关于太平洋鲍鱼热耐受性的基因组学研究：对食品安全和可持续水产养殖的意义

《Water Biology and Security》：Genomic insights into thermal tolerance in pacific abalone: Implications for food security and sustainable aquaculture

　　林伟宏|彭文珠|刘俊宇|甘阳|卢成冠|张逸芳|唐冰|于文超|郑星|陈楠|黄妙清|尤伟伟|柯采环|于峰|罗轩
中国厦门大学海洋与地球科学学院海洋养殖育种国家重点实验室，厦门361102

**摘要**
由气候变化引发的热浪使得耐热性成为水产养殖中的关键经济性状。太平洋鲍鱼（Haliotis discus hannai）夏季常常发生大规模死亡现象，但其耐热性的遗传基础仍不明确。本研究构建了一个包含210个家系的混合群体，以监测海养和陆养系统的生长及夏季存活率。通过心率衍生的Arrhenius临界温度（ABT）评估耐热性，发现陆养系统的ABT显著高于海养系统（29.59 ± 1.21 °C vs 29.19 ± 1.24 °C），且壳色为普通的鲍鱼的ABT也高于红壳鲍鱼（29.45 ± 1.24 °C vs 29.05 ± 1.06 °C）。尽管两种系统都经历了较高的夏季死亡率，但陆养系统的存活率更高（63.77% vs 47.30%），这突显了该物种对热应激的脆弱性。对630个个体进行的全基因组关联研究（GWAS）发现了23个与ABT相关的单核苷酸多态性（SNPs），其中包括13号染色体上的一个SNP簇。这23个SNP被映射到21个基因上，其中候选基因包括tm117和anxa6（与细胞凋亡相关）、nktr和ubxn4（与蛋白质稳态相关），以及ddx58、qvr、vwa7和lin41（与免疫相关）。急性热应激后，这些基因的表达发生了显著变化，进一步证明了它们的功能重要性。总体而言，这些位点、基因和信号通路为选择性育种和未来的基因组选择提供了可检验的目标，旨在培育出更具耐热性的鲍鱼。这种方法有助于减少因温度升高导致的损失，并提高养殖生产的稳定性，从而为鲍鱼养殖的粮食安全做出贡献。

