抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性孕妇胎盘中外皮生长因子（VEGF）、血小板生长因子（PlGF）及其受体的差异表达

《Tissue and Cell》：Differential expression of VEGF, PlGF and their receptors in placentas from anti-Ro/SSA- and anti-La/SSB-positive pregnant women

　　米尔科·马内蒂（Mirko Manetti）、艾琳·罗莎（Irene Rosa）、米哈埃拉·米库（Mihaela Micu）、埃莱奥诺拉·斯甘巴蒂（Eleonora Sgambati）
佛罗伦萨大学实验与临床医学系，解剖学与组织学系，影像平台

**摘要**
血管内皮生长因子（VEGF）家族成员及其受体，包括VEGF-A、胎盘生长因子（PlGF）、VEFR-1和VEGF-2及其共受体神经丝蛋白-1（NRP-1），在胎盘的正常发育和形态功能特征的维持中起着关键作用，同时也参与了妊娠期间特有的免疫耐受机制。确实，VEGF家族成员及其受体的表达异常与多种妊娠并发症中的胎盘发育不良和免疫耐受失调有关，尤其是在妊娠期高血压疾病中。值得注意的是，患有不同自身免疫性疾病并检测出抗Ro/SSA和抗La/SSB抗体的女性，其妊娠环境也存在免疫失调的情况。这些女性发生不良妊娠的风险较高，而胎盘功能障碍似乎在其中起到了决定性作用。因此，本研究旨在通过免疫组化方法，探讨抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性自身免疫性疾病患者的胎盘中VEGF、PlGF、VEFR-1、VEGF-2和NRP-1的表达和定位情况。我们的研究结果表明，与对照组相比，所有自身免疫性疾病患者的胎盘成分中VEGF家族成员及其受体的表达均有所下降，其中PlGF和VEGF-2的下降更为明显。总体而言，我们的发现表明，VEGF家族成员及其受体在胎盘中的表达异常可能与抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性妊娠的病理生理特征有关。

**1. 引言**
胎盘是一个仅在妊娠期间出现的临时性器官，位于母体与胎儿之间，通过营养和废物的交换为胎儿提供发育所需的代谢支持（Abu-Ghazaleh等人，2023年；Huang等人，2021年）。为了实现这一功能，胎盘通过血管生成（即血管网络的形成和重塑）维持自身的血液循环和代谢。血管生成过程的不同阶段——启动、增殖-侵袭、成熟-分化——对于胎盘的正常发育以及胚胎的成功着床都至关重要（Abu-Ghazaleh等人，2023年；Rana等人，2022年）。在此背景下，还需要考虑妊娠期间建立的特有免疫环境。尽管妊娠是一种自然的生理现象，但胎儿的存在对母体的免疫耐受构成了挑战。在健康的妊娠中，母体系统必须适应半同种的胎儿，同时防止其被母体免疫系统排斥（Albonici等人，2020年；Qu等人，2020年；Zielińska和Darmochwa?-Kolarz，2025年）。在正常情况下，促炎反应和抗炎反应之间的平衡支持着滋养层的侵袭和胎盘的发育。妊娠早期，炎症与免疫耐受之间的正确平衡有助于子宫内膜组织的重塑和血管生成，从而促进胚胎的正确着床。除了这种特殊微环境的建立外，滋养层还能够像侵袭性肿瘤一样侵入周围的母体组织。随后，会激活一个免疫抑制阶段，以防止过度炎症并避免胎儿的免疫介导排斥（Albonici等人，2020年；Qu等人，2020年；Torres-Torres等人，2024年）。复杂的胎盘形成过程及其所处的独特免疫环境，由多种可溶性分子维持，如细胞因子、趋化因子、激素和生长因子（Albonici等人，2020年；Bolatai等人，2022年；Castellanos Gutierrez等人，2022年；Cyprian等人，2019年；Kametas等人，2022年；Laakkonen等人，2019年；Modzelewski等人，2023年；Naidoo等人，2022年；Ruyani和Sumarsono，2023年；Velegrakis等人，2023年）。此外，胎盘拥有自己的免疫系统，并产生具有多种功能的生物活性成分，包括免疫调节作用（Seymen，2021年；Ye等人，2023年）。

