及其上游的转录因子基因，包括foxl2和nr5a2。这导致卵巢凋亡并促进Sertoli细胞分化，从而产生雄性偏向的性别比例[10]。在尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus中，sox9a在早期发育阶段在卵巢和睾丸中都有表达。通过CRISPR/Cas9介导的同源突变破坏sox9a功能会导致生殖细胞数量显著减少，证实了其在生殖细胞增殖中的关键作用[11]。在半光滑舌鳎Cynoglossus semilaevis中，sox9a在睾丸、大脑和垂体中富集，表明其参与下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的更广泛调节[12]。综上所述，这些研究突显了sox9a的功能特化，并强调了进一步研究其物种特异性功能及其在鱼类性腺分化中的调节机制的紧迫性。
Sox9a作为转录因子的功能作用在蛋白质水平上最为清晰，为我们提供了关于其在性表型形成和维持中的直接见解。多项研究通过分析性腺表达模式和评估初步功能来研究Sox9a的转录作用。例如，在俄罗斯鲟Acipenser gueldenstaedtii中，Sox9a蛋白在发育过程中的精原细胞和卵母细胞胞质中被发现，随后在成熟睾丸的细胞核中重新定位[13]。在HEK293T细胞中的免疫沉淀研究表明，斑马鱼的Sox9a与雄激素受体（Ar）相互作用[14]。然而，尽管有这些发现，Sox9a在硬骨鱼类性腺发育中的蛋白质水平上的调控机制仍然知之甚少。特别是，Sox9a作为转录调节因子控制关键靶基因（如cyp19a
橄榄鳎鱼Paralichthys olivaceus是一种重要的海水养殖鱼类，其生长具有性别二态性，雌性更占优势，是研究性别调节的宝贵模型。与其他鱼类一样，橄榄鳎鱼也有两个sox9同源物sox9a和sox9b[15]，其中sox9a在睾丸中的含量显著高于卵巢[16]。原位杂交（ISH）分析显示sox9a位于卵母细胞、Sertoli细胞和精细胞中[15]。然而，与其他鱼类一样，蛋白质水平上的功能研究仍然有限，Sox9a蛋白在橄榄鳎鱼中发挥转录调控作用的具体方式仍不清楚。在这项研究中，我们在体外制备了具有生物活性的重组橄榄鳎鱼Sox9a蛋白。使用Western blot（WB）和免疫组化（IHC）分析了蛋白质表达谱。通过细胞转染实验评估了Sox9a对cyp19a表达的影响。此外，还通过腹腔（IP）注射重组Sox9a蛋白研究了其在卵巢发育中的作用。这些结果将为橄榄鳎鱼性腺发育中Sox9a的功能作用提供重要见解，并为进一步研究其调控机制奠定基础。
章节摘录
实验鱼类
处理了三只雌鱼和三只雄鱼（体重358.5–562.5克）用于蛋白质表达模式分析，以及四只雌鱼和三只雄鱼（体重258.5–724.0克）用于组织培养。所有鱼的处理、采样、储存和固定均按照我们之前研究中描述的相同程序进行[17]。
从中国日照的灵岳水产基地购买了60只雌性橄榄鳎鱼（体重74.0–144.5克），用于重组蛋白的腹腔注射。
橄榄鳎鱼Sox9a蛋白的生物信息学分析
橄榄鳎鱼的sox9a开放阅读框（ORF）长度为1437 bp，编码478个氨基酸的蛋白质。在预测的橄榄鳎鱼Sox9a蛋白中发现了Sox蛋白家族特有的保守HMG结构域（图1A）。该蛋白还包含一个Pfam结构域和三个低复杂性区域（LCRs）（图1B）。基于Myripristis murdjan的Sox9a模板，使用SWISS-MODEL数据库预测了其三级结构（图1C）。
讨论
硬骨鱼类性发育的调控是发育生物学和水产养殖研究的核心，尤其是对于那些具有性别二态性特征的物种。橄榄鳎鱼是一种重要的水产养殖物种，具有XX/XY性别决定系统，其生长具有性别二态性，这使得全雌性种群在经济上具有优势[25]。因此，阐明调控该物种性腺分化和发育的分子途径具有重要意义。
CRediT作者贡献声明
王玲：资源、方法学、实验研究。吴巧婉：资源、方法学、实验研究。王国宇：资源、方法学、实验研究。邹旭霞：资源、方法学、实验研究。谭雄刚：资源、方法学、实验研究。刘艳：资源、方法学、实验研究。吴志豪：资源、方法学、实验研究。冯友：写作——审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学、资金获取，
数据可用性声明
本研究中生成和/或分析的数据集可应要求从通讯作者处获取。
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32373112、42376094和31772834）、山东省自然科学基金（编号ZR2022MC026）、中国国家重点研发计划（编号2022YFD2400402）、威海渔业技术创新计划（编号whyykj2025-01）以及国家海洋遗传资源中心的支持。