**1. 引言**
随着全球气候变化的加剧，理解海洋物种对变暖和温度变化的生理耐受性对于维持水产食品生产变得越来越重要。极端高温事件的频率、持续时间和强度不断增加，预计将对养殖生物造成反复的热应激，从而提高养殖生产的风险和经济不确定性（Kornhuber等，2020；Martinez-Villalobos等，2025）。耐热性影响海洋生物的生长、存活和健康状况，这些因素直接关系到海产品的稳定性和安全性（Froehlich等，2016；Wang等，2024）。因此，预测海洋生物如何应对热应激对于水产养殖业至关重要，以便在环境变化的情况下保持产量稳定和供应可靠性。
太平洋鲍鱼（Haliotis discus hannai）是一种具有重要经济价值的温带海洋腹足类动物，自然分布于中国的黄海和渤海、朝鲜半岛的东海岸和西海岸以及日本的沿海地区（Ino，1951；Chen等，1977）。由于20世纪60年代以来的过度捕捞，中国的野生种群数量急剧下降，促使人们在20世纪70年代建立了人工繁殖计划（Wu等，2020）。然而，长期封闭系统的繁殖可能导致H. discus hannai的近亲繁殖衰退，并降低其适应环境变化的能力。先前的研究表明，中国的H. discus hannai养殖业曾遭受灾难性损失，20世纪90年代初的孵化场和养殖场的死亡率高达80-90%（Zhang等，2004a）。这类事件不仅威胁到产业的生存能力，还通过增加与大规模死亡相关的疾病风险，危及食品安全和产品安全。通过引入日本野生种群进行的遗传救援计划产生了具有显著更高存活率和生长速度的杂交后代，恢复了生产力。这一策略改善了鲍鱼的遗传多样性，并稳定了种质资源，为可持续养殖奠定了基础（Zhang等，2002，2004a，2004b）。截至2023年，中国的鲍鱼产量达到244,991公吨，占全球总量的90.78%，其中南部地区贡献了超过80%（FAO，2025），这既凸显了该产业的经济重要性，也表明其容易受到气候变化的影响。
如今，气候变化给鲍鱼养殖带来了新的挑战，海水温度升高的同时热浪频率也在增加，与大量死亡事件密切相关——中国南部的夏季损失有时超过50%（Lin等，2017）。近期研究表明，过去几十年热浪活动显著增加，许多地区的强度和范围都有所扩大。除了立即造成的死亡外，热应激还会抑制生长和繁殖能力，增加病原体侵袭的风险，从而降低产量、增加管理成本，并影响整个供应链的产品质量（Horton等，2016；Dong等，2021；Rogers等，2022）。因此，培育具有更强耐热性的鲍鱼品系对于适应气候变化和减少对极端高温事件的脆弱性至关重要。
全基因组关联研究（GWAS）为检测与复杂性状（包括耐热性）相关的位点提供了强有力的工具（Huang和Han，2014；Tam等，2019；Alqudah等，2020）。在水产养殖领域，GWAS已成功应用于多种物种的复杂性状研究。例如，Jin等人（2017）使用250K单核苷酸多态性（SNP）阵列对受热应激的channel catfish后代表系进行了GWAS，发现3个关键位点上的14个基因与高温应激相关。Wu等人（2021）利用650K SNP阵列对大黄鲷（Larimichthys crocea）的急性高温耐受性进行了GWAS，识别出四个染色体上的5个重要SNP，并预测了30个与温度耐受性相关的候选基因。Zhu等人（2021）通过心率衍生的Arrhenius临界温度（ABT）对435个渤海扇贝个体进行了耐热性评估，随后对38,011个SNP进行了GWAS分析，发现了1906个与耐热性相关的SNP，并提出转录共激活因子p15基因（pc4）可能是渤海扇贝耐热性的候选基因。通过标记辅助选择（MAS），这些发现有助于培育出具有耐热性的品系，为实现可持续和安全的食物生产奠定基础。包括临界热最大值评估（Gilroy和Edwards，1998；Park等，2015）、ABT（Chen等，2016）和热粘附持续时间（HAD）（Yu等，2021b）在内的多种方法已被用于评估海洋物种的耐热性。其中，ABT作为一种可靠有效的方法，通过测量心脏功能开始衰退的温度来评估耐热性。海洋生物（如美国龙虾Homarus americanus、太平洋鲍鱼和多种鱼类）的心脏功能受到温度变化的显著影响，ABT成为衡量这种影响的一致性和可靠指标（Chen等，2016；Anttila等，2017；Harrington等，2020）。不同物种的ABT值根据其生理状态和对热应激的适应能力而有所不同（Chen等，2016；Yu等，2021b）。通过将ABT测量结果与基因组工具结合，研究人员可以识别影响耐热性的遗传因素，从而帮助在变暖环境中进行水产养殖物种的选择性育种（Alter等，2017；Yu等，2021b）。这些基因组资源可以用于人工选择耐热性，帮助繁殖计划跟上变暖趋势和日益频繁的热极端事件。
在本研究中，我们建立了210个H. discus hannai家系，并在两种养殖系统中进行混合养殖：海养和陆养。通过改进的ABT方案（结合心率测量）评估耐热性，随后进行全基因组重新测序和GWAS。通过识别与耐热性相关的SNP和候选基因，我们旨在提供支持标记辅助育种和基因组选择的基因组资源，以培育出具有气候抵抗力的鲍鱼，从而帮助减轻反复热应激的风险，并提高未来变暖情景下的养殖可持续性。

**2. 材料与方法**
**2.1 材料构建与管理**
2016年10月，从五个育种系中收集了H. discus hannai的亲本：四个来自福建省（晋江、阳霞、东山），以及一个来自山东省（长岛）的红壳品系。利用这五个品系，在福建泉州福达鲍鱼养殖公司建立了210个全同胞家系。在本研究中，我们将“杂交家系”定义为通过跨品系杂交产生的全同胞家系，即父本和母本来自不同育种系（例如，JJ × CD、DS × YX）。相比之下，“纯系家系”是指通过同品系杂交产生的家系（例如，JJ × JJ）。杂交配对是通过随机匹配不同品系的雄性和雌性来实现的。每个个体的家系信息（家系ID、父本ID、母本ID）和品系来源均记录在表S3中。
在14个月的养殖期间，月平均水温范围为15.0至28.1 °C，最低月份为2017年2月，最高月份为2017年9月。每个家系的个体（平均壳长：34.61 ± 6.68毫米）被标记并分配到陆养场和海养场。在福建省晋江的陆养场，约19,000只鲍鱼被养殖在水泥池中（10米×5米×1.5米）。在东山县的海养场，约14,000只鲍鱼被养殖在浮动笼中。从2018年4月到2019年4月，全年在两个地点对个体进行采样以监测生长情况，并记录死亡率和表层水温（图1）。

**2.2 耐热性评估**
在养殖期间，两个系统都发生了死亡现象，最终存活率分别为32.53%（海养）和49.23%。养殖期结束后，从存活的标记个体中随机抽取630个个体进行后续表型和基因分型。通过将每个采样个体与育种记录关联（表S3），确定了家系分配（家系ID、父本ID、母本ID和品系来源）。记录了壳色（图S1）、壳长、壳宽、总重量和性别等性状。在20 °C的适应期后，使用改进的ABT方案评估耐热性。该方法通过测量心率开始快速下降的温度来指示热应激。改进之处在于将之前的阈值（35 °C，此时心率为零）降低到32 °C，从而提高评估效率同时减少死亡率。ABT方案遵循Chen等人（2016）描述的程序，将红外传感器固定在鲍鱼的心脏上方，然后将其置于温度控制系统中记录心率信号。温度以0.1 °C/分钟的速率从20 °C逐渐升高到32 °C。使用OriginPro 8.5.1将心率和温度数据拟合到曲线，计算每个个体的ABT值。