众多参与妊娠各阶段过程的介质包括血管内皮生长因子（VEGF）家族成员及其受体。特别是VEGF-A（通常简称为VEGF）、胎盘生长因子（PlGF）、VEFR-1/Flt-1和VEGF-2/Flk-1/KDR及其共受体神经丝蛋白-1（NRP-1），在子宫血管的重塑、血管生成、滋养层的侵袭、增殖和分化以及妊娠期间免疫耐受的调节和维持中发挥着关键作用（Albonici等人，2020年；Bolatai等人，2022年；Kametas等人，2022年；Laakkonen等人，2019年；Modzelewski等人，2023年；Naidoo等人，2022年；Ruyani和Sumarsono，2023年；Velegrakis等人，2023年）。众所周知，这些生长因子及其受体的表达异常及其相互作用失衡与多种妊娠并发症中的胎盘发育不良和免疫耐受失调有关，尤其是在妊娠期高血压疾病中（Abu-Ghazaleh等人，2023年；Albonici等人，2020年；Bolatai等人，2022年；Chau等人，2017年；Chen和Zheng，2014年；Kametas等人，2022年；Karumanchi，2016年；Liu等人，2021年；Marini等人，2007年；Marini等人，2008年；Modzelewski等人，2023年；Naidoo等人，2022年；Qu等人，2020年；Rana等人，2022年；Sgambati等人，2004年；Torres-Torres等人，2024年；Velegrakis等人，2023年；Zielińska和Darmochwa?-Kolarz，2025年）。据我们所知，关于自身免疫性疾病妊娠中胎盘VEGF家族成员表达的研究较少（Ibba-Manneschi等人，2010年）。值得注意的是，自身免疫性疾病妊娠的特点是免疫环境的失调，这可能影响胚胎着床、胎盘功能和胎儿发育（Castellanos Gutierrez等人，2022年；Castellanos Gutierrez等人，2023年；Manolis等人，2020年；Ye等人，2023年）。循环中的自身抗体的存在是自身免疫性疾病（ADs）的标志。事实上，血清自身抗体的检测在ADs的诊断和分类中起着核心作用，许多这些抗体在临床表现出现前几年就可以检测到（Fayyaz等人，2016年；Shen等人，2017年）。此外，越来越多的证据表明，自身抗体也可能在不同ADs的病理生理机制中起关键作用，通过介导全身炎症和组织损伤（Shen等人，2017年）。特别是针对自身抗原Ro/SSA和La/SSB的抗核抗体是ADs中最常见的自身抗体（Fayyaz等人，2016年）。抗Ro/SSA和抗La/SSB抗体系统可存在于多种ADs中，主要包括干燥综合征（SjD，以前称为Sj?gren’s syndrome，Tsironis等人，2026年）、系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿关节炎（RA）（Fernández-Buhigas，2022年；Nagliya等人，2024年），这些都是涉及多个器官或系统的慢性炎症性疾病（Fernández-Buhigas，2022年；Longhino等人，2023年；Nagliya等人，2024年；Siegel和Samaritano，2024年；Stefanski等人，2017年；Yang等人，2023年）。SjD可以单独存在（即原发性SjD），也可以与其他ADs共存，最常见的是与RA或SLE共存（Fernández-Buhigas等人，2022年；Nagliya等人，2024年；Stefanski等人，2017年）。患有ADs的孕妇发生不良妊娠结局的风险较高，如先兆子痫、流产、死产、早产、低出生体重和小于胎龄儿（Dao和Bermas，2022年；Grygiel-Górniak等人，2023年；Nagliya等人，2024年；Singh等人，2023年；Tarter和Bermas，2024年）。此外，由于自身抗体通过胎盘传递给胎儿，患有ADs的母亲所生的婴儿有时会患上多种并发症，如先天性新生儿红斑狼疮和完全性心脏阻滞（Dao和Bermas，2022年；De Carolis等人，2020年；Evers等人，2019年；Fernández-Buhigas，2022年；Madhusudan等人，2016年；Manolis等人，2020年；Nagliya等人，2024年；Shao等人，2024年；Takahashi等人，2020年）。值得注意的是，约50%的母亲携带这些自身抗体但无症状，其中近一半最终会发展成某种ADs（Fayyaz等人，2016年；Liszewska和Wo?niacka，2022年）。因此，由于胎盘在调节母体-胎儿相互作用中的关键作用，胎盘功能障碍可能导致不良妊娠结局（Castellanos Gutierrez等人，2022年；Castellanos Gutierrez等人，2023年）。

