老年人人体颈动脉体中的非选择性阳离子通道TRPC3和TRPC6

《Tissue and Cell》：The non-selective cation channels TRPC3 and TRPC6 in the human carotid body in the elderly

　　伊莎贝尔·S·M·诺恩纳马赫 (Isabelle S.M. Nonnenmacher)、尼科·莱曼 (Nico Lehmann)、托马斯·切尔尼格 (Thomas Tschernig)、阿恩·雷德 (Arne Wrede)、彼得·H·施密特 (Peter H. Schmidt)、扬·M·费德尔斯皮尔 (Jan M. Federspiel)
德国萨尔州霍姆堡萨尔兰大学医学院解剖学研究所

**摘要**
颈动脉体在心血管（病理）生理学中起着重要作用，同时也涉及典型的瞬时受体电位通道3（TRPC3）和6（TRPC6）。然而，虽然已经在啮齿动物的颈动脉体中发现了TRPC3和TRPC6，但它们在人类颈动脉体中的分布尚未得到描述。因此，本研究旨在探讨老年人颈动脉体中TRPC3和TRPC6的蛋白质分布情况。

**方法**
研究了六名遗体捐赠者的颈动脉体（中位年龄86.5岁；1名男性，5名女性）。采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin）和Movat-Pentachrome染色方法。对TRPC3和TRPC6进行了免疫组化标记。如果还有连续切片，还对分化簇34（Cluster of Differentiation 34）、神经丝（neurofilaments）和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）进行了免疫组化标记，以便进一步进行形态学评估。通过密度测定法对TRPC3和TRPC6的免疫反应性进行了半定量描述和测量。颈动脉体的退化情况通过组织形态学评估来描述，同时利用组织形态测量法估算该器官的尺寸，作为免疫组化分析的形态学背景。

**结果**
在所有样本中，主要在主导细胞（chief cells）和内皮细胞中观察到免疫反应性。支持细胞（sustentacular cells）的信号较弱。两名遗体捐赠者表现出严重的动脉粥样硬化和纤维化。

**结论**
这些发现可能表明TRPC3和TRPC6参与了颈动脉体缺血和纤维化的反应过程。由于样本量较小，并且使用了患有多种疾病的遗体捐赠者，需要更多的研究来区分TRPC3和TRPC6在颈动脉体表达和分布上的年龄相关变化和疾病相关变化。

**1. 引言**
颈动脉体是一个成对的化学感受器官，由I型球状细胞（也称为主导细胞，Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）和II型球状细胞（支持细胞）、成纤维细胞、内皮细胞以及周细胞组成。主导细胞是分泌细胞（Chatyingmongkol和Roongruangchai，2003年）。当受到刺激时，主导细胞去极化，导致细胞内Ca2+浓度升高，进而释放神经递质（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）。II型球状细胞是嵌入主导细胞中的多能干细胞（Pardal等人，2007年）。通常，颈动脉体可以由缺氧、高碳酸血症、酸中毒、瘦素、胰岛素、乳酸和低血糖激活（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）。机械刺激也可能对其产生影响（Alba等人，2025年）。特别是，主导细胞的激活可能由氧依赖性钾通道（K? channels）的失活引起（López-Barneo等人，1988年）。此外，二氧化碳通过与水反应生成碳酸氢盐和氢离子，导致细胞内pH值下降（Iturriaga，1993年）。细胞外pH值下降还可能通过酸敏离子通道（ASIC）和串联孔结构（如TWIK-K?通道和TASK通道）引发信号传导（Ehling等人，2015年）。在I型球状细胞和周围神经纤维中检测到了ASIC 1-4型（Martínez-Barbero等人，2023年）。然而，进一步研究表明TASK通道在缺氧诱导的钙释放中起次要作用（Turner和Buckler，2013年）。因此，其他通道可能在缺氧诱导的Ca2+释放中起关键作用。典型的瞬时受体电位（TRPC）通道可能是候选者之一，因为它们存在于氧敏感组织中。在大鼠中，使用TRP通道拮抗剂2-氨基乙氧基二苯硼烷（2-APB）阻断这些通道后，缺氧诱导的Ca2+释放显著减少（Kim等人，2015年）。从病理学角度来看，颈动脉体在不同疾病的病理生理学中具有重要作用，尤其是心血管系统疾病。例如，在慢性心力衰竭患者中，化学感受细胞的敏感性增加与不良预后相关（Ponikowski等人，2001年），这可能是由于交感神经系统过度激活所致（Sun等人，1999年）。TRPC3和TRPC6在心血管疾病中都起着重要作用，例如与系统性动脉高血压（álvarez-Miguel等人，2017年）、动脉粥样硬化（Tano等人，2010年）或扩张型心肌病（Kitajima等人，2011年）有关。因此，它们在人体内的分布已被广泛研究。然而，它们在颈动脉体中的确切位置仅限于大鼠的研究（Buniel等人，2003年）。因此，本研究旨在结合组织形态学和组织形态测量学背景来描述TRPC3和TRPC6的蛋白质表达情况。为此，对遗体捐赠者的组织进行了评估。