**2.3 统计分析与可视化**
使用IBM SPSS Statistics v.22进行描述性统计、异常值去除和Kolmogorov–Smirnov正态性检验（K–S检验）。非正态分布的数据在分析前进行了转换。T检验用于评估两组之间的显著差异。结果以均值±标准差（mean ± SD）呈现，显著性水平设为P < 0.05。图表使用GraphPad Prism v.8.0.1及相关R包生成。

**2.4 样本收集与文库构建**
耐热性评估后，收集了所有630个个体的足肌组织并储存在95%乙醇中。随后使用酚–氯仿方法提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop 2000分光光度计和Qubit 2.0荧光计评估质量和浓度。每个样本构建了一个350-bp的DNA片段文库，并在北京诺禾基因科技有限公司的Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序，生成配对末端150 bp的读段。

**2.5 数据质量控制、比对和SNP检测**
使用自定义的Perl脚本对每个样本的序列读段进行质量控制。在此过程中，移除了以下读段：与条形码适配器对齐的读段、含有≥10%未识别核苷酸的读段，以及Phred质量得分≤20的低质量读段。使用BWA mem工具（Li和Durbin，2009）将清洁后的读段与H. discus hannai参考基因组进行比对。重复序列使用SAMtools（Li等人，2009年）被去除，得到的BAM文件随后使用SAMtools和GATK v4.0（McKenna等人，2010年）进行基因分型。最终的数据集通过PLINK过滤，仅保留了次要等位基因频率（MAF）>0.05、SNPcall率>0.95以及个体基因分型率>0.826的SNP。接下来进行了群体结构分析，SNP数据使用PLINK转换为二进制文件，并通过Genome-wide Complex Trait Analysis（GCTA）软件（Yang等人，2011年）进行主成分分析（PCA）。使用Genome-wide Efficient Mixed-Model Association（GEMMA）软件（Zhou和Stephens，2012年）生成了亲缘矩阵，并使用pheatmap R包生成了亲缘值的热图。

2.7. 全基因组关联研究（GWAS）
在基因分型和GWAS中，共纳入了630名个体，代表了111个家庭，每个家庭有1-29名个体接受了基因分型（补充表S3）。最大的家庭包含29名个体（占GWAS样本的4.6%），且没有单一家庭主导了数据集，从而降低了关联信号受到少数过度代表家系影响的风险。为了进一步控制由于相关性和群体结构导致的混杂因素，我们在GEMMA中使用了基于全基因组亲缘矩阵的线性混合模型进行GWAS，并包括了栽培系统、性别和主成分作为遗传结构的固定协变量。GWAS使用的模型为：y=Wα+Xβ+?，其中y是表型向量；W是固定效应的设计矩阵（包括栽培系统、性别和主成分等协变量）；α是固定效应系数向量；X是随机效应的设计矩阵；β是随机个体效应向量；?是残差误差向量。由于全基因组重测序产生了大量的SNP，我们采用了传统的显著性阈值1 × 10?5（-log10P = 5）来判定全基因组显著性（Coltell等人，2020年），并基于每条染色体的平均SNP数量确定了染色体级别的阈值（Zhou等人，2019年；Yu等人，2021a）。通过模型诊断来评估分布假设和潜在的膨胀现象。具体来说，我们检查了拟合模型的表型分布和残差Q-Q图，并使用GWAS P值的Q-Q图来评估基因组膨胀。此外，我们还检查了残差与拟合值的图以检查异方差性和模型错误设定，并使用标准化残差筛选了有影响力的观测值。当诊断图未显示出显著的分布假设违反时，保留了原始的表型尺度；否则，将应用转换（例如对数或基于等级的逆正态转换）并重新拟合模型。在本数据集中，诊断图未显示出需要调整模型的重大违规情况。Manhattan图和Q-Q图是使用R-CMplot包生成的。对显著的SNP进行了进一步分析，以识别与耐热性相关的候选基因所在或附近的基因区域。

