通过DNA宏条形码技术追踪葡萄牙港口中的海洋入侵物种，范围从海岸延伸至群岛地区

《Water Biology and Security》：Tracking marine invaders in Portuguese marinas by DNA metabarcoding from coast to archipelagos

　　安娜·S·拉夫拉多尔|伊内斯·阿方索|保拉·切亚尼奥|安娜·克里斯蒂娜·科斯塔|若昂·保罗·梅德埃罗斯|曼努埃拉·伊莎贝尔·帕伦特|保拉·帕雷蒂|帕特里西奥·拉马尔霍萨|罗纳尔多·索萨|佩德罗·E·维埃拉|菲利佩·O·科斯塔|索菲亚·杜阿尔特
分子与环境生物学中心（CBMA）及ARNET水生研究网络，米尼奥大学，瓜尔塔尔校区，4710-057，布拉加，葡萄牙

**摘要**
海洋非本地物种（NIS）主要通过船舶运输在码头和港口引入，对沿海生物多样性和生态系统功能构成重大威胁，因此需要有效的管理策略，尤其是用于早期检测的监测措施。本研究旨在全面了解葡萄牙10个休闲码头（大陆6个——维阿纳-杜卡斯特洛、波尔图、阿维罗（2个码头）和里斯本（2个码头）以及马德拉和亚速尔群岛各2个码头）中海洋无脊椎动物群落及NIS的地理分布情况。在每个码头，夏季期间分别从硬质基底、浮游动物和水样中采集了三份样本（用于eDNA分析），共获得111个样本。通过Illumina MiSeq测序技术对线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因（313 bp）和小亚基18S rRNA基因的V4区域（约400 bp）进行测序，共检测到21门类中的641个物种，其中39个是NIS（7个门类）。在所有码头中，仅有不到1%的物种和5%的NIS被同时检测到。亚速尔群岛的本土特有物种数量最多（97种），同时也有最多的NIS（6种）。相比之下，阿维罗的本土特有物种数量最少（38种），而北部和阿维罗的NIS数量最少（各1种）。不同样本类型的检测成功率也存在差异：浮游动物样本检测到的物种比例最高（64%），而岛上的硬质基底和大陆葡萄牙的水样检测到的NIS比例最高。主坐标分析表明，这些群落可分为三个主要组别：（1）维阿纳-杜卡斯特洛、波尔图和阿维罗；（2）里斯本；（3）马德拉和亚速尔群岛。这些组别之间的相似性与地理距离呈负相关，并与之前在卢西塔尼亚地区识别的生态区重叠。在亚速尔群岛首次记录到9种NIS，在马德拉群岛记录到1种。此外，还发现了许多NIS潜在的分布扩展趋势，主要沿大陆海岸方向（北部、南部或南北方向），这表明DNA metabarcoding技术在未来的国家海洋生物监测活动中具有巨大潜力。

**1. 引言**
非本地物种（NIS）的扩散对沿海生态系统的多样性和完整性构成严重威胁，常常导致显著的生态变化（Rilov和Crooks，2009）。这些物种通过人类活动传播，无论是有意还是无意，都会通过改变生物相互作用（竞争、捕食、寄生虫和疾病的引入）和/或改变环境条件来重塑生态系统（Bax等，2003；Crooks，2002；Grosholz，2002）。无脊椎动物是最常见的欧洲海洋NIS（Zenetos等，2022）。它们的主要传播途径是航运，无论是商业运输还是休闲活动（Clarke Murray等，2014；Sardain等，2019）。随着全球贸易和休闲垂钓活动的增加，码头和港口已成为海洋和咸水NIS引入的关键热点（Bulleri和Chapman，2010；Connell，2000）。这些物种通过附着在船体表面或通过压载水传播，有时会在抵达后定居在码头和港口的人造结构上（Carlton，1985；Drake和Lodge，2007）。一些最初引入港口环境的非本地物种能够在相邻的自然生态系统中建立可行的种群并繁衍，从而造成生态和经济影响；这种二次传播通常由休闲船只促进，是多个空间尺度上的入侵动态的关键组成部分（Bailey等，2020；Clarke Murray等，2012；Hewitt和Campbell，2010；Sempere-Valverde等，2024）。生态影响包括本土物种的替代、栖息地结构的改变、食物网的改变以及生态系统功能的改变（Tsirintanis等，2022）。从经济角度来看，这些入侵可能导致海洋基础设施维护成本增加、渔业产量减少以及需要昂贵的管理措施，包括根除、控制和抑制工作（Lovell等，2006）。应对这一挑战需要国际间的协调努力，特别是针对航运活动的监测和管理（Miralles等，2021）。
管理NIS既成本高昂又复杂，因此有效的监测计划对于早期检测、追踪及其对本土生态系统的影响至关重要（Hulme，2009；Leung等，2002；Occhipinti-Ambrogi和Savini，2003）。欧盟（EU）制定了《海洋战略框架指令》（MSFD），要求所有成员国保护并维护海洋环境（欧洲议会和理事会，2008）。该指令要求成员国制定策略，力争在2020年前实现良好环境状态（GES），并提供关于其海洋环境及人类活动影响的详细评估。具体条款D2专门针对NIS，要求每个成员国监测其存在情况并进行风险评估（Tsiamis等，2019）。为此，法国、丹麦和荷兰等国已发布了相应的海洋NIS评估指南（Gittenberger等，2023；Jensen等，2023；Massé等，2023）。在葡萄牙，首次为亚速尔群岛（Cardigos等，2006）和马德拉群岛（Canning-Clode等，2013）列出了NIS清单，并于2015年发布了针对葡萄牙大陆、马德拉和亚速尔群岛沿海生态系统的全国性评估报告，基于文献回顾和沿海生态系统采样调查结果。共识别出133种NIS，其中85种（约64%）为海洋和咸水无脊椎动物（Chainho等，2015）。《海洋生物引入和转移工作组》（WGITMO）为葡萄牙编制的年度报告显示，葡萄牙沿海地区共有211种NIS，其中亚速尔群岛和马德拉群岛有53种无脊椎动物，大陆葡萄牙有119种（ICES，2022）。这些评估结果已反映在MSFD报告中关于马德拉、亚速尔群岛、大陆和大陆平台的D2条款中，最新更新将于2025年发布，作为MSFD第三轮实施的结果。葡萄牙还基于亚速尔群岛和马德拉群岛（Castro等，2022，2023；Parretti等，2020；Png-Gonzalez等，2021）以及大陆葡萄牙（Chebaane等，2023；Ribeiro等，2023）的零星研究项目定期发布了NIS评估报告。尽管在多个休闲码头使用PVC定居板（Souto等，2018）和刮取硬质基底固定区域（Afonso等，2020；Ribeiro等，2023）进行过偶尔的NIS调查，但这些评估并不连续，也没有采用一致的方法论或监测区域。此外，在大多数葡萄牙的海洋NIS调查中，这些物种仅通过形态学方法进行鉴定（Afonso等，2020；Chainho等，2015；Chebaane等，2023；Encarna??o等，2024；Piló等，2021；Rubal等，2021）。虽然这些传统方法在评估葡萄牙的NIS状况方面发挥了重要作用，但存在若干显著局限性。仅依赖形态分类学进行海洋NIS鉴定是一个缓慢且劳动密集的过程，需要丰富的系统发育分类学专业知识，而这类专业知识正逐渐减少（Hopkins和Freckleton，2002；Kim和Byrne，2006）。这一限制妨碍了管理当局快速响应的需求。此外，这些方法在早期识别低丰度或空间受限区域的NIS方面效果较差（Walsh等，2018）。早期检测可以提高成功遏制或根除NIS的机会，避免其广泛扩散（Ojaveer等，2018；Zanden等，2010）。为克服上述挑战，DNA metabarcoding因其在处理大量环境样本方面的有效性而被广泛用于生物监测项目，从而实现快速准确的生物多样性评估（Duarte等，2021）。通过从环境样本中提取DNA、扩增特定基因组片段并通过高通量测序（HTS）处理，可以在分子水平上准确识别物种（Cristescu等，2014；Rey等，2020；Taberlet等，2012）。该方法还克服了传统生物监测方法中的常见难题（如幼体/小型生物的鉴定、低密度样本或隐秘分类单元的识别），同时与传统形态分类学方法具有可比性和互补性（Holman等，2019；Keck等，2022；Pochon等，2013）。该技术在NIS评估中非常有用，因为它允许更大范围的采样，并支持在NIS造成显著影响之前的早期识别（Steinke等，2022；Zaiko等，2015）。在葡萄牙，仅有少数研究使用DNA metabarcoding来调查海洋/咸水NIS（Azevedo等，2020；Lavrador等，2024）；目前尚未有使用该方法进行全国性海洋无脊椎动物NIS评估的案例。