**2. 方法**
本研究已获得当地伦理委员会的批准（投票编号163/20）。样本来自生前同意死后将其身体用于研究和教育的遗体捐赠者。

**2.1. 采样和样本处理**
从十一名遗体捐赠者的颈动脉分叉处获取样本（萨尔兰大学解剖学和细胞生物学研究所）。其中四人使用福尔马林固定，七人使用硝酸盐-腌制盐-乙醇-聚乙二醇-400（NEP）固定。所有捐赠者均通过股动脉进行逆行灌注并使用相应的固定液。固定发生在死亡后26至62小时内（表1）。每个颈动脉分叉样本被切成矢状或横截面（图1）。然后使用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙并包埋在石蜡中。每个样本至少制备六个7微米厚的切片。对原始切片进行扫描，以寻找颈动脉体的线索，即颈动脉分叉附近的叶状结构和血管结构。在十一名捐赠者中，苏木精-伊红染色证实了颈动脉体的存在。

**表1. 遗体捐赠者信息**
| 遗体捐赠者编号 | 年龄（岁） | 性别 | 死因 | 固定时间（小时） | 固定方式 | 影响免疫组化染色的因素（如固定方法和死后时间间隔） |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | 86 | 男 | 转移性上皮癌，肺栓塞 | 46 | 福尔马林 |
| 2 | 82 | 女 | 心力衰竭 | 81 | NEP |
| 3 | 89 | 女 | 心力衰竭 | 83 | NEP |
| 4 | 85 | 男 | 急性呼吸衰竭 | 86 | 福尔马林 |
| 5 | 101 | 女 | 卡瘦病，阿尔茨海默病 | 93 | NEP |
| 6 | 87 | 女 | 多器官衰竭 | 93 | NEP |
| 7 | 85 | 男 | 心力衰竭 | 99 | 陈氏盐-乙醇-聚乙二醇-400 |
| 8 | 68 | 女 | 心力衰竭 | 38 | 福尔马林 |
| 9 | 89 | 女 | 多器官衰竭 | 39 | NEP |
| 10 | 85 | 男 | 肺栓塞 | 62 | 福尔马林 |
| 11 | 18 | 女 | 心力衰竭 | 38 | NEP |