2.8. 候选基因表达的验证
共选取60个鲍鱼样本随机分为两组——30个用于高温组，30个用于对照组——并在20°C循环海水系统中适应一周。随后，高温组受到30°C的热胁迫2小时。处理后，从每组中收集六个个体的鳃组织（n = 6个生物学重复样本）。每个样本独立处理（不合并）：从每个鳃组织中提取RNA，并为每个个体构建和测序测序文库。RNA提取、文库构建和测序工作由北京诺和基因科技有限公司完成。基因表达水平以TPM表示。使用DESeq2根据基因级别的读取计数进行了两组之间的差异表达分析（6个 vs 6个个体），阈值设定为|log2 (Fold Change)| > 1和调整后的P值（FDR）< 0.01。

3. 结果
3.1. 不同栽培系统下的年度养殖表现
在陆地养殖场（JJ-Land，福建省晋江）和海洋养殖场（DS-Sea，福建省东山）监测了13个月期间的水温和存活率。陆地养殖场的温度波动更为明显，夏季气温超过28°C的时间超过一个月。陆地养殖场的月死亡率与温度变化密切相关。夏季，陆地养殖场的存活率降至63.77%，而海洋养殖场的存活率为47.30%。经过一年的养殖后，陆地养殖场的最终存活率约为50%，而海洋养殖场的存活率为32.53%。

3.2. 描述性统计和正态性检验
去除异常值后，630个个体的表型特征的描述性统计数据列在表1中。样本的平均壳长为70.49 ± 10.38毫米，平均壳宽为47.46 ± 6.51毫米，平均湿重为38.79 ± 16.23克。ABT平均温度为29.42 ± 1.23°C，范围在26.33°C到32.00°C之间。尽管由于改进的ABT协议，上限被设定为32°C，但这个范围有效地捕捉了耐热性的变化。K–S检验确认ABT值符合正态分布（P > 0.05）。

表1. 太平洋鲍鱼表型的描述性统计。
| 表型 | 数量 | 中位数 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | K–S检验 |
|-------------|----------|--------|--------|--------|---------|
| ABT/°C | 630 | 29.42 | 1.23 | 26.33 | 32.00 | P > 0.05 |
| SH/mm | 629 | 70.49 | 0.02 | 42.88 | 98.39 | P > 0.05 |
| SW/mm | 625 | 47.46 | 47.07 | 6.51 | 65.44 | P > 0.05 |
| WW/g | 612 | 38.79 | 35.92 | 16.23 | 82.68 | P > 0.05 |

注：ABT表示Arrhenius Breakpoint温度；SH表示壳长；SW表示壳宽；WW表示湿重；K–S检验表示Kolmogorov–Smirnov检验。

3.3. 环境和生物因素对ABT的影响
分析了养殖类型、性别和壳色对ABT的影响（表S1，图2）。陆地养殖系统的鲍鱼ABT显著高于海洋养殖系统的鲍鱼（29.59 ± 1.21°C vs 29.19 ± 1.24°C；P < 0.001；图2A）。雄性鲍鱼的ABT值略高于雌性（29.56 ± 1.24°C vs 29.41 ± 1.25°C），但这种差异没有统计学意义（图2B）。壳色是一个显著因素，常见壳色的鲍鱼ABT高于红壳色的个体（29.45 ± 1.24°C vs 29.05 ± 1.06°C；P < 0.05；图2C）。这些发现表明，养殖系统和遗传特征（如壳色）显著影响耐热性。

3.4. 基因分型和SNP过滤
测序结果产生了6877.29 Gb的干净数据，平均每个个体10.92 Gb，平均测序深度为8.40倍（表S2）。超过90%的序列读段成功比对到H. discus hannai参考基因组，表明映射效率很高。过滤后保留了1,466,741个高质量SNP，整个基因组的平均SNP密度为1.07 SNP/kb。这个全面的SNP数据集为GWAS分析提供了坚实的基础。

3.5. 个体间的亲缘分析
使用630个鲍鱼和1,466,741个SNP构建了亲缘矩阵来量化个体间的遗传相似性。图2D显示了矩阵的热图可视化，热图顶部和左侧展示了层次聚类树。左侧的树明显分为两个簇：左分支聚集程度较高，而右分支则较为分散。在热图的左上角，对角线附近有两个较浅的颜色区域，表示这些区域内的个体具有更近的亲缘关系（更高的遗传相似性）。随着对角线向右下方延伸，较浅的颜色区域变小且数量增多。这些发现表明，分析中的个体并非独立，因此需要在GWAS框架中包含亲缘矩阵来考虑相关性效应。

3.6. 主成分分析（PCA）
对全部630个样本应用了PCA，结果用PC1、PC2和PC3在3D图中可视化（图2E）。样本表现出明显的层次结构。根据样本来源，左侧的蓝色组主要由红壳色或红壳色杂交系组成，而右侧组包括不同的地理系及其杂交后代。值得注意的是，北部长岛系集中在顶部，而JJ个体（占多数）集中在底部右侧。PC1将红壳色样本与其他样本分开，解释了总方差的14.8%。PC2和PC3分别解释了11.1%和7.1%的方差。ABT与前10个PC的相关性分析（表2）显示PC2与ABT之间存在高度显著关联（P < 0.001），表明PC2与与耐热性相关的遗传变异有关。因此，在GWAS中包括了捕获结构的PC作为协变量来纠正分层。