**2. 材料与方法**
**2.1. 采样地点**
采样于2020年6月至7月在葡萄牙大陆、马德拉和亚速尔群岛的10个休闲码头进行（图1，表S1），包括葡萄牙北部的维阿纳-杜卡斯特洛和波尔图大西洋码头；阿维罗的科斯塔诺瓦和雅尔丁奥丁码头；里斯本的阿尔坎塔拉和奥埃拉斯码头；马德拉岛的丰沙尔和金塔多洛德码头；以及亚速尔群岛的维拉弗兰卡多坎波和蓬塔德尔加达码头。同一地区的码头之间的距离从阿维罗的3公里到葡萄牙北部的约57公里不等。

**图1.** 葡萄牙大陆及马德拉和亚速尔群岛，红色点表示采样码头的位置。为便于区域比较，将码头分为五个区域：北部（维阿纳-杜卡斯特洛、波尔图大西洋）、阿维罗（科斯塔诺瓦、雅尔丁奥丁）、里斯本（阿尔坎塔拉、奥埃拉斯）、马德拉（金塔多洛德、丰沙尔）和亚速尔群岛（维拉弗兰卡多坎波、蓬塔德尔加达）。雅尔丁奥丁码头是最小的码头，仅有不到100个停靠位，适用于长度不超过12米的船只；而蓬塔德尔加达码头是最大的码头，拥有最多640个停靠位，适用于长度不超过90米的船只。其余码头共有100–300个停靠位，适用于长度不超过30米的船只。所有调查的码头均为休闲码头，部分码头也接纳小型渔船。