基于这些前提，我们首次采用免疫组化方法，对诊断为原发性SjD或伴有RA和/或SLE的SjD的抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性女性的胎盘中VEGF、PlGF、VEFR-1、VEGF-2和NRP-1的表达进行了初步的形态学研究。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究对象**
研究对象为在罗马尼亚克卢日-纳波卡市康复临床医院风湿科招募的六名抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性的孕妇。其中三名患者患有原发性SjD（病例1、2和3），一名患者SjD伴有SLE（病例4），一名患者SjD伴有RA（病例5），还有一名患者SjD同时伴有RA和SLE（病例6）。所有患者都在疾病活动度较低的状态下进行监测和妊娠计划，并接受了符合2023年指南的治疗方案（Flint等人，2016年；Russell等人，2023年）。在整个妊娠期间，五名患者每天服用400毫克羟氯喹（其中三名患者同时服用低剂量皮质类固醇），一名患者每天服用2000毫克柳氮磺胺吡啶。妊娠前及妊娠前12周内，所有患者每天服用5毫克叶酸。妊娠前3个月、妊娠中期和后期以及产后3个月内均安排了随访。每次随访时都进行了临床检查并收集了实验室数据。作为高风险妊娠的ADs患者，这些孕妇每月需到妇产科就诊一次。分娩时，母亲的年龄在26至37岁之间，妊娠周数在38至42周之间。共有五例单胎妊娠和一例双胎妊娠（即病例6），其中三例为自然分娩，三例为剖宫产（包括病例6的双胎妊娠）。所有七名足月婴儿均无病理异常。根据患者的请求，胎盘样本从分娩所在的妇产科所属的病理解剖学部门获取。此外，还从三名健康无并发症的妊娠中获取了胎盘样本作为对照组，这些对照组在母亲年龄和妊娠周数上与病例相匹配（妊娠周数在38至41周之间）。对照组患者均未患有已知的或怀疑的ADs和/或结缔组织疾病。对照组胎盘样本的获取得到了机构审查委员会的批准（方案编号0005381/I，Perna等人，2023年）。所有参与研究的女性均提供了书面知情同意书。病例的母婴临床详细信息见表1。

**表1. 母亲和新生儿的临床详细信息**

| 母亲年龄（岁） | 32 | 29 | 35 | 29 | 26 | 31 | 31 | 37 |
| 妊娠周数（周） | 38 | 40 | 41 | 38 | 40 | 39 | 41 | 42 |
| 分娩方式 | 自然分娩 | +++ | ?? | ++? | ?? | ++? | +? | ++? |
| AD类型 | 原发性SjD | ?? | ?? | +++ | ?? | ?? | ?? | ?? |
| SjD + RA | ?? | ?? | ?? | ?? | ?? | ?? | +? |
| SjD + SLE | ?? | ?? | ?? | ?? | ?? | +? | ?? |
| 抗Ro/SSA | ?? | +++ | ?? | ++? | ++? | +++ |
| 抗La/SSB | ?? | +++ | ++? | ++? | ++? | +++ |
| 唾液腺超声检查（提示SjD的异常） | ?? | +++ | ++? | +++ | ++? | ++? |
| 1分钟Apgar评分 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| 5分钟Apgar评分 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 9 |
| 出生体重（克） | 3340 | 3360 | 3530 | 2940 | 3450 | 2850 | 3670 | 370 |
| 24小时Apgar评分 | 0 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 5 |
| BMI | 21 | 22 | 24 | 25 | 21 | 22 | 22 | 25 |

**2.2. 胎盘组织收集**
分娩时，采用随机采样方法从每个胎盘获取10块全层组织标本（面积=1平方厘米）。胎盘样本在10%中性缓冲福尔马林溶液中固定12小时，然后按标准方法制成石蜡块；切片厚度为5微米。

**2.3. 免疫组化**
免疫组化按照先前发表的协议进行（Rosa等人，2018年；Rosa等人，2023年）。组织切片（厚度5微米）经脱蜡处理后，在柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH 6.0；Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国）中加热修复抗原，随后在3%过氧化氢溶液中室温下处理15分钟以灭活内源性过氧化物酶。组织切片接着用Ultra V封闭剂阻断非特异性抗体结合位点（目录编号...）。将样本在室温下与TA-125-UB（来自Lab Vision，Fremont, CA, USA）孵育10分钟，随后在4°C下过夜孵育，使用针对VEGF的一抗（小鼠抗VEGF-A，目录号555036，BD Pharmingen，San Diego, CA, USA；稀释比为1:50）、PlGF（兔子抗PlGF，目录号ab9542，Abcam，Cambridge, UK；稀释比为1:50）、VEGFR-1（兔子抗VEGFR-1，目录号bs-0170R，Bioss，Woburn, MA, USA；稀释比为1:200）、VEGFR-2（兔子抗VEGFR-2，目录号ab39638，Abcam；稀释比为1:200）和NRP-1（兔子抗NRP-1，目录号ab81321，Abcam；稀释比为1:100）。阴性对照是通过将连续切片与同型及浓度匹配的无关IgG（Sigma-Aldrich）过夜孵育来进行的。通过依次将生物素化的二抗（目录号TP-125-BN；Lab Vision）和链霉亲和素过氧化物酶试剂（目录号TS-125-HR；Lab Vision）应用于组织切片各10分钟（在室温下），然后用3-氨基-9-乙基咔唑显色溶液（目录号TA-125-SA；Lab Vision）来显现抗原-抗体复合物。用Mayer’s hematoxylin（Bio-Optica，Milan, Italy）进行复染后，将组织切片 mounted 在VectaMount AQ水性封片介质（目录号H-5501；Vector Laboratories，Burlingame, CA, USA）中，并在配备Leica DFC310 140万像素数字彩色相机和LAS V3.8软件（Leica Microsystems，Mannheim, Germany）的Leica DM4000 B显微镜下观察。

