N-乙酰血清素通过调节Nrf2和TLR4/NF-κB/iNOS的表达，发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，从而保护肾脏免受缺血-再灌注损伤

《Tissue and Cell》：N-Acetylserotonin protects against renal ischemia-reperfusion injury by exhibiting antioxidant, anti-inflammatory and antiapoptotic effects through regulation of Nrf2 and TLR4/NF-κB/iNOS expression

　　

?MER KIRGIZ|F?L?Z KAZAK AK?AKAVAK|FATMA CEREN KIRGIZ|?BRAH?M ALAKU?|?ZHAN KARATA?|HAL?L ALAKU?|?SHAK G?K?EK|Z?YA YURTAL|EREN CEYLAN|G?KHAN AK?AKAVAK

哈塔伊穆斯塔法·凯末尔大学，兽医学院，外科系

摘要

背景

肾缺血-再灌注（RIR）损伤是急性肾损伤的主要原因之一，氧化应激、炎症和细胞凋亡等不同过程在其发病机制中起着重要作用。N-乙酰血清素（NAS）作为血清素和褪黑素合成途径中的中间代谢物，其对RIR损伤的潜在影响目前尚不清楚。

方法：

28只雄性Wistar白化大鼠被随机分为4组（每组7只）。假手术组仅进行剖腹术。NS组在剖腹术前45分钟接受20 mg/kg NAS腹腔注射（i.p.）。I/R组未经任何药物处理，通过夹闭肾动脉45分钟引发缺血/再灌注损伤，随后进行24小时再灌注。NI/R组在缺血/再灌注损伤前45分钟接受20 mg/kg NAS腹腔注射，肾动脉同样被夹闭45分钟，之后再灌注24小时。研究检测了氧化应激参数、组织病理学和免疫组织化学变化。

结果：

与I/R组相比，NAS预处理显著降低了丙二醛（MDA）水平（P<0.01），并恢复了抗氧化参数，包括谷胱甘肽（GSH）水平、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶-1（GPx1）的活性（P<0.01）。NI/R组的组织病理学损伤评分（肾小管变性、坏死、炎症浸润和透明管型）明显低于I/R组（P<0.001）。此外，免疫组织化学分析显示NAS预处理抑制了Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和caspase-3的表达，并增加了核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）的表达（P<0.001）。

结论：

所有结果表明，NAS通过表现出抗氧化、抗凋亡和抗炎特性，是保护肾脏组织免受RIR损伤的有效物质。

引言

肾缺血-再灌注（RIR）是指在血流减少或停止一段时间后血液重新流入肾脏的过程。这主要会对肾细胞造成极端压力，最终可能导致严重的组织损伤（Asgharpour等人，2020年）。这种情况通常发生在肾脏移植、肾脏急性损伤、肾动脉阻塞和半肾切除等外科手术中（Shan等人，2021年；Mohamed等人，2022年）。在缺血期间，血液流动的丧失会迅速导致氧气和三磷酸腺苷水平下降、离子平衡紊乱、钙积累以及细胞内部稳定性的整体破坏。线粒体在这个阶段特别容易受损，当其功能丧失时，一旦血流恢复，组织会更加容易受到损伤（Cruthirds等人，2003年；Xu等人，2016年）。再灌注对于组织恢复正常功能和维持生命是必要的，但在再灌注阶段，由于活性氧（ROS）的突然产生和显著的炎症反应，组织会受到更多损伤（Mohamed等人，2022年；Embaby等人，2023年）。这一事件还会破坏细胞组织的完整性并导致坏死（Shan等人，2021年）。RIR在临床上也非常重要。它是急性肾损伤的主要诱因，尤其是在与移植物功能延迟、移植失败和发病率增加相关的肾脏移植中（Korkmaz等人，2009年）。再灌注阶段引起的细胞压力会迅速导致肾功能受损，从而增加治疗成本和死亡风险（Mohamed等人，2022年）。因此，更清楚地了解RIR的机制并制定针对氧化应激、炎症和细胞死亡的新治疗策略是当前研究的重点。

N-乙酰血清素（NAS）是褪黑素合成途径中的中间代谢物，位于血清素转化为褪黑素的步骤之间，长期以来一直被认为仅是一种生物合成前体（Luo等人，2019年）。然而，最近的研究表明，NAS除了通过褪黑素通路发挥作用外，还具有独立的生物活性（Yang等人，2023年）。作为一种强效抗氧化剂，它可以直接清除自由基，减少脂质过氧化，并通过降低总体细胞氧化应激来保护细胞（álvarez-Diduk等人，2015年；Gavazza和Català，2004年）。这些特性表明NAS具有比褪黑素更强的氧化还原能力和更持久的保护作用（Luo等人，2019年）。NAS还有助于保持线粒体健康，支持线粒体膜稳定性，抑制细胞色素c的释放，并阻断caspase-3的激活。因此，它可能通过内在和外在的凋亡途径阻止细胞死亡（Zhou等人，2014年；Kang等人，2023a；Kang等人，2023b）。

