使用Illumina平台比较18S rRNA基因片段和参考数据库以评估牛埃美耳球虫（Eimeria）的多样性

《Veterinary Parasitology》：Comparison of 18S rRNA gene fragments and reference databases for assessing bovine Eimeria diversity using the Illumina platform

　　

作者名单：李秀彬（Subin Lee）、苏秀妍（So Youn Youn）、徐民奎（Min-Goo Seo）、俞美宣（Mi-Sun Yoo）、李香 Simulation（Hyang-Sim Lee）、赵允桑（Yun Sang Cho）、郭东美（Dongmi Kwak）、李承勋（Seung-Hun Lee）

韩国忠北国立大学兽医学院，忠北道清州市 28644

摘要

本研究比较了不同18S rRNA目标区域和参考数据库在利用宏条形码技术评估牛Eimeria物种多样性方面的效果。共收集了32份患有腹泻的牛粪便样本，这些样本通过显微镜检查和PCR检测均确认含有Eimeria。每份样本的DNA被合并用于宏条形码分析，分析目标为18S rRNA基因的V4和V9区域以及属特异性的Eimeria 18S rRNA片段（Pan-Eim-18S），使用了Illumina MiSeq平台。此外，还使用了两个参考数据库（NCBI和SILVA）进行分类学鉴定。结果表明，Pan-Eim-18S分析比V4和V9区域分析识别出了更多的Eimeria物种；同时，基于NCBI数据库的分类学鉴定结果也比基于SILVA数据库的结果识别出了更多Eimeria物种。18S rRNA基因的宏条形码结果通过常规PCR和克隆技术进行了验证。用于宏条形码分析的相同DNA池也被用于后续的分析，并进行了系统发育分析。系统发育分析显示，所得序列主要归属于E. bovis/E. ellipsoidalis/E. zuernii组，以及E. auburnensis和其他Eimeria物种。综上所述，目标区域和参考数据库对Eimeria物种的鉴定具有重要影响，尤其是在密切相关的物种之间。本研究的结果表明，较长的扩增子分析和使用NCBI数据库可以提高对多种Eimeria物种的高分辨率鉴定。

引言

由Eimeria感染引起的牛球虫病会显著影响犊牛的生长，并导致畜牧业的经济损失（Ekawasti等人，2021年；Rehman等人，2011年）。迄今为止，已经确定了至少21种能够感染牛的Eimeria物种。E. bovis和E. zuernii被认为是致病性最强的，且常导致犊牛出现严重腹泻（Heidari等人，2014年；Lassen等人，2014年）。此外，单个宿主体内同时存在多种Eimeria物种的情况很常见，这给牛球虫病的诊断和管理带来了复杂性（Delling和Daugschies，2022年；Hamid等人，2019年；Li等人，2021年）。

传统上，Eimeria物种的鉴定依赖于形态学特征。卵囊大小、包括微孔、微孔盖、卵囊残余物、极粒、Stieda体、substieda体、孢子囊残余物和核等结构的存在与形状，以及宿主特异性和致病性是物种鉴定的关键因素（Berto等人，2014年；Flori?o等人，2016年；Tenter等人，2002年）。然而，区分形态相似的物种（如E. cylindrica和E. ellipsoidalis）颇具挑战性。此外，卵囊发育过程中的形态变异也增加了物种鉴定的难度（Lucas等人，2014年）。

为了解决这些限制，研究人员采用了分析18S rRNA基因、细胞色素氧化酶亚基I和基因间间隔区段的分子方法（Blake等人，2020年；Haug等人，2007年；Kawahara等人，2010年；Koreeda等人，2017年；Morrison等人，2004年）。其中，18S rRNA数据库是最成熟的方法之一。18S rRNA基因的分析已被广泛用于研究各种环境中的真核生物多样性（Bachy等人，2013年；Marande等人，2009年）。然而，在混合感染或样本数量较多的情况下，使用常规PCR和qPCR等分子方法研究多样性较为困难，这是一个劳动密集型且耗时的过程。