2.4. 免疫组化染色的评估
对于每个对照和AD胎盘组织切片（每个样本5个切片），检查10个随机600625 μm2的光学正方形区域（40倍物镜），并评价其免疫阳性位置。染色强度以+++、++、+、±和?表示强、中、弱、非常弱和阴性。检查了中间和末端绒毛的滋养层、血管和基质细胞。这种半定量评分系统之前已被用于并验证用于评估胎盘组织的免疫组化染色（Marini等人，2011；Perna等人，2023；Sgambati等人，2007）。切片由两名独立研究者（M.M.和E.S.）盲法检查和评分。切片被编码，以便两位检查者不知道实验组别。如果研究者之间存在分歧，则由两位研究者重新审查样本并解决分歧。

3. 结果
3.1. 免疫组化发现
用无关IgG作为阴性对照孵育的胎盘组织切片无反应，这证实了免疫组化结果的特异性（图1A,B, 2A,B, 3A,B, 4A,B, 和 5A,B）。

图1. 对照胎盘和携带抗Ro/SSA及抗La/SSB自身抗体的自身免疫疾病（AD）孕妇胎盘组织中的血管内皮生长因子（VEGF）免疫染色。用无关IgG作为阴性对照孵育的胎盘切片的代表性显微照片（A, B）。对照样本（C, D）、AD病例1（E, F）、AD病例2（G, H）、AD病例3（I, J）、AD病例4（K, L）、AD病例5（M, N）和AD病例6（O, P）的胎盘组织代表性显微照片。（A, B）所有胎盘成分均未见免疫反应。（C, D）在对照胎盘中，滋养层和血管显示强烈的VEGF免疫染色，而基质细胞则中等程度染色。（E-J）在AD病例1、2和3中，胎盘滋养层和血管显示弱免疫染色，基质细胞显示非常弱的免疫染色。在AD病例4、5和6中，滋养层显示中等程度的VEGF免疫染色（K-P）。在AD病例4（K, L）中，血管中等程度免疫反应；在AD病例5（M, N）中，血管从中等到弱或非常弱；在AD病例6（O, P）中，血管染色弱。在AD病例4（K, L）中，基质细胞未见VEGF免疫染色，而在AD病例5和6中，基质细胞显示弱染色。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

图2. 对照胎盘和携带抗Ro/SSA及抗La/SSB自身抗体的自身免疫疾病（AD）孕妇胎盘组织中的胎盘生长因子（PlGF）免疫染色。用无关IgG作为阴性对照孵育的胎盘切片的代表性显微照片（A, B）。对照样本（C, D）、AD病例1（E, F）、AD病例2（G, H）、AD病例3（I, J）、AD病例4（K, L）、AD病例5（M, N）和AD病例6（O, P）的胎盘组织代表性显微照片。（A, B）所有胎盘成分均未见免疫染色。（C, D）在对照胎盘中，滋养层和血管显示强烈的PlGF免疫反应，而基质细胞染色弱。在AD病例4（K, L）中，胎盘滋养层显示中等程度的PlGF免疫染色；在AD病例1、2、5和6（E-H, M-P）中，染色弱；在AD病例3（I, J）中，染色非常弱。在所有胎盘血管中，AD病例4（K, L）中的血管免疫反应中等；在AD病例5（M, N）中，从中等到弱或非常弱；在AD病例6（O, P）中，血管染色弱。在AD病例4（K, L）中，基质细胞未见VEGF免疫染色，而在AD病例5和6中，基质细胞显示弱染色。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

图3. 对照胎盘和携带抗Ro/SSA及抗La/SSB自身抗体的自身免疫疾病（AD）孕妇胎盘组织中的血管内皮生长因子受体（VEGFR-1）免疫染色。用无关IgG作为阴性对照孵育的胎盘切片的代表性显微照片（A, B）。对照样本（C, D）、AD病例1（E, F）、AD病例2（G, H）、AD病例3（I, J）、AD病例4（K, L）、AD病例5（M, N）和AD病例6（O, P）的胎盘组织代表性显微照片。（A, B）所有胎盘成分均未见免疫染色。（C, D）在对照胎盘中，滋养层显示强烈的VEGFR-1免疫染色，而血管和基质细胞染色中等。在AD病例1（E, F）中，胎盘滋养层显示中等程度的VEGFR-1免疫染色；在AD病例2和3（G-J）中，染色非常弱；在AD病例4、5和6（K-P）中，染色非常弱。在AD病例1和4（E, F）中，胎盘血管染色弱；在AD病例5和6（M-P）中，血管染色弱。在AD病例2、3和5中，一些血管显示弱免疫染色，而大多数血管则无染色（G-J, M, N）。在AD病例6中，一些血管中等程度染色，而其他血管显示弱或非常弱的染色（O, P）。在AD病例1、2和3中，绒毛基质细胞未见PlGF免疫染色；而在AD病例4、5和6中，细胞染色非常弱（K-P）。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