**2.2. 特殊技术**
本研究采用了Verh?ff方法的Movat-Pentachrome染色（Staining Kit, Morphisto, Offenbach Germany；物品编号12061）进行组织形态学评估。此外，还对TRPC3和TRPC6进行了免疫组化标记（TRPC3一抗：1:50；Alomone Labs；产品编号ACC-016；TRPC6一抗：1:100；Alomone Labs；产品编号ACC-017；染色剂：3,3’-二氨基苯肼（DAB，Vector Laboratories Inc，产品编号7411-49-6）。为了全面进行组织学评估，需要每个遗体捐赠者的连续切片。在十一名捐赠者中有六人提供了足够的切片。评估的遗体捐赠者中位年龄为86.5岁（最低82岁，最高101岁），其中大多数为女性（6人中的4人）。表1显示了根据死亡证明的死亡原因。如果还有更多包含颈动脉体的连续组织切片，还进行了额外的免疫组化标记：分化簇34（CD34，内皮细胞标记物；Pusztaszeri等人，2006；一抗：1:50，Dako，代码M7165）、神经丝（轴突骨架标记物；Meller等人，1993；一抗：1:50，Leica biosystems / Novocastra，NCL-L-NF200-N52）和酪氨酸羟化酶（儿茶酚胺能纤维标记物；Burgi等人，2011；Kawagishi等人，2008；以及主导细胞（Oomori等人，1994；一抗：1:500，Santa Cruz Biotechnology，sc-25269）。CD34、神经丝和酪氨酸羟化酶的标记用于区分血管和神经结构（比较CD34和神经丝标记），以及区分交感神经和副交感神经（比较神经丝和酪氨酸羟化酶标记）。总共剩余九个切片用于补充免疫组化标记。如果一名捐赠者有三个切片，就对其进行了完整的补充标记（捐赠者3和捐赠者5）。如果每个案例剩余2个或更少的切片，则将剩余切片随机分配到不同的免疫组化标记中，以完成完整的补充标记（例如，捐赠者1的CD34标记、捐赠者2的酪氨酸羟化酶标记、捐赠者4的神经丝标记）。免疫组化染色完成后，有三个切片被固定在玻璃载玻片上（捐赠者2的酪氨酸羟化酶标记、捐赠者3的神经丝标记、捐赠者5的CD34标记）。补充免疫组化标记后，没有剩余包含颈动脉体的组织切片。免疫组化染色的详细信息见补充文件I。

**2.3. 显微镜评估**
使用Olympus BX43显微镜、Olympus DP23相机和Olympus cellSens Dimensions 4.2软件进行样本的组织学检查。首先进行了定向组织形态学分析，根据现有指南（Stone等人，2015年）对颈动脉粥样硬化进行分级。其次，评估了颈动脉体中的退行性变化，如小叶间动脉的纤维化狭窄、暗细胞增生（Hurst等人，1985年）、脂褐素颗粒（Di Giulio，2018年）以及小叶的蜂窝状溶解（Rosai，2004年）。在此过程中，像常规病理解剖学研究一样，对不同类型的细胞进行了形态学区分（例如，在颈动脉体的一个小叶内，与血管无关的主导细胞具有明显的圆形核，而支持细胞具有扁平狭长的核，似乎分隔主导细胞（Heath和Smith，1992年）。然后对每个颈动脉体切片进行了组织形态测量分析，测定了每个捐赠者的长度、宽度以及每毫米2的血管数量，并报告了平均值。接着评估了颈动脉体的免疫反应性，使用半定量评分系统（“+”表示弱信号强度，“++”表示中等强度，“+++”表示强信号强度）和保守的密度测量方法（光阈值分析）。这些均在400倍放大下进行。为TRPC3和TRPC6定义了单独的阈值，并将其设置在红色光谱范围内。实际免疫反应区域（即阈值以上的区域）计算为高倍视野面积的百分比（例如61,285.82微米2）。每个免疫组化切片进行三次这样的阈值测量，采用系统随机采样方案。计算了三个高倍视野的相对反应区域平均值，并报告了每个捐赠者的平均值。更多细节见先前出版物（Federspiel等人，2023年；Walz等人，2023年）。

**3. 结果**
**3.1. 组织形态学评估**
- **颈动脉**：一名捐赠者无显著动脉粥样硬化（捐赠者2），一名捐赠者有轻度动脉粥样硬化（捐赠者3），两名捐赠者有中度动脉粥样硬化（捐赠者1和捐赠者5），两名捐赠者有重度动脉粥样硬化（捐赠者4和捐赠者6，表2）。捐赠者6是唯一一个表现出颈动脉外膜纤维化的案例（图2）。捐赠者4的血管腔完全闭塞（图2）。所有至少有轻度动脉粥样硬化的捐赠者都表现出血管壁纤维化。捐赠者4的血管壁还发现有黏多糖沉积（图2 A，C）。表2总结了每位捐赠者的详细情况。