下一代测序（NGS）具有优势，它能够提供高分辨率的遗传物质分析，并能够检测到罕见变异（Lee等人，2025年）。NGS还允许同时处理大量样本，非常适合高通量研究（Alkathiri等人，2024年；Deiner等人，2017年）。宏条形码技术作为NGS可以实现的一项实验，已被广泛用于检测单个样本中的多种寄生虫物种（Choi等人，2024年；Kim等人，2022年）。18S rRNA基因因其保守区和高度可变区的结合而成为物种鉴定中最常用的分子标记（Hadziavdic等人，2014年）。18S rRNA基因中的多个可变区域（包括V1-2、V3、V4和V9）已被用于评估真核生物的多样性（Bradley等人，2016年）。V4和V9区域是最常用于宏条形码分析的区域，通常会一起使用（Choi和Park，2020年；Stoeck等人，2010年）。V4区域是真核生物中最大的可变区域，常用于研究它们的系统发育关系，而V9区域在揭示现存多样性方面特别有效（Hadziavdic等人，2014年；Kounosu等人，2019年）。

与细菌多样性分析相比，真核生物的宏条形码分析尚未得到广泛应用。此外，真核生物的宏条形码结果可能会受到实验条件（如目标区域、引物组和参考数据库）的影响（Choi和Park，2020年；Macheriotou等人，2019年；Quince等人，2011年）。当涉及密切相关的分类群时，准确地在物种水平上对序列进行分类尤其具有挑战性（Kounosu等人，2019年）。当扩增子长度较短且NGS产生的读数不足时，分类学鉴定可能无法达到物种水平，非目标真核生物的扩增程度可能高于目标生物，从而导致误分类和偏差，例如某些真核生物的代表性不足，从而影响鉴定准确性。鉴于这些限制，使用针对特定属的引物可能比通用引物更为精确，因为它们是专门为特定分类群设计的，从而减少了误分类和偏差的风险。

参考数据库的选择会显著影响分类学鉴定的准确性。目前，18S rRNA基因的分类主要基于NCBI和SILVA数据库（Hadziavdic等人，2014年）。NCBI数据库通常能够提供物种级别的分类，而SILVA数据库则主要关注属级别（Robeson等人，2021年）。这种分类深度的差异可能会影响物种鉴定的准确性，尤其是在区分密切相关的分类群时。此外，每个数据库都有自己的参考序列和注释标准，这可能导致分类结果的不一致性。

本研究评估了在使用18S rRNA基因宏条形码分析牛Eimeria物种多样性时的各种因素和组合。比较了针对V4区域、V9区域以及包含V3和V4区域的Eimeria特异性18S rRNA片段的三种引物组合，以评估物种鉴定的准确性。同时，还比较了NCBI和SILVA数据库之间的分类学鉴定结果。最后，宏条形码结果通过常规PCR和克隆技术进行了验证。

章节摘录

样本收集和DNA提取

2014年5月至2015年10月期间，韩国共收集了32份患有腹泻的犊牛粪便样本。根据我们之前的研究，这些样本采用了含硝酸钠（比重：1.18）的粪便浮选法进行显微镜鉴定。随后通过常规PCR检测Eimeria的存在（Lee等人，2018年）。所有选定的样本通过这两种方法均检出Eimeria。

使用QIAamp Fast DNA Stool试剂盒从样本中提取DNA。

下一代测序结果和ASV计数

分别使用针对V4、V9和Pan-Eim-18S区域的引物组合，生成了137,538、76,810和251,200个paired-end读段。经过读段合并、质量过滤和去除嵌合体后，保留了57,505、19,650和52,289个非嵌合体读段。各目标区域的稀释曲线见补充图1，所有曲线均趋于稳定，表明测序深度足够。

为每个ASV分配分类学信息后，得到...

讨论

在三种测试条件下，Pan-Eim-18S分析揭示了最多的Eimeria物种及其丰度。V4和V9区域的分析显示了Eimeria序列的存在；然而，也扩增到了更多其他真核生物（如Cryptosporidium、Plasmodium、Besnoitia、Blastocystis、Entamoeba和Pentatrichomonas）等具有高丰度的真核生物。V4和V9区域对于分析粪便样本中的多种真核生物非常有用。

资金_support

本研究得到了韩国农业、食品和农村事务部动物与植物检疫局的支持 [Z-1543081-2026-28-02]。

CRediT作者贡献声明

李秀彬（Subin Lee）：撰写初稿、数据可视化、软件开发、实验设计、数据分析、数据管理。苏秀妍（So Youn Youn）：资源提供。徐民奎（Min-Goo Seo）：资源提供、审稿与编辑、结果验证、资金筹措、项目构思。李承勋（Seung-Hun Lee）：撰写与编辑、结果验证、项目监督、方法设计、资金筹措、项目构思。李香 Simulation（Hyang-Sim Lee）：资源提供。赵允桑（Yun Sang Cho）：资源提供。俞美宣（Mi-Sun Yoo）：资源提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Hee Won Shin女士在实验中的出色技术支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。