3.7. 全基因组关联分析
使用混合线性模型进行了ABT的全基因组关联分析。我们通过Q–Q图评估了关联校准，并未观察到显著的系统性统计膨胀，偏差主要局限于极端尾部，对应于最强的关联（图3）。观察到的λGC为1.045，表明混合模型框架中群体结构和相关性得到了充分控制（图3；表3）。使用-log10P > 5的阈值（图3A中的实线），确定了14个与耐热性显著相关的SNP。染色体特定的阈值（图3A中的虚线）确定了23个与ABT相关的位点。值得注意的是，显著位点的簇位于第13号染色体上，其中最具意义的SNP Hic734894的P值为1.39 × 10?8。这23个显著位点的次要等位基因频率（MAFs）范围为0.056到0.275。Hic734894的效应大小最大（|Beta| = 0.804），而Hic449732的效应最小（|Beta| = 0.381）。总体而言，这些位点的效应大小相对较低。

3.8. 功能注释
使用H. discus hannai参考基因组扫描了23个显著位点的基因组位置，共发现了21个注释基因。其中10个SNP位于8个基因内，包括跨膜蛋白117（tm117）和 annexin A6（anxa6，与细胞凋亡相关）；NK肿瘤识别蛋白（nktr）和UBX结构域蛋白4（ubxn4，与蛋白质折叠相关）；以及免疫相关基因如ddx58、qvr、vwa7和lin41。值得注意的是，在这8个显著基因中，有6个位于第13号染色体上。对于那些不位于基因内的显著位点，确定了其上游或下游的相邻基因，共得到13个额外的候选基因。最重要的位点Hic734894并不直接位于一个基因内部，而是被Calsyntenin-1 (cstn1)和Liver carboxylesterase 1 (est1)所包围。其他基因与应激反应相关，包括用于氧化还原调节的细胞色素P450 (cp341, c13a8)、参与蛋白质折叠的djc28和ymel1，以及与信号传导/离子运输相关的基因如rgrf2、kcnal和f173b。表4列出了与太平洋鲍鱼耐热性相关的候选基因。

基因ID 插首位置 起止位置 基因名称 基因注释
HDH_T16229 chr10 exon4 3,254,927 4,255,186 ddx58 可能的ATP依赖性RNA解旋酶DDX58
HDH_T1415 chr9 intron2 23,652,879 23,690,992 tm117 跨膜蛋白117
HDH_T2097 chr13 intron2 3,344,609 2,378,715 nktr NK肿瘤识别蛋白
HDH_T2099 chr13 intron2 2,897,455 2,951,956 qvr 蛋白质quiver
HDH_T2101 chr13 intron3 3,755,802 3,785,390 vwa7 von Willebrand因子A结构域蛋白7
HDH_T2103 chr13 intron4 2,466,629 4,260,322 ubxn4 UBX结构域蛋白4
HDH_T2104 chr13 intron4 4,472,854 4,514,147 anxa6 Annexin A6
HDH_T2147 chr13 intron2 21,211,967 21,218,102 lin41 E3泛素-蛋白连接酶TRIM71
HDH_T01689 intergenic 39,993,577 40,145,365 rgrf2 Ras特异性鸟苷酸释放因子2
HDH_T0491 chr3 intergenic 31,939,914 31,945,939 cp341 细胞色素P450 3A4
HDH_T0491 chr3 intergenic 32,059,574 32,060,165 c13a8 假定的细胞色素P450 CYP13A8
HDH_T0950 chr5 intergenic 80,947,870 80,948,340 kcnal 钾电压门控通道蛋白Shal
HDH_T1095 chr7 intergenic 2,292,398 2,300,216 djc28 DnaJ同源亚家族C成员28
HDH_T1246 chr8 intergenic 14,844,903 14,845,730 dapf Diaminopimelate epimerase
HDH_T1855 chr11 intergenic 79,176,491 79,177,746 fp1v1 足蛋白1变体1
HDH_T2098 chr13 intergenic 2,491,205 2,493,875 crebzf CREB/ATF bZIP转录因子
HDH_T2098 chr13 intergenic 2,520,844 2,544,328 ymel1l ATP依赖性锌金属蛋白酶YME1L1
HDH_T2102 chr13 intergenic 3,789,606 3,792,099 atpsckmt ATP合成酶亚单位C赖氨酸N-甲基转移酶
HDH_T21021 chr13 intergenic 3,798,045 3,811,505 pur9 双功能嘌呤生物合成蛋白PURH
HDH_T2883 chr17 intergenic 21,209,422 21,219,996 cstn1 Calsyntenin-1
HDH_T2883 chr17 intergenic 21,251,149 21,251,598 est1 Liver carboxylesterase 1