**表2 – 颈动脉和颈动脉体的退化情况**
| 遗体捐赠者编号 | 颈动脉粥样硬化情况 | 颈动脉体纤维化情况 |
| ---- | ---- | ---- |
| 1 | 无 | 无 |
| 2 | 轻微 | 无 |
| 3 | 中度 | 无 |
| 4 | 重度 | 无 |
| 5 | 重度 | 无 |
| 6 | 重度 | 有 |
| 7 | 无 | 有 |
| 8 | 无 | 有 |
| 9 | 无 | 有 |
| 10 | 无 | 有 |
| 11 | 无 | 有 |

**图2. 颈动脉和颈动脉体的基本情况总结**颈总动脉及颈动脉体的退化。(A-D)：供体4的颈总动脉(A, C)和颈动脉体(B, D)，采用HE染色和Movat-Pentachrome染色，放大倍数为100倍。(B)：在该颈动脉体中，仅有小范围区域显示出正常的生理结构（1），大部分组织呈现出退化迹象（2）。(A)和(C)展示了颈总动脉的外膜（5）和中膜（6），并伴有严重的胶原增生（3）以及黏多糖沉积（4）。(E)：颈总动脉被一个较陈旧的、有一定结构的血栓阻塞，周围有再血管化的迹象（*，放大倍数为40倍）。(F)：供体6的颈总动脉，采用HE染色，放大倍数为100倍，可见纤维化已蔓延至外膜。相比之下，供体1仅表现出轻度的动脉粥样硬化，中膜受影响较轻。(G)：分级依据最新的国际建议（Stone等人，2015年）。3.1.2 颈动脉体 在六位供体中，有四位显示出颈动脉体纤维化（供体3至6），其中两位（供体4和6）的纤维化已发展至部分萎缩（见图2）。在这两位供体中，颈总动脉的弹性层已不再完整，且小动脉普遍发生退化。六位供体中有四位在颈动脉体中发现了蜂窝状结构和脂褐素沉积（表2，见图3）。仅有一位供体（供体2）观察到暗细胞突出现象（见图3）。有趣的是，在那些颈动脉体纤维化严重的案例中并未观察到脂褐素（供体4和供体6）。仅有供体2的颈动脉体同时表现出蜂窝状结构和暗细胞突出（见图2）。供体1的颈总动脉仅呈轻度动脉粥样硬化，而供体3至6的颈总动脉则伴有中度至重度的动脉粥样硬化（详见表2）。3.1.2 颈动脉体 在六位供体中，有四位显示出颈动脉体纤维化（供体3至6），其中两位（供体4和6）的纤维化已发展至部分萎缩（见图2）。在这两位供体中，颈总动脉的弹性层已不再完整，且小动脉普遍发生退化。六位供体中有四位在颈动脉体中发现了蜂窝状结构和脂褐素沉积（表2，见图3）。仅有一位供体（供体2）观察到暗细胞突出现象（见图3）。有趣的是，在那些颈动脉体纤维化严重的案例中并未观察到脂褐素（供体4和供体6）。仅有供体2的颈动脉体同时表现出蜂窝状结构和暗细胞突出（见图2）。供体1的颈总动脉仅呈轻度动脉粥样硬化，而供体3至6的颈总动脉则伴有中度至重度的动脉粥样硬化（详见表2）。在所有供体中均未观察到颈动脉体炎症。有关每位供体的更多细节，请参见表2。下载：高分辨率图像（981KB）下载：全尺寸图像图3. 生理状态与老年状态下的颈动脉体。(A) 供体5的颈动脉体，采用TRPC3免疫组化染色，放大倍数为200倍；(B) 采用TRPC6免疫组化染色，放大倍数为400倍。(A) 中，主细胞显示深棕色信号（1），而支持细胞（2）及背景（3）显示较弱的信号。(C) 供体2的老年状态下的颈动脉体，采用HE染色，放大倍数为200倍，具有典型的特征，如暗细胞突出（4）和脂褐素颗粒（5）。3.2 组织形态测量 同一位供体的样本中，各切片的面积、长度、宽度及血管数量各不相同，因为每个切片所在的切面不同（见图4）。最小面积、长度和宽度分别为1.33平方毫米（供体1）、1.61毫米（供体1）和1.24毫米（供体1）；最大面积、长度和宽度分别为8.78平方毫米（供体2）、4.45毫米（供体2）和2.68毫米（供体5）；中位数分别为5.81平方毫米、3.43毫米和2.01毫米。供体1每单位面积的血管数量最多（每平方毫米6个血管切片）。该颈动脉体未出现纤维化退化。供体5每单位面积的血管数量最少（每平方毫米3个血管切片）。相应地，该颈动脉体虽然出现纤维化，但其小动脉仍然保持完整。组织形态测量结果的可视化总结见图4。下载：高分辨率图像（291KB）下载：全尺寸图像图4. 密度测量与形态测量结果。(A) 超过密度测量阈值的平均面积被归一化为高倍视野的总面积。