烟酰胺单核苷酸（NMN）通过增强雌激素信号传导、重新调节卵巢代谢、减轻氧化应激以及抑制斑点鱼（Scatophagus argus）体内的细胞凋亡，改善了与卵子质量相关的卵巢微环境

《Theriogenology》：Nicotinamide mononucleotide (NMN) improves the ovarian microenvironment associated with oocyte quality by increasing estrogen signaling, reprogramming ovarian metabolism, reducing oxidative stress, and inhibiting apoptosis in the spotted scat (Scatophagus argus).

　　

罗杰|王斯勤|林兴华|王拓|李金莉|江东能|吴天利|邓思平

广东海洋大学渔业学院，湛江524088，中国

摘要

烟酰胺单核苷酸（NMN）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺的前体，已被证明可以改善哺乳动物的卵子质量。健康的卵巢微环境对卵子质量和硬骨鱼类的繁殖成功至关重要。为了研究NMN对斑点雀鲷（Scatophagus argus）卵子质量相关的卵巢微环境参数的影响，我们分析了腹腔（IP）注射NMN后血清葡萄糖、胰岛素、总胆固醇、甘油三酯、17β-雌二醇（E₂）和卵巢NAD⁺的水平。此外还使用RNA测序进行了卵巢转录组分析。通过qRT-PCR分析了NMN补充后与类固醇生成、凋亡和氧化应激相关的基因表达。在体外实验中，测量了NMN孵育后卵泡中的ATP含量、谷胱甘肽（GSH）水平、活性氧（ROS）积累和线粒体膜电位（ΔΨm）。结果表明，NMN注射显著增加了卵巢NAD⁺水平和血清E₂浓度。NMN改善了葡萄糖和脂质代谢，这体现在胰岛素水平升高以及血清葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯水平降低。KEGG富集分析显示，与代谢、应激反应和凋亡相关的通路显著富集。qRT-PCR显示类固醇生成相关基因（cyp17a1, hsd3b1, 20β-hsd, cyp19a1a, mmp2和foxl2）、抗氧化基因（gpx1a, gpx1b和slc7a11）以及抗凋亡基因bcl2表达上调，而促凋亡基因（bax和caspase3表达下调。NMN孵育减少了ROS积累并增加了GSH水平，同时增强了线粒体功能，表现为ΔΨm和ATP生成增加。总体而言，这些结果表明NMN通过提高NAD⁺的可用性来改善斑点雀鲷的卵巢微环境，从而促进雌激素信号传导、重新编程卵巢代谢、减轻氧化应激并抑制凋亡。

引言

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是细胞代谢和能量稳态所需的核心氧化还原辅因子。它作为NAD⁺依赖性酶的底物，参与线粒体生物能量转换、DNA修复和应激反应[1]、[2]、[3]。越来越多的证据表明，NAD⁺的生物合成对于维持这些细胞过程以及支持正常的繁殖功能至关重要[4]、[5]、[6]。对小鼠和斑马鱼（Danio rerio）的研究表明，较高的NAD⁺水平可以增强线粒体氧化磷酸化，减少活性氧（ROS）积累，抑制凋亡信号传导，并增加雌二醇（E₂）的产生，从而维持卵子的发育能力[7]、[8]、[9]。此外，NAD⁺补充在辅助生殖技术中显示出潜在的应用前景[10]。这些发现表明，卵子的发育和成熟依赖于能量代谢、氧化还原稳态和细胞完整性的协调调节。

烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD⁺生物合成的直接前体，这一过程由烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）催化[9]。研究表明，NMN对细胞能量代谢和氧化还原稳态至关重要[11]。在人类和啮齿动物模型（包括小鼠和大鼠）中的先前研究将NMN补充与代谢和氧化参数的变化联系起来[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。例如，在小鼠中，NMN通过降低促炎细胞因子和ROS的水平来减少环境毒素引起的氧化应激。过多的ROS会损害细胞成分，包括脂质、蛋白质和DNA，从而损害繁殖功能并降低整体生理健康[17]。