注：A1代表次要等位基因；A0代表主要等位基因；Maf代表次要等位基因频率；Beta代表位点的效应大小。

3. 高温应激下候选基因的表达分析
对鲍鱼在急性高温应激下的转录组分析显示了21个候选基因的相对表达水平（图4）。其中12个候选基因的表达发生了显著变化。特别是，4个基因（ddx58、tm117、crebzf和cstn1）的表达显著上调，而8个基因（qvr、vwa7、anxa6、lin41、rgrf2、kcnal、fp1v1和pur9）的表达显著下调。这些发现表明，急性高温应激引发了参与细胞凋亡、稳态和免疫调节的基因的不同转录响应。

4. 讨论
4.1. GWAS模型
GWAS的准确性受多种因素影响，包括表型变异、样本大小、群体结构、等位基因频率（Soto-Cerda和Cloutier, 2012; Youssef等人, 2017; Alqudah等人, 2020）以及连锁不平衡（LD）（Semagn等人, 2010）。为了减少混淆，我们在GEMMA中使用了线性混合模型框架，将群体结构和相关性作为固定协变量，并将全基因组亲缘矩阵作为随机效应。我们进一步使用基因组Q-Q图和膨胀诊断来确保测试统计量的膨胀不会过度。类似地，Jin等人（2017）在斑点鲶鱼（Ictalurus punctatus）的回交群体中对高温应激进行了GWAS分析时考虑了体重作为协变量。使用亲缘矩阵和主成分校正群体结构可以有效减少GWAS中的假阳性结果，正如在斑点鲶鱼（Tan等人, 2018）、大黄颟鱼（Liu等人, 2020）、牡蛎（Crassostrea gigas）（Meng等人, 2020）和扇贝（Chlamys farreri）（Ning等人, 2019）的研究中报告的那样。
样本大小对检测能力有重要影响，更大的样本量有助于识别显著的位点或罕见变异。尽管没有确定的样本大小上限，但通常建议至少使用100个个体才能获得足够的统计能力（Xu, 2003; Ahlqvist等人, 2015）。本研究使用的样本量（n = 630）具有代表性，处于之前水生动物GWAS研究的范围之内。例如，Yang等人（2020）使用了172个褐斑石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）的样本进行五个生长特征的GWAS分析，而Meng等人（2020）分析了288个太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的铜和锌含量。尽管这些基因分型的个体（n = 630）来自一个单一的繁殖计划，但它涵盖了中国主要养殖遗传背景的广泛范围，其中大部分鲍鱼生产集中在这些地区。具体来说，基础种苗包括来自福建省的多个南方商业品系、来自山东省的北方品系、一个独特的红壳品系以及许多品系间的杂交体。这种设计相对于基于单一本地群体的研究增加了遗传异质性（Cui等人, 2025a, 2025b; Sun等人, 2025），并提高了我们的发现对中国水产养殖和养殖环境的相关性，尤其是在主要生产区域（如福建和山东）。然而，我们承认这些样本可能不能完全代表所有野生或次要的地区种群，因此仍需要在具有更广泛遗传背景和生产环境的独立品系中评估所识别位点的可转移性。一些研究表明，随着群体间全基因组遗传差异的增加，遗传预测的可转移性会下降（Privé等人, 2022; Hu等人, 2025）。