此计算分别针对TRPC3和TRPC6通道的免疫组化结果进行。y轴表示百分比，x轴对应每位供体。由于供体4和供体6的颈动脉体严重退化，因此未进行密度测量。(B-D) 图表显示了所有染色方法下颈动脉体的宽度（B）、面积（C）和长度（D）以及计算出的平均值。x轴表示面积，y轴表示供体。(E) 显示了所有供体每平方毫米的血管数量。缩写：HE – 苏木精-伊红；TRPC3/6 – 经典瞬时受体电位通道3或6。3.3 TRPC3和TRPC6的免疫反应性 由于供体4和供体6的颈动脉体严重退化，因此无法评估它们的免疫反应性。在光学阈值分析中，所有存活的细胞都表现出高于或等于光学阈值的信号强度。总体而言，TRPC6的信号强度高于TRPC3，供体1除外（见图4）。TRPC3在高于或等于光学阈值的免疫反应性面积为高倍视野的4.67%至9.12%，中位数为6.61%；TRPC6的免疫反应性面积为6.11%至8.18%，中位数为6.73%。在所有个体中均检测到TRPC3和TRPC6的背景染色。特别是主细胞对TRPC3和TRPC6表现出强烈的免疫反应性，这使得这两类细胞与背景区分开来（见表3）。仅在供体1中，主细胞的免疫反应性与背景无明显界限。支持细胞对TRPC3和TRPC6的反应性较弱（见图3）。从形态学角度来看，信号差异结合HE染色有助于区分这两种细胞类型。表3展示了TRPC3和TRPC6免疫反应性的半定量评分。供体1 2 3 5 最常见等级 TRPC3 主细胞 ++++ ++++ ++++ 支持细胞 ++++ ++++ ++++++ 背景 +++ TRPC6 主细胞 ++++ ++++ ++++ ++++++ 血管壁 ++++ ++++ ++++++ TRPC3和TRPC6免疫反应性的半定量评分总结。缩写：TRPC3 - 经典瞬时受体电位通道3；TRPC6 - 经典瞬时受体电位通道6。3.4 CD34、神经纤维和酪氨酸羟化酶的免疫反应性 由于染色过程中组织脱落，仅有九张组织切片中的三张能够进行互补免疫组化检测（供体1：酪氨酸羟化酶染色；供体3：神经纤维染色；供体5：CD34染色）。由于无法完成所有染色（即苏木精-伊红、Movat Pentachrome、TRPC3-/TRPC6-、CD34-、神经纤维和酪氨酸羟化酶染色），因此无法进行比较分析。然而，染色片的结果支持支持细胞和主细胞的形态学区分（见图5）。下载：高分辨率图像（1MB）下载：全尺寸图像图5. 不同细胞类型的形态学比较。各图面板显示200倍放大的显微照片（A、C、D和E为供体5，B为供体3，F为供体2）。A – 苏木精-伊红染色；B – 神经纤维染色；C – TRPC3染色；D – TRPC6染色；E – CD34染色。由于尸检后组织变形和组织处理过程中的脱落，没有完整的染色面板可用于比较分析。在A面板中，黄色星号(*)示意了颈动脉体一个小叶的边界。所有面板中的黄色箭头指向形态学上的大型细胞（即主细胞）。浅蓝色箭头指向形态学上的大型细胞之间的小型细胞（即支持细胞）。E面板中的红色箭头指向一个小血管（即内皮的CD34染色）。内皮细胞也具有细长的核，但不占据大型细胞的位置，而是沿着血管内壁排列。B面板中的橙色箭头指向小型、纤维状的神经纤维免疫反应结构。神经纤维染色显示了与细胞数量相对而言，颈动脉体具有密集的神经支配。不同免疫组化染色与苏木精-伊红染色的比较表明，这些细胞和组织形态学特征足以支持细胞分类。图5附有补充文件——附录D，其中提供了400倍放大的图像。缩写：CD34 – 化学趋化因子34；HE – 苏木精-伊红；NF – 神经纤维；TH – 酪氨酸羟化酶；TRPC3/6 – 经典瞬时受体电位通道3或6。4. 讨论 尽管已知TRPC3和TRPC6通道在心血管疾病中的重要性（例如TRPC3在心脏纤维化中的作用（Numaga-Tomita等人，2017年）或TRPC6在神经激素应答中的作用（Khan等人，2024年），但据作者所知，目前尚无关于这些非选择性阳离子通道在人颈动脉体中的蛋白质表达和分布的研究。然而，TRPC3和TRPC6目前被认为可能是预防心脏重构的潜在治疗靶点（Kuwahara和Nakao，2011年）。颈动脉体是心血管疾病中一个高度相关的器官，例如，颈动脉体过度激活是动脉高血压的重要病理生理机制（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）。