**2.2. 样本收集、处理和DNA提取**
每个码头收集了三种类型的样本：
（1）硬质基底上的污损生物群落（例如浮筒，在退潮时可从表面接触）：刮取后放入22 × 22厘米（深5厘米）的托盘中直至装满，然后连同相应地点的水样一起转移到密封袋中。当有可用材料时，还包括来自绳索和浮标的样本，从而在每个采样点得到了多种硬质结构的复合样本；（2）在大约1米深度处收集了1升水样本，并将其放入聚丙烯烧瓶中；（3）使用浮游生物网（网孔大小为55微米，长度100厘米，开口直径40厘米）收集浮游动物，每次采样沿着水柱进行大约45秒的三个倾斜拖网操作，深度为3.5-4米，然后将样本收集到1升聚丙烯烧瓶中。所有聚丙烯烧瓶事先都用10%的漂白剂清洗过，并用MilliQ水冲洗过。每个码头都运送了装有MilliQ水的1升空白对照样本，并在整个分析过程中与生物样本一起处理。虽然这些对照样本有助于识别现场和交叉污染，但我们承认它们可能无法完全捕捉到在实验室处理硬质基底样本过程中引入的污染，尽管在所有处理步骤中都采取了额外的预防措施来尽量减少这种风险（见下文）。所有样本在4℃下保存最多24小时，直至进一步处理。为了确保空间代表性，在每个码头的四个不同位置分别采集了每种类型的四个样本。虽然大多数码头（葡萄牙大陆的六个码头和亚速尔的蓬塔德尔加达）都按照描述的方法进行了采样，但由于物流限制，马德拉的两个码头（丰沙尔和金塔多洛德）没有浮游动物样本。在亚速尔，维拉弗兰卡多坎波只收集了硬质基底的三个样本，但其他两种类型的样本各收集了四个。从硬质基底上收集的生物以及密封袋中的水都通过一个之前已经用10%漂白剂处理过的500微米孔径的筛子进行筛选。筛选出的生物被储存在-20℃的绝对乙醇中。这些生物的DNA提取采用了基于硅胶柱的方法。首先将它们在裂解缓冲液（100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA pH 8.0和0.5% SDS）中孵育过夜，然后通过硅胶柱进行离心、结合和纯化（Lavrador等人，2024；Steinke等人，2022）。用于eDNA分析的水、空白对照样本的水以及浮游动物样本都通过0.45微米孔径的过滤器（S-Pak Filters，Millipore，Sigma，贝灵顿，马萨诸塞州，美国）过滤；随后根据制造商的说明使用DNeasy PowerSoil试剂盒（Qiagen，希伦，德国）从一半的过滤器中提取DNA。在整个分析过程中都处理了空白对照样本，特别是在DNA提取步骤中，以评估试剂和实验室器具可能带来的污染。在mothur软件中完成合并和引物修剪处理后，分别有3,350,112个（占68%）和3,276,179个（占79%）读段被上传到mBrave和SILVAngs平台，用于COI和18S数据的处理。其中，1,490,180个读段被分配给了COI数据集，2,627,643个读段被分配给了18S数据集。最终，955,109个和745,167个读段被识别为海洋和咸水无脊椎动物（分别对应COI和18S数据），其中44%和14%的读段被归类为入侵物种（见表S3和S4）。唯一产生序列的阴性对照样本是来自Ponta Delgada码头的水生环境DNA阴性对照样本，且这种情况仅发生在18S标记中。该阴性对照样本使用了与其它18S样本相同的协议通过mothur和SILVAngs进行处理。所有在该阴性对照样本中检测到的条目随后都被从相应的水样中移除。对于剩余的分析，当两个标记都识别出相同物种时，通过累加读段数量来合并数据。尽管使用了两种不同的遗传标记，但所有分析都是基于存在-缺失数据的；因此，读段数量的累加并未影响研究的最终结果。

3.2. 不同地区检测到的物种和入侵物种的差异
在十个码头共检测到641种海洋/咸水无脊椎动物，其中39种为入侵物种（图2；表S7和S8）。按码头和标记详细列出的检测结果见表S6。总体而言，葡萄牙大陆北部的物种数量最多（295种），其次是亚速尔群岛（275种），里斯本和阿威罗（分别为259种和258种），而马德拉群岛的物种数量最少（163种）。在入侵物种方面，亚速尔群岛的数量最多（24种），而马德拉群岛的数量最少（11种）。

分析十个码头之间的差异时，维阿纳杜卡斯特洛（北部）检测到的物种数量最多（220种），而丰沙尔（马德拉）的数量最少（111种）。亚速尔群岛检测到的入侵物种数量最多（22种），而马德拉群岛的数量最少（7种）。总体而言，所有码头中仅检测到0.78%的总物种和5%的入侵物种。亚速尔群岛检测到的特有物种和入侵物种数量最多，而阿威罗和葡萄牙大陆北部检测到的数量最少（针对入侵物种而言）（图2）。统计比较显示，葡萄牙大陆和马德拉群岛之间的本地物种数量没有显著差异（p = 0.208），葡萄牙大陆和亚速尔群岛之间也没有显著差异（p = 0.824）。同样，不同地区之间的入侵物种丰富度也没有显著差异（p = 0.299），葡萄牙大陆和岛屿之间也没有显著差异（p = 0.385）。

在分类组成方面，优势门类为环节动物门、节肢动物门和软体动物门，存在明显的地区差异：环节动物门在北部和马德拉群岛都很常见（占比高达25%）；节肢动物门在阿威罗占主导地位（占比高达24%）；软体动物门在里斯本和亚速尔群岛占主导地位（每个地区占比高达29%），但在马德拉群岛的检测频率较低（仅占10%）。还有其他独特的模式，例如仅在北部和阿威罗码头检测到的轮虫门，以及亚速尔群岛某个码头未检测到的海鞘门。海鞘门在里斯本、马德拉群岛和亚速尔群岛更为常见，而节肢动物门在亚速尔群岛的占比低于其他四个地区（图3）。

大多数检测到的入侵物种属于节肢动物门（占比39%至63%）。非本土苔藓虫仅在马德拉群岛和亚速尔群岛检测到；环节动物门主要在北部和科斯塔诺瓦（阿威罗）检测到，而在奥埃拉斯（里斯本）和两个马德拉群岛的码头未检测到任何环节动物门入侵物种。非本土软体动物的数量在马德拉群岛和波尔图阿特兰蒂科（北部）的码头中最少。

3.3. 不同样本类型中检测到的物种和入侵物种的差异
总体而言， zooplankton样本中恢复的物种比例最高（63.6%），而水样样本中恢复的物种比例最低（51%）。按地区划分，北部、里斯本和亚速尔群岛的zooplankton样本中检测到的物种比例最高（分别为69.8%、66.4%和58%），而硬基底样本在阿威罗（62%）和马德拉群岛（76.1%）中恢复的物种比例最高（图4，表S7）。在葡萄牙大陆，水样中恢复的地区特异性入侵物种比例最高（84%），而硬基底样本和zooplankton样本各恢复74%。在马德拉群岛和亚速尔群岛，硬基底中检测到的入侵物种比例最高（分别为81%和77%），而水样在马德拉群岛中恢复的入侵物种比例最低（71%），zooplankton样本在亚速尔群岛中恢复的入侵物种比例最低（58%）（图4，表S8）。

