PKR-IN-C16通过p38 MAPK-CREB通路诱导Epstein-Barr病毒裂解性感染

《Virology》：PKR-IN-C16 induces Epstein-Barr virus lytic infection via p38 MAPK-CREB pathway

　　

作者：哈格·韩（Haige Han）、张一涵（Yihan Zhang）、李辉（Hui Li）、高莉（Li Gao）、冯文海（Wen-hai Feng）

中国农业大学生物科学学院分子设计与育种前沿科学中心，北京，100193

摘要

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）在潜伏期内与肿瘤有关，其从潜伏期转变为裂解期可导致宿主细胞裂解。因此，该病毒本身可能成为EBV相关肿瘤的潜在靶点。在本研究中，我们发现了一种小分子化合物PKR-IN-C16（C16），该化合物先前已被证明对治疗神经元炎症以及肝细胞癌和结直肠癌有效，并且具有诱导EBV裂解感染的能力。我们评估了C16在EBV阳性的上皮细胞和淋巴细胞中的效果，发现它通过激活EBV的IE基因BZLF1-（Z-）和BRLF1-（R-）启动子，以剂量依赖的方式诱导裂解感染并对EBV阳性肿瘤细胞产生杀伤作用。随后，通过用信号通路抑制剂预处理细胞，我们发现C16主要通过p38 MAPK通路诱导裂解。作为该通路下游的转录因子CREB被磷酸化并直接结合以激活Z启动子。同时，PKR敲低也能诱导EBV的裂解再激活。总体而言，我们的研究结果表明，PKR-IN-C16有可能作为治疗EBV相关肿瘤的裂解诱导剂。

引言

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）属于人类γ疱疹病毒亚科，感染了全球超过90%的人口，并能建立持久的终身感染。在人体内，EBV主要感染上皮细胞和B淋巴细胞。EBV在感染细胞中具有双相生命周期：潜伏感染和裂解感染。在潜伏感染阶段，病毒基因的表达仅限于核抗原（EBNAs）、潜伏膜蛋白（LMPs）、长非编码RNA（EBERs）和microRNAs。潜伏感染与多种恶性肿瘤相关，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和某些胃癌1, 2。另一方面，裂解复制可能导致宿主细胞裂解。因此，结合裂解诱导剂和抗病毒药物的裂解诱导疗法被认为是治疗EBV相关癌症的潜在策略3, 4, 5。目前已确认的裂解诱导剂包括生物因子6，以及化疗药物如5-FU、顺铂和多柔比星3, 7等化学化合物。这些因子能够将潜伏的EBV重新激活为裂解期，从而一方面对EBV阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤作用，另一方面增加抗病毒药物（如更昔洛韦和阿昔洛韦）的作用靶点4。

潜伏感染与裂解感染之间的转换通常由两个即早期病毒蛋白BZLF1（Zta）和BRLF1（Rta）控制。它们可以作为转录因子激活自身，彼此激活，并促进后续早期和晚期基因的表达。Zta和Rta分别受Z启动子和R启动子的调控，并可被多种转录因子激活。例如，Z启动子含有一系列顺式激活元件ZI、ZII和ZIII，这些元件负责与YY1、MEF2D、ATF-2、Zta等转录因子结合5, 8, 9, 10, 11。因此，EBV的裂解再激活受到多种细胞因子的协同作用控制。

蛋白激酶R（PKR）是一种广泛表达在多种细胞类型中的丝氨酸/苏氨酸激酶。其表达可被干扰素诱导，随后在响应双链RNA时，PKR通过同源二聚化和自磷酸化被激活。一旦激活，PKR可以磷酸化并抑制真核细胞起始因子eIF2α，从而抑制整体mRNA翻译和蛋白质合成，同时增加某些应激诱导蛋白的表达。在抗病毒先天免疫反应中，PKR充当细胞质RNA传感器12。此外，PKR还参与其他信号通路的调节，如NF-κB、MAPKs、肿瘤抑制因子p53和炎性小体通路的激活等13, 14, 15, 16。通过这些信号，PKR可能参与应激反应、诱导细胞凋亡、影响癌细胞的化学敏感性，并参与先天抗病毒反应13, 17。病毒可能编码多种机制来克服这些抗病毒机制。例如，在潜伏期间，EBV合成的EBERs可以形成茎环结构，与PKR上的双链RNA结合位点竞争。在裂解感染期间，EBV表达SM蛋白直接结合并抑制PKR18。