这意味着颈动脉体可能是由交感神经系统介导的疾病（如动脉高血压）的潜在治疗靶点（Paton等人，2013年）。鉴于动物与人颈动脉体之间的结构差异（Heath，1983年），本研究旨在描述老年人颈动脉体中TRPC3和TRPC6蛋白的表达和分布。总体而言，本研究在人颈动脉体中广泛检测到了TRPC3和TRPC6的免疫反应性。从平均值来看（TRPC3为6.61%；TRPC6为6.73%，见图4），两种通道的免疫反应区域相似。TRPC3和TRPC6蛋白最显著的表达部位为主细胞和血管壁（见表3）。即使在颈动脉体严重退化并伴有纤维化和典型年龄相关变化的病例中（见图2、图3），也仍能检测到这两种蛋白。只有当颈动脉体完全萎缩时（例如，完全慢性阻塞的情况下，见图2），才丧失TRPC3和TRPC3的免疫反应性。4.1 文献背景下的发现 本研究观察到了与颈动脉体退化和老化相关的多种组织形态学变化，如小动脉阻塞、暗细胞突出、脂褐素沉积（Di Giulio，2018年）或小叶的蜂窝状结构（Rosai，2004年）。这可能归因于使用了老年且患有多种疾病的供体（见表1）。有趣的是，未发现淋巴细胞浸润这一典型的与年龄相关的现象（Hurst等人，1985年）。一个可能的解释是，纤维化明显的样本某种程度上类似于已经处于炎症后的状态。然而，颈动脉体完全萎缩的现象也与之前的关于人颈动脉体的病理研究结果一致（Matturri等人，2005年）。除了再现组织形态学发现外，本研究还证实了在啮齿动物颈动脉体的主细胞中也存在TRPC3和TRPC6的表达（Buniel等人，2003年）。在这些细胞中观察到这两种通道的显著表达（见表3）。然而，这些细胞干扰了颈动脉体的神经分泌功能，即不同神经递质和神经调节剂（如血管紧张素-II、内皮素-1或乙酰胆碱）的分泌（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）。鉴于心力衰竭在老年人中非常普遍（Savarese等人，2023年），以及神经激素激活（特别是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在心力衰竭病理生理中的核心作用（Hartupee和Mann，2017年），老年且患有多种疾病的供体中TRPC3和TRPC6的显著表达可能反映了这种慢性神经激素激活状态。除了主细胞外，老年人颈动脉体的血管壁也显示出明显的TRPC3和TRPC6免疫反应性。这可能暗示这两种通道与内皮功能障碍相关，并且会影响内皮通透性（Ahmmed和Malik，2005年；Kwan等人，2007年；Tano等人，2010年），这些因素与颈动脉体的年龄和疾病相关退化有关。颈动脉体作为一个含有众多毛细血管的小型血管器官的形态学结构（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）支持了这一假设。除了TRPC3和TRPC6与心脏疾病的相关性外，它们也与血管疾病有关，尤其是动脉粥样硬化。例如，在小鼠模型中，强制表达TRPC3可减轻动脉粥样硬化（Feng等人，2018年）。这可能归因于TRPC3在炎症信号传导中的重要性（Smedlund等人，2015年；Vazquez等人，2016年）。然而，通过特定的微RNA（miR-26a）靶向TRPC6被发现在使用小鼠和细胞培养模型的研究中可以减少内皮细胞凋亡（Zhang等人，2015年）。由于颈动脉体对许多生理过程和系统的调节至关重要[例如循环系统（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年）]，老年人的退化颈动脉体毛细血管中TRPC3和TRPC6的显著表达也可能是一种维持器官结构的策略，考虑到上述发现。此外，颈动脉粥样硬化与颈动脉体退化之间存在一致的关联（表2）也支持这一假设。需要指出的是，两名颈动脉体严重萎缩的供体在颈总动脉中显示出最先进的动脉粥样硬化阶段（供体4和6）。另外两名供体的颈动脉体出现纤维化，但尚未萎缩（供体3和5）。因此，颈动脉体纤维化似乎是由于血流灌注不足引起的。然而，颈动脉体纤维化的临床意义仍然不明确（Tang等人，2021年）。