跨码头比较，不同样本类型的分类组成存在差异。在硬基底中，环节动物门和节肢动物门在大多数地区占主导地位，软体动物门在里斯本码头也很突出。值得注意的是，阿威罗码头之间存在差异，科斯塔诺瓦以环节动物门为主，而贾丁诺特码头则表现出环节动物门、节肢动物门和软体动物的均衡分布（图4）。在水生环境DNA中，不同码头的分类组成更为多样。环节动物门、节肢动物门和软体动物门在维阿纳杜卡斯特洛（北部）、两个阿威罗码头和奥埃拉斯（里斯本）中占主导地位。然而，在波尔图阿特兰蒂科（北部）和昆塔多洛德（马德拉）中，多孔动物门是最主要的门类之一。在亚速尔群岛，环节动物门、软体动物门和多孔动物门的分布更为平衡。软体动物门在阿尔坎塔拉（里斯本）占主导地位，而在马德拉群岛则环节动物门占主导（图3）。

主坐标分析（PCoA）将所有物种群落分为三组：（1）北部和阿威罗；（2）里斯本；（3）马德拉群岛和亚速尔群岛。该分析还揭示了这些组内样本类型之间的群落结构差异（图5）。PERMANOVA分析支持了这些结论，因为在不同码头之间以及样本类型之间发现了显著的物种组成差异（Pseudo-F = 6.60，R2 = 0.285，p = 0.001），并且在码头与样本类型之间的交互作用也具有显著性（Pseudo-F = 2.91，R2 = 0.224，p = 0.001）。然而，PERMDISP分析也检测到码头之间存在显著的分布差异（F = 3.78，p = 0.001）以及样本类型之间的差异（F = 19.76，p = 0.001），这表明群落变异性的差异可能部分解释了PERMANOVA的结果（表S9）。成对比较显示，在所有十个码头中，每种样本类型内的群落结构均有显著差异（p < 0.05）（表S10）。同样，在每种样本类型内，十个码头之间的群落组成也存在显著差异（p < 0.05；表S11）。

为了进一步评估入侵物种群落是否反映了整体群落模式，我们比较了整个群落和仅入侵物种的Jaccard差异矩阵。Mantel检验显示两个矩阵之间存在显著相关性（r = 0.63，p = 0.001），表明入侵物种的空间结构大致反映了整个大型无脊椎动物群落的结构。然而，入侵物种的平均Jaccard差异显著低于整个群落（0.80 vs 0.89）（Welch's t检验，p < 0.001），表明入侵物种群落在码头间的同质性更高（表S12）。线性回归分析还显示出相似性与地理距离之间的负相关关系（p < 0.001），表明随着地理距离的增加，无脊椎动物群落的相似性降低。回归模型显示距离可以解释62%的无脊椎动物群落结构变异（图6，表S12）。

3.4. 通过DNA宏条形码检测到的入侵物种与MSFD列表中报告的入侵物种的比较
在本研究中，使用DNA宏条形码在葡萄牙大陆、马德拉群岛和亚速尔群岛共检测到39种入侵物种。其中，26种入侵物种出现在六个大陆码头，11种出现在马德拉群岛，24种出现在亚速尔群岛（图7，表S13、S14和S15）。

将这些发现与最新的全国入侵物种列表（MSFD 2019年和2025年的报告）进行比较，发现了新的入侵物种和分布模式。在葡萄牙大陆，本研究中检测到的26种入侵物种中有9种在MSFD报告中未被分类为入侵物种（即当时未包括或未归类为入侵物种），但后来被确认为该地区的入侵物种（ICES，2022年）。例如，海葵Diadumene lineata（Verrill, 1869）、管状水螅Ectopleura crocea（Agassiz, 1862）以及河口端足类Grandidierella japonica Stephensen, 1938）。此外，一些入侵物种的分布与先前报告不同。例如，先前仅在里斯本检测到的藤壶Balanus trigonus Darwin（1854）现在已在所有六个大陆码头都被检测到。同样，以前仅在葡萄牙大陆南部检测到的日本牡蛎Magallana gigas（Thunberg, 1793）现在也在里斯本的阿尔坎塔拉码头被检测到。在马德拉群岛，两种入侵物种Laticorophium baconi（Shoemaker, 1934）和Mytilus spp.（整个属在马德拉群岛被视为非本土物种）未列入MSFD列表，但后来被确认为入侵物种并在丰沙尔码头被检测到。在亚速尔群岛，本研究中检测到的九种入侵物种未列入该地区的MSFD列表，其中包括牡蛎Ostrea stentina Payraudeau（1826）、端足类L. baconi和贻贝Musculus lateralis（Say, 1822）。讨论
本研究采用基于DNA分子条形码技术，对卢西塔尼亚省下游三个生态区域的10个码头中的海洋和咸淡水无脊椎动物群落及非本地物种（NIS）进行了全面调查，这些码头涵盖了大陆和岛屿地点。我们采用了多组分方法，结合了三种截然不同的样本类型（包括水中的环境DNA，eDNA）、现场重复样本以及两个目标基因组区域，从而在一次调查中检测到了来自21个门的641种海洋无脊椎动物物种，其中39种为非本地物种。

关于我们的第一个假设，正如预期的那样，所研究群落的多样性和结构在各个码头之间存在显著差异。这种差异也体现在葡萄牙大陆不同地区之间以及葡萄牙大陆与岛屿之间，这一点通过主成分分析（PCoA）得到证实，无脊椎动物群落被分为三个主要组：（1）葡萄牙大陆北部和阿威罗地区；（2）里斯本地区；（3）马德拉和亚速尔群岛地区。这与先前的生物地理生态区域和省份划分相一致（Spalding等人，2007年），即葡萄牙大陆属于南欧大西洋大陆架生态区，而马德拉和亚速尔群岛则属于亚速尔-加那利-马德拉生态区。将群落划分为这三个区域也支持了葡萄牙海洋基金会（MSFD）提出的葡萄牙大陆划分（ME、SRMP、SRAPA，2025年）。本研究中观察到的群落相似性与地理距离之间的负相关关系也是预期之中的，因为遥远地区的环境特征和生态相互作用往往不同，从而导致不同的生物群落形成（Blanchette等人，2008年；Soininen等人，2007年）。与人们预期的情况相反，尽管葡萄牙大陆的码头可能面临更多的海上交通影响，但实际上检测到的非本地无脊椎动物物种的比例在各码头之间相差不大（6%至10.3%）。亚速尔群岛的维拉弗兰卡德坎波码头检测到的非本地物种比例最高（10.3%），而庞塔德尔加达码头（同样位于亚速尔群岛）检测到的非本地物种数量最多（22种）；马德拉的金塔多洛德码头检测到的非本地物种比例最低（6%），数量也为7种。马德拉地区物种丰富度较低可能是因为缺乏浮游动物样本。亚速尔群岛的结果验证了Chainho等人（2015年）的研究结论，他们发现该地区非本地物种的普遍性较高，这可能与当地生态位的可用性较高以及自然物种多样性较低有关。不过，尽管葡萄牙大陆的码头可能受到更多海上交通的影响，但所有码头检测到的非本地物种比例相似。