4.2. 养殖系统相关的热暴露和耐热性表型变异
在基于陆地的养殖系统中观察到了与基于海洋的养殖系统相比更高的耐热性差异。由于这种比较是在特定养殖地点之间进行的，并且我们没有量化几个潜在的重要共变环境和管理因素（例如溶解氧动态、盐度波动、水流模式、病原体负荷和养殖实践），因此这些结果应被视为与所研究的养殖系统和地点相关的模式，而不是养殖模式的唯一因果效应。包括两种代表性养殖系统是为了捕捉实际生产环境下的表型变异，并提高水产养殖的相关性，而不是为了分离因果环境因素。已经报告了基于陆地和基于海洋的系统之间的类似生存差异模式（陆地 vs 海洋的生存率为43.0% vs 9.0%）（Gan等人, 2023），这表明在其他中国生产环境中也观察到了这种生存差异的方向，尽管需要重复设计来确定机制。因此，需要在站点层面进行复制和多参数环境监测，以建立可推广的因果解释。
为了将表型差异置于上下文中，我们纳入了整个养殖期间收集的连续水温记录。基于陆地的系统经历了更高的温度上限（最高温度分别为29.44°C和27.98°C）。此外，基于陆地的养殖系统在夏季有34天的水温超过了28°C（表S4），表明累积的高温暴露更大。这种温度历史的差异与观察到的耐热性差异一致，可能通过适应作用而产生。在海洋变温动物中也报告了之前的热暴露与随后耐热性之间的类似关系，其中适应更温暖和更变化的温度可以提高耐热性，在某些情况下即使在温度下降后这种效果仍然存在（Moyen等人, 2020; Zhang等人, 2021）。从机制上讲，反复暴露可能会促进可诱导的保护和修复过程，包括改善的蛋白质稳态（热休克反应）、增强的细胞修复能力和代谢调整（Yu等人, 2023）。然而，由于没有监测非热应力因素，因此无法单独确定温度的具体贡献，未来的多站点重复试验需要包括全面的环境测量，以区分热暴露效应和其他特定于地点的混淆因素。
值得注意的是，尽管基于陆地的系统在夏季的温度较高，但在该系统的养殖场中的存活率高于基于海洋的养殖场。这种明显的差异表明，生产环境中的存活结果可能反映了多种相互作用的因素，而不仅仅是温度。尽管开放水域系统提供了水交换，但近海养殖仍可能经历多重应力暴露（例如藻类爆发、与喂养相关的氧气耗尽以及整体沿海水质恶化（Morash和Alter, 2016）。已经提出了多种应力因素可能会降低个体对应激的最大承受范围，从而可能导致基于海洋的系统中死亡率升高（P?rtner和Farrell, 2008; Pang等人, 2022）。此外，两种系统的养殖实践也不同：在基于陆地的设施中，每日池塘清洁和水交换允许定期检查和及时移除死亡个体，而在基于海洋的系统中，操作限制使得难以每天移除死亡个体。较少移除死亡鲍鱼可能会导致观察到的存活率降低，这是通过间接效应（例如围绕尸体的局部恶化 and 增加的次级应力）。由于这些非热应力因素没有量化，我们避免做出因果解释，而是将存活差异视为在不同生产环境下的综合表现结果。

除了养殖系统背景外，不同壳色品系的耐热性也有所不同，红壳品系的耐热性低于普通壳色品系。我们有意将红壳品系包含在GWAS中，以扩大所代表的遗传背景，并更好地捕捉生产相关条件下的表型变异，目标是识别更可能在多种H. discus hannai养殖品系中具有鲁棒性和可转移性的耐热性标记。PCA显示，红壳品系在遗传上与其他品系不同，表明观察到的耐热性差异反映了品系层面的关联。之前的H. discus hannai分析表明，橙色/红色壳色可以遵循孟德尔遗传规律（Liu等人, 2009），并且已经报道了壳色变异与适应性相关特征（如存活和生长）之间的关联（Winkler等人, 2001）。Chen等人（2019）发现红壳色鲍鱼的耐热性值在所研究的品系中最低，这加强了壳色与耐热性之间的关联。对红壳色鲍鱼的转录组分析显示，有更多差异表达基因（DEGs），特别是在与内质网中的蛋白质处理、核苷酸结合和寡聚化结构域（NOD）样受体信号通路相关的通路中。这些表达模式提供了支持证据，表明红壳色品系在热挑战下可能会经历更强的细胞应激反应；然而，在得出机制性结论之前，需要在热暴露和控制遗传背景的设计下进行额外的验证。
从应用水产养殖的角度来看，这些发现突显了将表型监测与基因组信息集成以支持种苗选择和夏季高峰期风险管理的价值。基于陆地的系统可能受益于有针对性的温度管理，鉴于本研究中观察到的较低耐热性，应谨慎评估和管理红壳品系。