4.2. 局限性
4.2.1. 队列
必须指出，当前研究是一项首次描述性和探索性研究，样本数量较少。由于解剖学设置和使用了尸体供体，研究包括了老年人和多病态个体（表1）。为了确定TRPC3和TRPC6蛋白在人类颈动脉体中的表达是否以及在衰老过程中和（心血管）疾病中如何变化，进一步的研究需要包括更多的个体和对照组样本（例如，死于事故的年轻人）。此外，还需要更大的老年人和患病者队列来确定TRPC3和TRPC6在人类颈动脉体中的实际变化与年龄和疾病之间的关系。总的来说，需要更多的研究来分析更大的队列，包括对照组，以评估TRPC3和TRPC6作为潜在的治疗靶点。

4.2.2. 方法
使用死后样本可能会带来死后伪影，如组织液化（Hayman和Oxenham，2017年）或蛋白质降解（Zissler等人，2020年）。分析队列中的平均死后时间为86.5小时（表1）。因此，人为的蛋白质“位移”可能解释了观察到的持续背景信号，特别是在TRPC3和TRPC6标记中。使用多克隆抗体检测TRPC3和TRPC6可能会进一步加剧这种背景信号（Mulisch，2014年）。将解剖学研究所进行的TRPC3和TRPC3标记结果与补充面板的结果（即CD34、神经丝、酪氨酸羟化酶；神经病理学研究所）进行比较，虽然使用了更为激进和精细的染色方案，但导致背景信号减少，同时有三分之二的切片因脱落而丢失。因此，对于（病理）解剖学研究而言，适用于受损和降解组织的解剖学染色方案（TRPC3和TRPC6）是合理的，尽管存在背景信号，因为它允许评估更多的实际可比较切片（即在同一染色过程中处理）。当比较尸体供体的组织与常规（神经）病理学尸检获得的组织时（图2至5），组织性质和组织质量对染色行为的影响变得明显：更好的组织保存条件可以实现更好的染色质量（清晰的信号、更少甚至没有背景信号、核染色等）。这种比较支持死后组织退化可能是导致显著背景染色的潜在原因，并支持选择稳健的DAB免疫组化染色方法而非更先进的方法（例如自动荧光、免疫荧光等）。已知尸体供体中的严重疾病可能会通过阻碍固定液的流动而影响逆向灌注固定，从而有利于死后伪影的发生。组织的死后降解也可能是CD34、酪氨酸羟化酶和神经丝免疫组化染色过程中高脱落率的原因。