另一方面，尽管本研究发现亚速尔群岛的非本地物种数量较多，但本地物种的总数在葡萄牙大陆和两个岛屿地区之间没有显著差异。此外，非本地物种的丰富度在各地区之间也相当，这表明非本地物种的分布可能受到其他因素的影响。我们还不能完全排除亚速尔群岛可能受到来自更广泛地区的海上交通影响的可能性。最后，将MSFD报告中的非本地物种名录与我们研究检测到的物种进行比对后，发现了葡萄牙大陆9种新的潜在非本地物种记录，马德拉群岛2种，亚速尔群岛2种（详见下一小节）。

4.1. 葡萄牙大陆、马德拉群岛和亚速尔群岛的非本地物种记录及分布扩展
通过DNA分子条形码技术，在葡萄牙大陆、马德拉群岛和亚速尔群岛共检测到39种非本地物种。在葡萄牙大陆的6个码头中，26种非本地物种主要属于甲壳类、海鞘类和软体动物门。其中9种在MSFD报告中未被归类为非本地物种（即要么未被包括在内，要么在当时未被归类为非本地物种），但根据这些地区的最新知识，它们被认定为非本地物种（ICES，2022年），包括海葵Diadumene lineata、管状水螅Ectopleura crocea和河口端足类Grandidierella japonica（表S13）。与MSFD报告的对比显示了一些差异：
（1）Balanus trigonus此前仅在里斯本地区有记录，现在在所有6个大陆码头都有发现；
（2）日本牡蛎Magallana gigas此前仅限于南部地区，现在在阿尔坎塔拉码头（里斯本）也有发现；
（3）Grandidierella japonica在维阿纳杜卡斯泰洛（北部）和科斯塔诺瓦（阿威罗）也有发现，而此前仅在阿尔加维地区有记录（Vieira等人，2024年）；
（4）Diadumene lineata此前仅在阿威罗有记录（Piló等人，2021年；Sousa，2016年）；
（5）Ectopleura crocea、Musculus lateralis和端足类Jassa slatteryi Conlan 1990年首次在阿威罗和里斯本被发现，扩展了先前仅在葡萄牙北部地区的记录范围（Azevedo等人，2020年；Lavrador等人，2024年）；
（6）桡足类Oithona davisae Ferrari F.D. & Orsi, 1984首次在里斯本被发现，此前仅在葡萄牙北部有记录（Lavrador等人，2024年）；
（7）被囊动物Perophora japonica Oka, 1927年首次在阿威罗和里斯本被发现，此前仅在阿尔加维（阿尔布费拉）有记录（Chainho，2020年）；
（8）桡足类Pseudodiaptomus marinus Sato, 1913此前仅在北部/阿威罗地区有记录，现在也在里斯本被发现（表S13）。

这些新记录表明非本地物种可能正在向新的地区扩展；然而，需要进一步的研究，特别是形态学评估来确认它们的存在和分布。对于基于DNA的物种鉴定来说，使用的标记和样本类型都非常重要。对于固着生物而言，水中检测到的DNA（eDNA）可能反映了短暂的DNA传输或细胞外信号，而非稳定的种群。大量采样或实体标本通常能更准确地反映当地物种的存在。相比之下，水中的eDNA可能包含来自远处来源的细胞外碎片或沉积物重新悬浮的DNA，这使得推断原位生物的存在变得复杂（Koziol等人，2019年；Lavrador等人，2024年）。因此，这些结果应被视为需要后续形态学调查或重复采样的警示信号，以确认物种的实际存在和分布。

关于研究中发现的另外两种非本地物种：
- 桡足类Mytilicola intestinalis Steuer, 1902（贻贝的寄生虫）此前已在葡萄牙有记录（Francisco等人，2010年），但由于最后一次记录是在十多年前，因此无法确定我们的发现是否属于新记录。考虑到该物种在加利西亚也有记录（Paul，1983年），其在葡萄牙的存在并不令人惊讶，事实上在葡萄牙北部的分子条形码研究中也曾被发现过（Hollatz等人，2017年）。这种寄生物种可能已经存在多年但未被发现，这突显了分子工具在识别不显眼或报道不足的物种方面的价值。
- 多毛类动物Polydora onagawaensis Teramoto, Sato-Okoshi, Abe, Nishitani和Endo, 2013此前仅在北部地区有记录（Lavrador等人，2024年），在本研究中也得到了确认。
- 被囊动物Ampithoe valida S.I. Smith, 1873虽然被MSFD列为非本地物种，但由于证据表明其广泛分布于各处，因此不再被视为非本地物种（Harper等人，2022年）。

在马德拉群岛，我们检测到11种非本地物种，其中大多数是节肢动物和被囊动物（表S14）。其中值得一提的是，端足类Laticorophium baconi首次在马德拉群岛获得分子学确认（此前未列入MSFD名录，但现在被归类为非本地物种，Guerra-García等人，2023年）。在本研究中，它于2020年6/7月在丰沙尔码头被分子学检测到，并在2022年1月在卡尔赫塔码头（距丰沙尔码头约26公里处）通过形态学评估得到确认（Guerra-García等人，2023年）。该地区还出现了另外两个值得注意的案例：
- 被囊动物Botryllus schlosseri（Pallas，1766）虽然被MSFD列为非本地物种，但后来被重新分类为隐存种（Castro等人，2022年），因此在本研究中未被视为非本地物种；
- 水螅类Ectopleura crocea此前在马德拉群岛被列为非本地物种（Chainho等人，2015年），但在我们的研究中未通过DNA分子条形码技术检测到。