图4. 对照胎盘和携带抗Ro/SSA及抗La/SSB自身抗体的自身免疫疾病（AD）孕妇胎盘组织中的血管内皮生长因子受体（VEGFR-2）免疫染色。用无关IgG作为阴性对照孵育的胎盘切片的代表性显微照片（A, B）。对照样本（C, D）、AD病例1（E, F）、AD病例2（G, H）、AD病例3（I, J）、AD病例4（K, L）、AD病例5（M, N）和AD病例6（O, P）的胎盘组织代表性显微照片。（A, B）所有胎盘成分均未见免疫染色。（C, D）在对照胎盘中，滋养层和血管显示强烈的VEGFR-2免疫反应，而基质细胞染色弱。在AD病例4（K, L）中，胎盘滋养层显示中等程度的PlGF免疫染色；在AD病例1、2、5和6（E-H, M-P）中，染色弱；在AD病例3（I, J）中，染色非常弱。在所有AD病例中，胎盘血管的PlGF免疫染色弱。在AD病例1（E, F）中，血管染色弱；在AD病例4（K, L）中，染色中等。在AD病例2、3和5中，一些血管显示弱免疫染色，而大多数血管无染色（G-J, M, N）。在AD病例6中，一些血管中等程度染色，而其他血管显示弱或非常弱的染色（O, P）。在AD病例1、2和3中，绒毛基质细胞未见PlGF免疫染色；而在AD病例4、5和6中，细胞染色非常弱（K-P）。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

图5. 对照胎盘和携带抗Ro/SSA及抗La/SSB自身抗体的自身免疫疾病（AD）孕妇胎盘组织中的神经纤毛蛋白-1（NRP-1）免疫染色。用无关IgG作为阴性对照孵育的胎盘切片的代表性显微照片（A, B）。对照样本（C, D）、AD病例1（E, F）、AD病例2（G, H）、AD病例3（I, J）、AD病例4（K, L）、AD病例5（M, N）和AD病例6（O, P）的胎盘组织代表性显微照片。（A, B）所有胎盘成分均未见免疫染色。（C, D）在对照胎盘中，滋养层显示强烈的NRP-1免疫染色，而血管染色中等。在一些对照胎盘基质细胞中检测到弱NRP-1免疫染色，而其他显示细长胞质延伸的基质细胞则强烈反应（C, D，D中的插图）。在AD病例1、2和5中，滋养层显示弱NRP-1免疫染色；而在AD病例3、4和6中，染色中等（I-L, O, P）。在所有AD病例中，胎盘血管的NRP-1染色非常弱。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

3.2. VEGF免疫染色
在对照样本的胎盘样本中，绒毛滋养层和血管显示强烈的VEGF免疫染色，而基质细胞染色中等（图1C,D）。AD病例1、2和3的胎盘样本中的滋养层和血管染色弱，基质细胞非常弱（图1E-J）。AD病例4、5和6的滋养层显示中等程度染色，而血管从中等到非常弱（图1K-P）。在AD病例4中，基质细胞无染色；在AD病例5和6中，基质细胞染色弱（图1K-P）。

3.3. PlGF免疫染色
对照胎盘样本的绒毛滋养层和血管显示强烈的PlGF免疫染色，而基质细胞染色弱（图2C,D）。在所有AD病例中，滋养层的PlGF免疫反应从中等到弱或非常弱（图2E-P）。在AD病例1、4和6的所有绒毛血管中观察到从中等到非常弱的PlGF免疫染色；在AD病例2、3和5的少数血管中也观察到类似的染色（图2E-P）。实际上，在AD病例2、3和5的多数血管中无免疫反应（图2G-J,M,N）。在AD病例1、2和3中，基质细胞无染色；而在AD病例4、5和6中，细胞染色非常弱（图2E-P）。

3.4. VEGFR-1免疫染色
对照样本的胎盘标本的滋养层显示强烈的VEGFR-1免疫染色，而绒毛血管和基质细胞染色中等（图3C,D）。在所有AD病例中，滋养层的VEGFR-1免疫染色从中等到弱（图3E-P）。在AD病例1和4（E, F）中，胎盘血管的VEGFR-1染色中等；在AD病例2和3（G-J）中，染色非常弱；在AD病例4、5和6（K-P）中，染色非常弱。在AD病例1和4（E, F, K, L）中，胎盘血管染色弱；在AD病例5和6（M-P）中，染色非常弱。在AD病例2和3（G-J）中，未见血管染色。在AD病例1、3、4、5和6（E, F, I-P）中，胎盘基质细胞的VEGFR-1染色非常弱；而在AD病例2（G, H）中，基质细胞无染色。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