NAS通过抑制某些关键的细胞死亡途径来维持组织的存活能力，并已在缺血-再灌注（I/R）模型中展示了其效果。由于其广泛的保护作用，NAS在减少神经元I/R损伤、创伤性脑损伤、缺氧-缺血性脑病、自身免疫性脑脊髓炎和多发性硬化症组织损伤方面具有潜力（Tosini等人，2012年；Luo等人，2021年；Yang等人，2023年；Cheng等人，2023年）。NAS还被发现可以减轻炎症、降低氧化应激，并保护肝脏和肠道I/R模型中的器官功能（Yu等人，2013年；Ben Shahar等人，2016年）。Sukhotnik等人（2019年）报告称，NAS通过抑制大鼠肠道I/R损伤中的Toll样受体4（TLR4）和髓系分化初级反应88（Myd88）的表达提供保护。Kang等人（2020年）报告称，在大鼠结肠炎研究中，直肠给予NAS可引起核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）的氧化，从而改善结肠炎。另一项研究中，Liu等人（2021年）报告称，NAS通过下调视网膜I/R损伤中的TLR4/核因子κB（NF-κB）/NOD样受体蛋白3（NLRP3）通路来减弱炎症反应。

尽管在脑、肠道、肝脏和视网膜I/R模型中观察到了NAS的保护作用，但其对RIR的影响尚未进行系统研究（Yu等人，2013年；Yoo等人，2017年；Sukhotnik等人，2019年；Zhao等人，2024年）。具体来说，先前的研究没有探讨NAS对肾组织中Nrf2抗氧化信号通路和TLR4/NF-κB/iNOS炎症通路的同时变化的影响。因此，我们的研究旨在探讨NAS是否通过在实验性RIR模型中多靶点调节氧化应激、炎症和细胞凋亡来发挥肾保护作用。

章节摘录

伦理批准

该研究方案已获得哈塔伊穆斯塔法·凯末尔大学当地动物实验伦理委员会的批准，批准号为2024/09-03。实验按照土耳其关于用于实验和其他科学目的的动物福利和保护的法律以及欧盟2010/63号指令关于用于科学目的的动物保护的规定进行。研究按照ARRIVE标准进行了设计和报告。

统计分析

所得数据使用SPSS 25（美国芝加哥）软件进行分析。正态性通过Shapiro-Wilk检验进行检验；方差齐性通过Levene检验确定。符合正态分布的生化数据通过ANOVA和Duncan事后检验进行评估。数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。非参数组织病理学和免疫组织化学数据使用Kruskal-Wallis检验进行分析。

生化结果

I/R组的MDA水平相对于SHAM组显著升高（P<0.01）。然而，NI/R组的MDA水平相对于I/R组显著降低（P<0.01）（图1）。I/R组的GSH、CAT和GPx1值相对于SHAM组显著降低（P<0.01）。相比之下，NI/R组的GSH、CAT和GPx1值相对于I/R组显著升高（P<0.01）。SHAM组和NS组之间的GSH、CAT没有显著差异。

讨论

本研究评估了NAS在RIR损伤中可能发挥的保护作用，结果显示RIR损伤组的大鼠肾脏组织完整性、氧化状态和相关炎症蛋白质水平受到负面影响。结果表明组织完整性受损，GSH水平、CAT和GPx1酶活性降低，MDA水平升高；Nrf2蛋白表达减少，其他蛋白质表达增加。

结论

NAS在RIR损伤中表现出多种有益机制，如抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。它保护肾脏免受结构损伤，通过改善组织病理学损伤、增强抗氧化防御（GSH、CAT、GPx1）、减少脂质过氧化（MDA）、抑制caspase-3介导的凋亡以及阻断TLR4/NF-κB/iNOS信号通路来减轻RIR损伤。Nrf2水平的升高表明

限制与未来展望

本研究存在几个局限性。首先，仅纳入了雄性大鼠，未评估潜在的性别差异。其次，仅研究了单剂量的NAS（20 mg/kg），未评估剂量-反应关系。第三，未评估经典肾功能标志物（如血清肌酐、BUN、NGAL和KIM1）和长期肾功能结果。第四，NAS仅作为初步治疗策略使用，其治疗效果尚未明确。

未引用参考文献

(Heemskerk等人，2009)

资金

该项目未获得任何财务支持。

CRediT作者贡献声明

Z?YA YURTAL：监督、方法学。EREN CEYLAN：监督、方法学。G?KHAN AK?AKAVAK：撰写 – 原初草案、可视化、验证、监督、软件、数据管理、概念化。?BRAH?M ALAKU?：监督、方法学、研究。?ZHAN KARATA?：可视化、验证、软件、形式分析。HAL?L ALAKU?：监督、方法学、研究。?SHAK G?K?EK：验证、监督、软件、数据管理、概念化。?MER KIRGIZ：撰写 –

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢Songül ?AH?N（兽医学生）在实验工作中的协助。

利益冲突

作者声明本研究是在没有任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。