在亚速尔群岛，共检测到24种非本地物种，其中8种是首次获得分子学确认的物种，包括水螅类Cordylophora caspia（Pallas，1771）、端足类Jassa slatteryi、Laticorophium baconi、Musculus lateralis、桡足类Oithona davisae和Pseudodiaptomus marinus、牡蛎Ostrea stentina以及多毛类Polychora paucibranchiata（Okuda，1937）。藤壶Austrominius modestus（Darwin，1854）也是亚速尔群岛的首次分子学记录，尽管其作为新记录的地位存在一些争议（Gruvel，1907年曾报道过其在圣米格尔岛的存在，但随后多位学者对其存在提出质疑）。

这些新记录表明非本地物种可能正在向新的地区扩散；然而，需要进一步的形态学研究来确认它们的存在和分布。对于基于DNA的物种鉴定，使用的标记和样本类型都非常关键。对于固着生物，水中检测到的DNA（eDNA）可能反映了短暂的DNA传输或细胞外信号，而不是稳定的种群。大量采样或实体标本通常能更准确地反映当地物种的存在。相比之下，水中的eDNA可能包含来自远处来源的细胞外片段或沉积物重新悬浮的DNA，这使得推断原位生物的存在变得复杂（Koziol等人，2019年；Lavrador等人，2024年）。因此，这些结果应被视为需要进一步形态学调查或重复采样的警示信号。

至于研究中发现的另外两种非本地物种：
- 桡足类Mytilicola intestinalis Steuer, 1902（贻贝的寄生虫）此前在葡萄牙也有记录（Francisco等人，2010年），但由于最后一次记录已过去十多年，因此无法确定这是否代表新发现。
- 多毛类Polydora onagawaensis Teramoto, Sato-Okoshi, Abe, Nishitani和Endo, 2013首次在北部地区被发现（Lavrador等人，2024年），并在本研究中得到了确认。
- 被囊动物Ampithoe valida S.I. Smith, 1873虽然被MSFD列为非本地物种，但由于证据表明其广泛分布，因此不再被视为非本地物种（Harper等人，2022年）。