3.5. VEGFR-2免疫染色
在对照胎盘样本中，绒毛滋养层和血管都显示强烈的VEGFR-2免疫染色，而基质细胞染色中等（图4C,D）。在所有AD病例中，滋养层的VEGFR-2免疫染色从中等到弱（图3E-P）。在AD病例1、2、3和4（E-L）中，胎盘血管的VEGFR-2染色中等；在AD病例5和6（M-P）中，染色弱。在AD病例2和3（G-J）中，血管的VEGFR-2染色非常弱。在所有AD病例中，基质细胞的VEGFR-2染色从弱到非常弱（E-P）。

3.6. NRP-1免疫染色
在对照胎盘样本中，滋养层显示强烈的NRP-1免疫染色，而血管染色中等（图5C,D）。在一些对照胎盘基质细胞中检测到弱NRP-1免疫染色，而显示细长胞质延伸的基质细胞则强烈反应（图5C,D）。在AD病例1、2和5中，滋养层显示弱NRP-1免疫染色；而在AD病例3、4和6（I-L, O, P）中，染色中等。在所有AD病例中，胎盘血管的NRP-1染色非常弱。刻度尺：100 μm（A, C, E, G, I, K, M, O）；50 μm（B, D, F, H, J, L, N, P）。

3.7.半定量分析

如表2所示，与对照组相比，在所有自身免疫性疾病（AD）病例中，所有VEGF家族成员及其受体在三个胎盘组成部分（即滋养层、血管和基质细胞）中的免疫染色强度均一致下降，其中PlGF和VEGFR-1的下降最为明显，尤其是在胎盘血管和基质细胞中。

表2. 对照组和携带抗Ro/SSA及抗La/SSB自身抗体的妊娠妇女的自身免疫性疾病患者的胎盘中的VEGF、PlGF、VEGFR-1、VEGFR-2及NRP-1免疫染色强度。

| 组别 | VEGF | PlGF | VEGFR-1 | VEGFR-2 | NRP-1 |
|------|------|------|------|------|
| 对照组 | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ |
| AD病例1 | ++ | ± | +++ | ± | +++ |
| AD病例2 | ++ | ++ | --- | +++ | +++ |
| AD病例3 | ++ | ± | + | ++ | +++ |
| AD病例4 | ++ | +++ | ++ | +++ | +++ |
| AD病例5 | ++ | ★ | + | +++ | +++ |
| AD病例6 | +++ | ★ | + | +++ | +++ |

AD：自身免疫性疾病；NRP-1：神经纤毛蛋白-1；PlGF：胎盘生长因子；TB：滋养层；VEGF：血管内皮生长因子；VEGFR：VEGF受体；?：无免疫染色；±：非常弱的免疫染色；+：弱的免疫染色；++：中等的免疫染色；+++：强的免疫染色；*：部分基质细胞；**：部分血管；§：部分血管。

半定量分析结果显示，控制组与每个AD病例中不同胎盘组织成分中VEGF、PlGF、VEGFR-1、VEGFR-2和NRP-1的免疫染色强度没有差异。而在AD病例6的双胎妊娠中，两个胎盘组织样本之间也没有差异。

4. 讨论

本研究首次调查了抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性妇女妊娠中VEGF和PlGF的生长因子、VEGFR-1和VEGFR-2受体以及共受体NRP-1的表达情况，这些妇女患有不同的自身免疫性疾病，包括原发性干燥综合征（SjD）或与类风湿关节炎（RA）和/或系统性红斑狼疮（SLE）相关的SjD。尽管存在一些变异性，我们的发现表明，与健康对照组胎盘相比，所有AD病例中VEGF家族成员及其受体在 Different胎盘成分（绒毛滋养层、血管和基质细胞）中的表达均发生了类似的变化。实际上，我们在AD病例中检测到VEGF、PlGF、VEGFR-1、VEGFR-2和共受体NRP-1的胎盘表达普遍下降。特别是PlGF和VEGFR-1在AD胎盘组织中的表达下降更为显著，尽管也存在一些差异。例如，PlGF在胎盘血管中的表达显著减少或完全缺乏，而VEGFR-1在所有AD病例的胎盘成分中的表达均较低。另一个有趣的发现是NRP-1在对照组胎盘中的一组具有细长胞质延伸的基质细胞中表达强烈，在所有AD病例中则显著下降。值得注意的是，无论AD类型如何，这些变化在胎盘组织中均能一致观察到，这表明它们可能与共同的自身免疫背景有关，即抗Ro/SSA和抗La/SSB自身抗体的存在。然而，患者接受的治疗可能对VEGF家族成员的胎盘表达产生潜在影响。例如，有六名患者接受了羟氯喹治疗，已知该药物具有免疫调节作用，理论上可能影响血管生成因子的表达，但目前尚缺乏关于胎盘VEGF家族成员的直接证据。同样，低剂量皮质类固醇和柳氮磺胺吡啶也可能干扰炎症和血管生成途径。由于本研究中的所有AD病例都正在接受治疗，因此无法区分自身免疫背景和药物治疗的效果。因此，未来需要包括未接受治疗的患者或按治疗方案分层的患者的研究来澄清这一方面。