线粒体为卵子成熟提供必要的能量。然而，过多的ROS产生会损害卵子的发育能力[17]。在细胞水平上，有研究表明，NMN通过NAD⁺依赖的调节网络影响卵巢功能，这些网络控制着卵子发育过程中的线粒体活性、氧化应激反应和凋亡信号传导途径[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[18]。NMN给药还可以改善卵子质量，提高生育能力，并延缓小鼠的卵巢衰老[19]、[20]、[21]。在斑马鱼中，氧化应激是卵泡发育、受精能力和整体繁殖性能的关键因素[22]、[23]。NMN补充还被证明可以显著增加产卵频率、卵巢性腺体指数（GSI）和卵子成熟度[8]。因此，据认为NMN通过调节NAD⁺依赖的代谢途径来调控与卵子发育相关的线粒体和氧化还原过程，从而有助于维持最佳的卵巢微环境[8]、[24]。然而，NMN在调节硬骨鱼类与卵子发育相关的卵巢微环境中的作用及其背后的NAD⁺依赖性调节机制仍不清楚。

斑点雀鲷（Scatophagus argus）是中国南部沿海地区池塘和网箱养殖中的经济重要物种[25]。由于其高营养价值、丰富的蛋白质含量和良好的口感而受到消费者青睐[26]。该物种的性腺发育不同步，雄性睾丸成熟先于雌性卵巢成熟[27]。由于NAD⁺代谢在调节细胞和繁殖过程中的关键作用，本研究探讨了NMN对斑点雀鲷卵子质量相关的卵巢微环境参数的影响。通过腹腔（IP）注射NMN后，测量了血清中的葡萄糖、胰岛素、总胆固醇、甘油三酯和17β-雌二醇（E₂浓度以及卵巢NAD⁺水平。还使用RNA测序（RNA-seq）分析了卵巢转录组。在体外实验中，测量了NMN孵育后卵泡中的ATP含量、谷胱甘肽（GSH）水平、ROS积累和线粒体膜电位（ΔΨm）。我们假设NMN给药会增加卵巢NAD⁺的可用性，进而改善线粒体活性和细胞能量代谢，通过调节ROS和抗氧化系统来减轻氧化应激，并调节凋亡信号传导途径。这些效果有望改善卵巢微环境，最终支持卵子功能和发育能力。了解NMN如何改善与卵子质量相关的卵巢微环境机制可以为硬骨鱼的繁殖管理策略提供新的见解。

部分摘要

实验动物和伦理

用于IP NMN注射的成年雌性斑点雀鲷（体重：350.0-450.0克，体长：19.0-24.0厘米）来自中国广东省湛江市雷州区的一个养殖场。在广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地进行了适应训练。另一组用于NMN孵育的成年雌性斑点雀鲷（体重：450.0-550.0克，体长：23.0-28.0厘米）是从养殖市场购买的

血清E₂和NAD⁺水平

NMN250组和NMN500组的血清E₂（图1）和卵巢NAD⁺（图2）水平显著增加。

血清葡萄糖、胰岛素、总胆固醇和甘油三酯水平

NMN250组和NMN500组的血清葡萄糖（图3A）、总胆固醇（图3B）和甘油三酯（图3C）水平显著下降，而胰岛素水平显著上升（图3D）。

测序、质量和DEGs

从六个转录组文库中生成了共计40,693,542,000个原始读段。经过质量过滤后，获得了39,820,963,568个有效读段。

讨论

在卵巢发育和成熟过程中，卵泡发生、闭锁和凋亡等关键过程需要大量的能量[31]。作为NAD⁺的关键前体，NMN已被证明是多种模式生物中潜在的繁殖功能调节剂[8]、[19]、[32]。在本研究中，我们证明了腹腔注射NMN可以显著增加斑点雀鲷的卵巢NAD⁺水平，改善葡萄糖和

结论

总之，我们的研究表明，NMN通过三种关键机制改善了斑点雀鲷的卵巢微环境，从而提高了卵子质量。首先，NMN增加了NAD⁺的生物合成和雌激素信号传导，促进了卵泡发育并创造了有利于卵子成熟的条件。其次，NMN通过增强葡萄糖和脂质利用途径以及改善细胞能量产生来重新编程NAD⁺依赖的代谢。第三，NMN激活了

CRediT作者贡献声明

李金莉：正式数据分析、数据管理。江东能：验证、资金获取。王拓：正式数据分析、数据管理。罗杰：初稿撰写、验证、方法学设计、研究实施、数据管理、概念构思。王斯勤：正式数据分析、数据管理。林兴华：正式数据分析、数据管理。吴天利：研究实施、资金获取。邓思平：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、概念构思

利益冲突声明

所有作者均无需要声明的利益冲突。

利益冲突声明

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致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：31972775）、广东海洋大学的科学研究启动基金（060302022311）以及广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515012880）的支持。