在马德拉群岛，我们检测到11种非本地物种，其中大部分是节肢动物和被囊动物（表S14）。值得注意的是，端足类Laticorophium baconi是首次在马德拉群岛获得分子学确认的物种（此前未列入MSFD名录，但现在被归类为非本地物种，Guerra-García等人，2023年）。在本研究中，它于2020年6/7月在丰沙尔码头被分子学检测到，并在2022年1月在卡尔赫塔码头（距丰沙尔码头约26公里处）通过形态学评估得到确认（Guerra-García等人，2023年）。在我们的研究中，A. modestus 也在两个码头被检测到，而之前仅在阿威罗河口发现的 A. amphitrite 现也在北部的维安娜-杜卡斯特洛被检测到，这可能表明该物种的分布范围正在扩大。四年前，在同一区域（莱肖恩斯港），还发现了尾索动物 Ciona intestinalis（Linnaeus, 1767）和 Botryllus schlosseri（在波尔图大西洋被发现），并进行了形态学鉴定（Azevedo 等，2020）。Azevedo 等人（2020）通过 COI 标志物分子检测到的 27 种外来物种中，藤壶 Austrominius modestus、水螅 Bougainvillia muscus（Allman, 1863）、水母 Clytia hemisphaerica（Linnaeus, 1767）、海绵 Halichondria panicea（Pallas, 1766）、藤壶 Perforatus perforatus（Bruguière, 1789）和螃蟹 Pilumnus hirtellus（Linnaeus, 1761）也在我们的研究中再次被检测到，这表明它们持续存在。然而，我们仅将 A. modestus 视为外来物种，因为 Perforatus perforatus 目前仅在亚速尔群岛被认为是外来物种。在我们的研究之后，在 2021/2022 年对维安娜-杜卡斯特洛码头附近的利马河口的分子浮游动物进行评估时，也检测到了 Austrominius modestus、藤壶 Balanus trigonus、桡足类 Pseudodiaptomus marinus 和多毛类 Pseudopolydora paucibranchiata（Moutinho 等，2023），这表明这些外来物种可能已经在这个码头建立起来。在里斯本，非本地端足类 Caprella scaura Templeton（1836）最初于 2016 年在奥埃拉斯和阿尔坎塔拉码头外被发现（Afonso 等，2020），四年后又在奥埃拉斯码头内被检测到。如果通过额外的形态学和分子评估得到证实，这可能表明这些物种正在从外部区域扩散到码头内部，或者相反。应进一步进行生态学研究，以评估它们向娱乐码头扩散的模式，并确定可能导致这些扩散的潜在因素（例如，娱乐船只活动、自然扩散）。在马德拉岛，最初于 2017 年在昆塔-多-洛德码头外发现的藤壶 Balanus trigonus 现也在码头内被检测到，同时还有海葵 Exaiptasia diaphana（Rapp, 1829）也被再次检测到（Diem 等，2023；Ramalhosa 等，2019）。这两种物种以及苔藓虫 Bugula neritina（Linnaeus, 1758）也在 2018 至 2020 年对昆塔-多-洛德码头的评估中被识别出来（Castro 等，2023），并在随后的 2021/2022 年研究中被再次发现（Sempere-Valverde 等，2023），进一步证实了这些外来物种在马德拉岛的存在。在亚速尔群岛，我们在研究中检测到的八种外来物种——Botryllus schlosseri、Branchiomma luctuosum、Bugula neritina、Clavelina lepadiformis、Kirchenpaueria halecioides、Microcosmus squamiger、Perforatus perforatus 和 Mytillus spp. 也在蓬塔德尔加达码头被先前识别出来（Castro 等，2023；Chainho 等，2015），这加强了 DNA 测序技术在识别本地建立的外来物种方面的有效性。然而，一些以前通过形态学方法在这些码头识别出的物种在我们的研究中使用 DNA 测序技术并未被检测到。例如，2017/2018 年在丰沙尔和昆塔-多-洛德码头附近进行的水下评估中发现的螃蟹 Cronius ruber（Lamarck, 1818）在我们的研究中未被检测到。这种差异可能是由于研究之间的采样深度不同（我们的分析集中在大约 1 米深的表层水中和大量生物上，而另一项研究的采样深度在 4 米到 11 米之间）或者是这种物种在这两个码头未能成功建立。此外，马德拉岛浮游动物样本的有限可用性可能阻碍了幼体 DNA 的检测。尾索动物 Didemnum vexillum Kott（2002）在 2016/2017 年在波尔图大西洋被发现（Azevedo 等，2020），但在我们的研究中通过 DNA 测序技术未能检测到。这个物种仅在 Azevedo 团队评估的十二个月中的两个月（二月和三月）中被发现，这可以解释为什么在 2020 年六月的样本中没有出现。藤壶 Amphibalanus improvisus（Darwin, 1854）和苔藓虫 Tricellaria inopinata d’Hondt 和 Occhipinti Ambrogi（1985）在我们的研究中未被检测到，但在随后在利马河口（靠近维安娜-杜卡斯特洛码头）进行的浮游动物评估中被检测到（Moutinho 等，2023）。我们认为定期在这个码头进行评估将很有意义，以确定这些检测代表新的引入还是已经建立但最近重新引入的外来物种。然而，这些分子研究之间的差异也可能归因于方法上的差异。实际上，在 2020/2021 年我们在维安娜-杜卡斯特洛和波尔图大西洋码头进行的研究中，使用了五种样本类型（包括硬质基底、水和浮游动物，第二次采样时间与本研究的时间相同），在 2020 年的三月和六月分别在维安娜-杜卡斯特洛和波尔图大西洋检测到了 Tricellaria inopinata 和 Ciona intestinalis（Lavrador 等，2024），但在当前的研究中没有检测到。这种差异可能是由于对相同分子数据进行了重新分析，因为读序列在初始研究后五个月提交给了 mBRAVE 和 Silvangs。随着参考数据库（特别是 BOLD）的不断更新，同一组测序数据在不同时间上传时可能会产生不同的分子鉴定结果。将我们的结果与葡萄牙最近的外来物种评估进行比较时，出现了两个值得注意的情况。Laticorophium baconi 在葡萄牙最北端的记录来自辛斯（2019年）（Guerra-García 等，2023），在我们的研究中仅在马德拉岛和亚速尔群岛被检测到；而 Branchiomma luctuosum 在 2019 年的法罗（葡萄牙大陆南部）的评估中被发现（Fernández-Romero 等，2021），在我们的研究中仅在马德拉岛被检测到（但在丰沙尔只有一次读序列），在亚速尔群岛被认为是外来物种。如前所述，这些研究之间的差异并不一定意味着我们研究中新检测到的外来物种是在研究间隔期间引入或已经在码头建立。同样，我们研究中未检测到先前在这些码头报告的外来物种并不一定意味着它们已经消失。使用 DNA 测序技术检测物种时的差异可以归因于方法上的差异，例如采样期的不同（例如 Moutinho 等人（2023）的三个采样期与我们研究的一个采样期，没有重叠）、样本类型、生物信息学流程以及分子数据库的持续更新（例如，对维安娜-杜卡斯特洛和波尔图大西洋的分子数据重新分析产生了不同的结果）。这些因素显著影响了不同研究中的物种检测。因此，应仔细分析这些差异，因为它们不一定表示检测到的物种确实存在或不存在。通过严格和标准化的监测，这些数据可以首次实现分子检测并跟踪社区组成的变化。

4.3. 使用 DNA 测序技术进行外来物种评估的优势和局限性
DNA 测序技术在海洋和沿海生态系统的外来物种评估中具有显著优势，与传统形态学方法相比。它能够快速准确地识别环境样本中的广泛物种，可以提供更高的分类学分辨率（取决于标记的选择），并且特别适用于早期检测外来物种。它还可以检测通过视觉评估难以发现的小型物种，例如本研究中也检测到的桡足类寄生虫 Mytilicola intestinalis。这使得可以更快、更及时地实施生物入侵管理措施（Duarte 等，2021；Elbrecht 等，2017；Westfall 等，2020）。然而，这项技术也有局限性，特别是参考库的不完整性可能导致假阴性和假阳性（后者发生在序列被分配给具有可用分子数据的最近物种时）。这个问题对于欧洲的海洋无脊椎动物外来物种尤为重要（Duarte 等，2019），因为在 BOLD 中只有大约 42% 的物种有 COI 记录，其中 56% 的记录不一致（Lavrador 等，2023；Vieira 等，2021）。同样，在调查本地物种时，参考库完整性的高度区域差异（Leite 等，2020）也可能成为问题。这些问题可以通过使用多种分子标记（如本评估中使用的 COI 和 18S）以及分子结果的整理或使用整理过的数据库来缓解。这种方法已被证明可以增加测序数据集中检测到的外来物种数量，并提高其他分类群中的物种鉴定数量（Duarte 等，2021；Gold 等，2021；Lavrador 等，2023；Magoga 等，2022）。例如，在本研究中（在 COI 数据整理后），最初检测到了 45 种外来物种。然而，进一步整理 18S 衍生的外来物种记录后，排除了六条记录，使本研究中检测到的外来物种数量减少到 39 种，其中包括一个本应在亚速尔群岛新发现的物种。在本研究中使用了三种不同的样本类型，因为已经表明环境 DNA 测序研究中的社区组成随采样基底/样本类型的不同而显著变化，使用单一基底会低估物种多样性和丰富度（Koziol 等，2019；Lavrador 等，2024）。在本研究中也观察到了这一点，因为成对比较显示不同样本类型和码头之间的社区组成有显著差异。此外，仅通过 eDNA 测序技术在水中检测到的物种可能并未在生态系统中建立，因此不应立即列入外来物种名单。虽然形态学评估更加耗时且需要更多的专业知识，但它可以估计丰度并提供物种水平的视觉确认。我们方法的局限性之一是我们保留了所有读序列，包括单次出现的情况，以最大化早期检测的敏感性。因此，一些外来物种的检测仅由非常少的读序列支持（例如：CNO 中的 Mytilicola intestinalis 总共 2 个读序列；VFC 中的 Oithona davisae 仅有 1 个读序列；PAT 中的 Cephalothrix simula 仅有 1 个读序列）。这些情况应被视为初步警告，而不是确定的出现，需要通过后续调查进行形态学确认。这种低丰度的检测既体现了 DNA 测序技术在外来物种监测程序中的优势，也表明了应用时需要谨慎。在使用基于 DNA 的鉴定方法时，几个弱点仍然存在，主要是由于参考库的不完整性、分子检测失败或无法提供丰度估计。然而，随着参考库的进一步完善和整理，以及全球 DNA 技术效率的提高，这些局限性预计将逐渐减少。此外，多组分 DNA 测序调查还有潜力同时检测本地分类单元和外来物种，这可能有助于未来评估本地和外来物种之间的相互作用，包括可能发生的本地分类单元的置换和对外来物种引入的社区敏感性差异。