蛋白质表达的观察到的变化可能导致各种VEGF家族成员之间的相互作用紊乱，从而影响胎盘的形态和功能。事实上，VEGF和PlGF与其受体的结合亲和力不同，这在生理条件下决定了它们之间的特殊相互作用。具体来说，VEGF与VEGFR-1的结合亲和力大于与VEGFR-2的结合亲和力，而PlGF仅与VEGFR-1高亲和力结合。值得注意的是，VEGFR-1是血管生成的弱促进因子，通过消耗VEGFR-2这种更强的血管生成促进因子，起到抗血管生成的作用。由于PlGF与VEGFR-1结合，它会竞争VEGFR-1的结合位点，从而增加VEGFR-2的VEGF可用性（Huang等人，2021年；Modzelewski等人，2023年）。此外，共受体NRP-1在增加VEGF和VEGFR-2的结合方面起着关键作用，可将其结合能力提高6倍（Naidoo等人，2022年；Ruyani和Sumarsono，2023年）。

众所周知，在胎盘形成过程中，VEGF和VEGFR对胎盘血管的形成和发展至关重要，这支持了它们在血管生成中的核心作用。在这种情况下，PlGF似乎与VEGF协同作用，共同促进绒毛树结构的血管网络形成。VEGF和VEGFR-2的表达在早期妊娠较高，在妊娠进展过程中逐渐下降，而PlGF和VEGFR-1的表达则在妊娠后期增加。因此，VEGF/VEGFR-2的优势促进了妊娠前两个季度内不成熟胎盘绒毛中分支丰富、阻力低的毛细血管床的建立。相反，妊娠后期分支较少的终末毛细血管环的出现似乎受到PlGF/VEGFR-1优势的调控，这有利于胎盘血管系统的成熟（Chau等人，2017年；Chen和Zheng，2014年；Ibba-Manneschi等人，2010年）。至于NRP-1，其表达贯穿妊娠的三个季度，尽管在第一个季度表达最高，从而有助于妊娠早期新血管的形成，促进着床和胎盘形成（Naidoo等人，2022年）。尽管这些因子及其受体的作用主要与胎盘血管网络发育相关，但它们也参与调节滋养层的侵袭、增殖和分化（Albonici等人，2020年；Bolatai等人，2022年；Kametas等人，2022年；Laakkonen等人，2019年；Modzelewski等人，2023年；Naidoo等人，2022年；Ruyani和Sumarsono，2023年；Velegrakis等人，2023年）。另一方面，VEGF和PlGF及其受体在所有胎盘成分中都有表达，如滋养层、血管内皮细胞和基质细胞，这表明它们对整个绒毛树的发育、成熟和生理功能有贡献（Albonici等人，2020年；Chau等人，2017年；Chen和Zheng，2014年；Laakkonen等人，2019年；Marini等人，2008年；Naidoo等人，2022年；Sgambati等人，2004年；Sgambati等人，2007年；Velegrakis等人，2023年）。另一个需要考虑的重要点是，这些因子及其受体在妊娠期间调节和维持免疫耐受中也起着重要作用。关于VEGF，它通常被认为是塑造免疫微环境的活跃因素（Bolatai等人，2022年）。在妊娠期间，蜕膜的VEGF表达和释放与子宫内膜中巨噬细胞的功能有关，促进从M1表型向M2表型的转变，从而有利于妊娠早期的子宫壁重塑（Laakkonen等人，2019年；Rana等人，2022年）。除了VEGF，PlGF似乎对免疫反应的影响最大，因为它作用于先天性和适应性免疫细胞，支持着床和胎盘发展的早期事件（Albonici等人，2020年；Modzelewski等人，2023年）。总体而言，免疫介导的机制可以调节细胞对血管生成因子的反应，而血管生成因子又可以调节免疫细胞的行为（Albonici等人，2020年）。有趣的是，免疫反应的改变与VEGF和PlGF表达的失衡有关，这与病理妊娠（如着床失败和高血压疾病的发展）有关（Albonici等人，2020年；Laakkonen等人，2019年；Modzelewski等人，2023年）。