目前已有几种PKR抑制剂，包括2-氨基嘌呤（2-AP）、PKR-IN-C16和PKR-IN-C51。这三种化合物均为核苷酸类似物，竞争PKR上的ATP结合位点，从而抑制PKR的自磷酸化和激活。通过抑制PKR，它们可以增强整体mRNA翻译，下调促炎细胞因子的合成并减少细胞凋亡。在三种抑制剂中，PKR-IN-C16被认为更高效且具有更好的特异性，广泛用于研究PKR的功能19, 20, 21。C16最初被发现具有通过减轻神经炎症和神经细胞死亡来发挥神经保护作用22。最近的研究扩展了C16的抗炎作用，包括对多种细胞类型的作用，并改善肺部、心脏、肾脏和胰腺的损伤23, 24, 25, 26。此外，C16也被证明具有治疗肝细胞癌和结直肠癌的潜力。它可以有效地通过周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21抑制癌细胞生长，并抑制肿瘤血管生成27, 28。同时，持续释放C16可增强mRNA疗法在癌症治疗中的效果29。

鉴于C16在癌症治疗中的潜力以及PKR在细胞抗病毒反应中的作用，我们假设C16也可能影响EBV的生命周期，并可用于EBV相关癌症的治疗。在本研究中，我们证明了C16能够通过PKR-p38 MAPK-CREB通路诱导EBV裂解重新激活，并在体外杀死EBV阳性癌细胞。因此，像C16这样的PKR抑制剂有可能作为治疗EBV阳性癌症的化合物。

节选

细胞系

胃癌细胞系AGS购自美国类型培养物收藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。AGS-EBV细胞系是通过用实验室B-95-8菌株感染AGS细胞系建立的。LCL细胞系由吴雄文博士（中国同济医学院）提供。EBV阳性的原发性渗出性淋巴瘤细胞系JSC-1由兰凯博士（中国武汉大学）提供。伯基特淋巴瘤细胞系Raji和鼻咽癌细胞系HONE-1来自中国细胞基础设施（China Infrastructure of Cell）。

PKR-IN-C16在体外诱导上皮细胞和淋巴母细胞中的EBV裂解感染

为了确定PKR-IN-C16是否能够诱导EBV裂解感染，我们首先进行了Western blot实验，分析不同剂量（0、0.2、0.5和2 μM）C16处理48小时后AGS-EBV细胞中EBV裂解基因Zta、Rta和EAD的表达变化。结果表明，裂解蛋白的水平随C16处理剂量增加而增加（图1A）。接下来，为了确认mRNA水平也发生了类似变化，我们…

讨论

已知EBV与多种上皮和淋巴系统恶性肿瘤相关，因此针对感染细胞的裂解诱导疗法被认为是一种有前景的治疗EBV阳性癌症的方法。裂解诱导疗法包括裂解诱导剂，它们将EBV从潜伏状态重新激活为裂解状态，从而杀死宿主细胞，并与抗病毒药物（如更昔洛韦）联合使用，以减少病毒载量和传播3, 4, 34。目前，已有多种化合物被证明…

作者贡献声明

冯文海（Wen-hai Feng）：写作、审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。 高莉（Li Gao）：写作、审阅与编辑、研究、概念化。 李辉（Hui Li）：研究。 哈格·韩（Haige Han）：写作、审阅与编辑、初稿撰写、研究、正式分析。 张一涵（Yihan Zhang）：写作、审阅与编辑、初稿撰写、研究、正式分析。

利益冲突

作者声明没有财务利益冲突。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益和个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家基础研究计划（Grant 2011CB504305）的支持。