为了解决DAB染色中严重背景信号的问题，我们基于检查者的观察进行了半定量评估，并在密度测量中应用了保守的阈值。然而，这种方法可能导致较弱的信号被背景信号掩盖，无法精确地定位蛋白质在亚细胞水平上的位置，即定位在细胞膜或其他细胞区室中的信号。对于这种详细的分析，需要没有死后伪影的组织，并且可以采用免疫荧光染色等技术，甚至可以使用共聚焦显微镜（Danckaert等人，2002年；Itoh等人，2001年）。由于明显的死后伪影和包含颈动脉体的连续切片的稀缺，我们决定使用在病理学常规中已经确立的稳健的免疫组化方法。然而，所使用的样本和应用的方法不适用于在亚细胞水平上精确定位TRPC3和TRPC6。关于不同细胞类型内位置的信息来自组织病理学评估，应通过未来的研究进行验证。

多病态状态和死后伪影导致的组织稀缺性使得实际显示颈动脉体的连续切片数量非常有限。因此，只能进行有限的免疫组化染色。然而，评估额外的标志物，例如与缺氧相关的标志物（如缺氧诱导因子1α（Adams等人，2009年），可能会帮助更好地理解这项初步探索性研究中的实际病理生理学机制。特别是先进的免疫荧光染色技术，如双重或三重标记（Yokoyama等人，2016年），可以提供有关人类颈动脉体退化的额外信息。例如，在大鼠中的分析能够分析I型和II型细胞如何围绕特定类型的神经末梢排列（Yokoyama等人，2016年）。除了进一步的免疫染色外，未来的研究还可以应用自动荧光分析。这样的分析有助于更详细地评估弹性纤维（Li等人，2020年）或脂褐素色素（Schnell等人，1999年）。

进一步影响最终染色结果的潜在因素还包括组织厚度和选择的玻璃载玻片（例如，是否涂有聚L-赖氨酸）。

5. 结论
总之，这项观察性和探索性研究首次描述了在详细的组织形态学和组织形态测量评估背景下TRPC3和TRPC6蛋白在人类颈动脉体中的分布。研究了来自六名老年人和多病态供体的样本。观察到这两种通道在毛细血管和主细胞中的显著表达（表3），同时伴有颈动脉体的显著退化和颈动脉的动脉粥样硬化（表3）。因此，这些形态学发现初步表明颈动脉体纤维化可能与颈动脉体血流灌注不足有关。如果假设颈动脉体血流灌注不足，TRPC3和TRPC6的表达可能是由于颈动脉体的动脉粥样硬化退化和/或明显的心血管合并症（如心力衰竭）所致。然而，由于病例数量较少（n=6）、缺乏对照组以及样本的死后伪影，这项探索性研究的局限性必须予以考虑。由于动物和人类颈动脉体之间的差异（Heath，1983年）以及颈动脉体的复杂（病理）生理学（Ortega-Sáenz和López-Barneo，2020年），需要进一步的结构和功能研究来确定TRPC3和TRPC6在人类颈动脉体衰老、退化和心血管疾病中的实际病理生理学作用。

伦理批准
本研究已获得当地伦理委员会的批准（投票编号163/20）。

资金
本研究未接受外部资助。

CRedIT作者贡献声明
Federspiel Jan Michael：写作-审阅与编辑、撰写-初稿、方法学、调查、数据分析、概念化。
Peter H. Schmidt：写作-审阅与编辑、监督。
Arne Wrede：写作-审阅与编辑、验证、监督、资源、方法学。
Thomas Tschernig：写作-审阅与编辑、验证、监督、资源。
Nico Lehmann：写作-审阅与编辑、调查。
Nonnenmacher Isabelle S. M.：写作-审阅与编辑、撰写-初稿、可视化、调查、数据分析。

关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
本研究或手稿准备过程中未使用生成式AI。使用了AIGrammarly（v1.2.116.1535）来检查拼写和语法错误。