基于这些发现，可以推测VEGF、PlGF及其受体在胎盘中的差异性表达可能与自身免疫性疾病下的独特和复杂的免疫失调有关。特别是，母体循环中的抗Ro/SSA和抗La/SSB自身抗体的存在可能导致胎盘形成所需的独特免疫环境的失调，包括VEGF家族成员在胎盘中的表达失衡，进而进一步改变母体-胎儿界面的免疫调节过程。值得注意的是，VEGF、PlGF、VEGFR-1和NRP-1在胎盘中的表达下降也可能部分是由于可溶性形式的VEGFFR-1和NRP-1的增加，这些形式在妊娠期间在因子相互作用中起重要作用。如先前在某些妊娠并发症中所报告的，可溶性VEGFFR-1和NRP-1水平的升高可能会阻止因子与膜受体的结合，从而干扰其功能（Albonici等人，2020年；Chau等人，2017年；Chen和Zheng，2014年；Laakkonen等人，2019年；Modzelewski等人，2023年；Naidoo等人，2022年；Porter等人，2021年；Rana等人，2022年；Zielińska和Darmochwa?-Kolarz，2025年）。此外，在对照组胎盘中发现的一组具有细长胞质延伸的基质细胞中NRP-1表达强烈，而在AD病例中则没有这种表达，这也值得讨论。根据这些细胞的独特形态（具有细长胞质延伸），可以初步假设这些细胞可能是树突状细胞，尽管需要使用CD11c或CD209/DC-SIGN等特定标记物进行进一步的免疫表型鉴定。值得注意的是，NRP-1在树突状细胞中表达，并在妊娠期间发挥免疫耐受作用（Albonici等人，2020年；Modzelewski等人，2023年；Velagala等人，2025年）。已知NRP-1也在免疫细胞中表达，特别是在树突状细胞中，并在妊娠期间发挥免疫耐受作用（Albonici等人，2020年；Modzelewski等人，2023年；Velagala等人，2025年）。因此，所有AD病例中观察到的NRP-1表达严重下降，尤其是在绒毛基质细胞中，可能导致母体-胎儿界面免疫监视的失调。

有趣的是，本研究检查的所有AD病例均未显示显著的胎盘组织病理学改变，并且妊娠顺利结束，没有母体和胎儿/新生儿的并发症。尽管没有组织病理学变化和临床症状，但观察到的VEGF/PlGF/受体表达的改变可能表明存在“代偿性”胎盘功能障碍，这种功能可能在额外的生理或环境压力下发展为临床表现。实际上，我们不能排除VEGF家族成员的表达改变与其他尚未确定的因素共同作用，可能是导致胎盘形态和功能障碍的触发因素，可能导致妊娠复杂化以及不良的母体和/或胎儿/新生儿结局。在这方面，在之前的研究中，我们发现了一种特殊的碳水化合物分子（唾液酸）的异常表达，这种表达在携带抗Ro/SSA和抗La/SSB抗体的母亲妊娠中可能导致胎盘功能障碍（Manetti等人，2024年）。

总之，我们的初步发现表明，在所有抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性妊娠中，VEGF、PlGF及其受体在所有胎盘成分中的表达失调具有共同趋势。因此，可以推测这种与自身免疫相关的VEGF家族成员表达改变可能导致了这些妊娠中的胎盘功能障碍。当然，病例数量较少是本研究的一个主要限制，这阻碍了正式的统计功效分析，并限制了发现的普遍性。这是由于该疾病的罕见性以及招募抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性妊娠妇女所面临的挑战。此外，尽管所使用的半定量评分系统已在胎盘免疫组化中得到验证，但我们承认它在与定量图像分析方法相比在客观性方面存在固有的局限性，这应在未来的大规模研究中予以考虑。无论如何，我们相信我们的初步观察结果为进一步研究这些生长因子及其受体在具有自身免疫异常的妊娠中的表达奠定了基础，这些研究可以在更大的病例系列中进行。例如，通过对表现出严重组织病理学特征的胎盘（如来自复杂妊娠、流产和早产的胎盘，以及来自无症状的抗Ro/SSA和抗La/SSB阳性女性的胎盘，即没有明显自身免疫疾病的症状）进行分析，可以更深入地了解VEGF家族成员在这些妊娠中的作用。此外，由于VEGF家族的其他成员（如可溶性VEGFR-1和NRP-1）在复杂妊娠中的作用已被证实，因此也值得进一步研究。从长远来看，深入阐明不同VEGF家族生长因子、受体及其共受体在具有自身免疫异常的妊娠中的表达变化，也可能为开发新的预防和/或治疗方法提供新的见解。

**资金来源**
本研究没有收到公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何特定资助。

**同意书/伦理批准**
机构评审委员会批准了本研究的设计（方案编号0005381/i）。

**利益冲突声明**
无。

**未引用的参考文献**
(Ibba-Manneschi等，2010；Qu和Khalil，2020；Shen和Suresh，2017)

**CRedIT作者贡献声明**
Mihaela Micu：撰写、审稿与编辑、数据可视化、研究；
Irene Rosa：撰写、审稿与编辑、数据可视化、研究；
Mirko Manetti：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、监督、资源协调、研究、概念化；
Eleonora Sgambati：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、监督、资源协调、研究、概念化。

**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。