5. 结论
我们的研究展示了多组分 DNA 测序调查的几个重要优势：（1）高通量和准确的鉴定能力，涵盖广泛的门类（前提是参考库得到适当的整理）；（2）使用不同的独特样本类型进行并行多社区调查（底栖生物和浮游动物）；（3）对形态学鉴定的交叉验证，特别是对于分类学上具有挑战性和高度多样化的海洋无脊椎动物社区非常重要；（4）对新的外来物种引入或分布范围扩大的高灵敏度分子检测。我们建议国家监测活动结合基于 DNA 的技术，理想情况下结合频繁的分子评估（这更简单、更快且有效），以及定期的形态学和生态学评估，以提供丰度估计、社区状态和确认分子识别的外来物种。虽然不应仅依靠分子检测来更新官方的外来物种清单，但我们提倡创建平行的分子外来物种检测列表，作为早期预警工具（或观察名单）。这些列表可以突出潜在的新进入物种，并指导有针对性的形态学验证。这种方法将有助于持续更新国家娱乐码头中的物种和外来物种清单，扩展我们对卢西塔尼亚海岸生态系统中的海洋/半咸水无脊椎动物社区的了解，促进关于入侵途径和生物与非生物因素在构建海岸无脊椎动物社区中作用的研究。

CRediT 作者贡献声明：
Ana S. Lavrador：写作——审阅与编辑，撰写——原始草稿，可视化，调查，正式分析，数据整理。
Inês Afonso：写作——审阅与编辑，调查。
Paula Chainho：写作——审阅与编辑，调查。安娜·克里斯蒂娜·科斯塔（Ana Cristina Costa）：负责撰稿、审稿与编辑工作，以及相关研究。若昂·保罗·梅德埃洛斯（Jo?o Paulo Medeiros）：同样负责撰稿、审稿与编辑工作及相关研究。马努埃拉·伊莎贝尔·帕伦特（Manuela Isabel Parente）：负责撰稿、审稿与编辑工作及相关研究。保拉·帕雷蒂（Paola Parretti）：负责撰稿、审稿与编辑工作及相关研究。帕特里西奥·拉马略萨（Patrício Ramalhosa）：负责撰稿、审稿与编辑工作及相关研究。罗纳尔多·索萨（Ronaldo Sousa）：负责撰稿、审稿与编辑工作。佩德罗·E·维埃拉（Pedro E. Vieira）：负责撰稿、审稿与编辑工作及相关研究。菲利佩·O·科斯塔（Filipe O. Costa）：负责撰稿、审稿与编辑工作，同时参与资金筹措与项目概念化工作。索菲亚·杜阿尔特（Sofia Duarte）：负责撰稿、审稿与编辑工作；撰写初稿；负责项目可视化设计、项目管理；参与相关研究及资金筹措；此外还进行形式分析与项目概念化工作。

本项目由葡萄牙科学与技术基金会（FCT, I.P.）资助的“NIS-DNA”项目支持，该项目旨在利用高通量测序技术实现非本土物种（NIS）在沿海生态系统中的早期检测与监测（项目编号：PTDC/BIA-BMA/2017）。此外，该项目还获得了其他战略项目的支持，包括由FCT I.P.通过国家资金支持的“Contrato-Programa”项目（项目编号：https://doi.org/10.54499/UID/04050/2025）（资助机构：CBMA）、UID/50027-生物多样性与进化生物学研究网络项目（资助机构：MARE UI&I）以及UIDB/04292-海洋与环境科学中心项目（资助机构：MARE UI&I）。这项工作也在LA/P/0069/2020项目的框架内开展（项目资助机构：ARNET，项目编号：https://doi.org/10.54499/LA/P/0069/2020）。S.D.获得了FCT I.P.的财政支持（项目编号：https://doi.org/10.54499/CEECIND/00667/2017/CP1458/CT0001）；A.S.L.则通过FCT I.P.及欧洲社会基金（Northern Regional Operational Program—Norte2020项目）的资助参与了多年制博士生研究资助计划的合作项目（项目编号：https://doi.org/10.54499/UI/BD/150871/2021）。I.A.和J.P.M.分别获得了FCT提供的两项博士学位研究资助（项目编号：SFRH/BD/145746/2019和SFRH/BD/77539/2011）。PP获得了地区科学与技术基金（FRCT）及A?ORES 2020项目的博士学位研究资助（项目编号：M3.1.a/F/065/2015），目前正由INTERREG-MAC项目ECOMARIS（项目编号：1/MAC/1/1.1/0137）提供支持。