4.3. 与耐热性相关的关键候选基因和通路
在这项研究中，主要的GWAS表型是在短期热暴露（约2小时（Chen等人, 2016）期间基于心脏表现的耐热性（ABT），因此反映了急性热表现限制而不是慢性热暴露下的季节性存活。由于ABT是由快速升温期间的心率动态得出的，因此与ABT相关的位点预计富集了限制急性心脏功能的机制，包括膜兴奋性、离子和Ca2+稳态、蛋白质稳态能力和应激触发的细胞命运决策。因此，我们的转录组实验（30°C持续2小时）被设计为一个支持性的短期测定，以测试GWAS优先考虑的候选基因是否对急性热应激表现出转录响应。我们强调，这样的表达变化本身并不建立长期夏季存活的因果机制；相反，它们提供了将候选位点与可能在急性生理崩溃期间起作用的温度响应通路联系起来的补充证据。未来需要使用慢性热暴露设计和重复的现场试验，将候选基因与长期存活结果直接联系起来，并量化实际养殖环境中的遗传效应。
我们的GWAS鉴定了14个全基因组范围内的和23个染色体水平的显著SNP，其中主要簇位于染色体13上（主导SNP Hic734894，P = 1.39 × 10?8）。这些结果支持H. discus hannai的耐热性是多基因的，这与之前在大型黄颟鱼、比目鱼和其他水产养殖物种中在急性升温或季节性热应力下进行的发现一致（Wu等人, 2021; Jiang等人, 2022; San等人, 2024）。我们的ABT相关位点所涉及的候选基因涵盖了生物学上合理的急性心脏表现限制的机制类别。急性升温同时增加了蛋白质错误折叠的负担并破坏了可兴奋组织，从而可能导致心脏表现的突然下降（Haverinen和Vornanen, 2020）。首先，多个位点指向在热应力下维持蛋白质稳态和蛋白质质量控制。例如，ubxn4和chaperone相关基因如djc28（Gardiner等人, 2002）和ymel1（Rainbolt等人, 2013）被注释为蛋白质折叠/质量控制过程，并已被牵涉到限制热挑战期间错误折叠蛋白质积累的压力相关降解通路中（Alberts等人, 2009）。尽管经典的热休克蛋白（HSPs）是众所周知的早期反应者，但下游蛋白质稳态模块（如未折叠蛋白质反应（UPR）和ER相关降解（ERAD）的变化对于在热挑战期间清除错误折叠的蛋白质同样重要。特别是，ubxn4被注释为未折叠蛋白质反应（GO:0006986），这是细胞应力下蛋白质稳态的核心过程。UBX-结构域蛋白可以与Cdc48/p97相互作用，从而参与ERAD（内质网应激反应和降解），这是一个主要的质检途径，负责清除内质网中错误折叠的蛋白质（Hampton, 2002; Meusser et al., 2005; Liang et al., 2006），在基因型与蛋白质毒性压力耐受性之间建立了直接的机制桥梁。由于热应力会增加蛋白质错误折叠，因此参与UPR/ERAD的基因变异可能会影响急性热耐受性。其次，与细胞凋亡和膜相关应激信号传导相关的基因可能在接近热极限时有助于细胞稳定；在我们的数据集中，tm117和anxa6是与相关SNP链接的基因，这与它们在热诱导损伤过程中调节膜动态和细胞凋亡的作用相符（St?gbauer et al., 2009）。第三，一些基因位点映射到免疫或应激防御途径（例如ddx58, qvr, vwa7, lin41）（Ranjan et al., 2010），这与海洋无脊椎动物中热应力与免疫重编程之间的已知联系一致（Liu et al., 2018）。最后，细胞色素P450基因（cp341, c13a8）表明具有氧化还原和解毒功能，而信号传导和离子转运候选基因（例如rgrf2和钾通道基因kcnal）则可能与神经内分泌调节和心脏兴奋性过程有关，这些过程可以影响快速升温期间的心率动态。为了为这些GWAS优先区域提供功能背景，我们研究了这些注释的候选基因在急性热刺激下是否表现出短期转录响应。在21个注释的候选基因中，有12个在30°C下持续2小时内表现出显著的表达变化，其中4个基因（ddx58, tm117, crebzf, cstn1）上调，8个基因（qvr, vwa7, anxa6, lin41, rgrf2, kcnal, fp1v1, pur9）下调。由于ABT（急性热应激）来源于快速升温期间的心率变化，并反映了心脏表现的急性热限，这些表达变化最好解释为对GWAS优先位点的支持性功能背景，而不是解释长期生存的直接证据。ddx58的强烈上调表明在热刺激期间涉及先天免疫或应激防御信号传导。在海洋无脊椎动物中，短暂的热暴露经常改变免疫相关途径和类似炎症的信号传导，这可能反映了在升温条件下更强的细胞损伤信号或病原体易感性的变化（Liu et al., 2018）。在这种情况下，ddx58的上调与动物接近心脏表现极限时发生的急性警报反应一致。相比之下，其他几个免疫或应激相关候选基因（qvr, vwa7, lin41）下调，表明热暴露可以以基因特异性的方式重塑免疫网络，而不是在所有免疫成分中产生统一的增加。热应力增加了蛋白质错误折叠的负担，并可能触发与内质网应激相关的反应（Almanza et al., 2019）。观察到tm117和crebzf的上调与急性损伤下的应激信号传导和细胞命运调节相关的转录程序一致。值得注意的是，编码钙依赖性膜结合蛋白的anxa6显著下调，这意味着在快速升温过程中钙相关的膜过程可能会发生变化。由于心脏收缩是由膜去极化触发的，并且严重依赖于钙循环，钙相关信号传导和膜兴奋性的变化可能会导致基于心率的热限（即ABT）的差异（Enrich et al., 2011）。与此观点一致的是，参与离子转运和兴奋性的候选基因，如钾通道基因kcnal，为遗传变异影响快速升温期间的急性心脏衰竭提供了合理的途径。总体而言，这些候选基因与热应激生物学中的关键主题相一致，包括蛋白质质量控制、内质网应激信号传导、离子和膜稳态以及可能在急性升温期间影响细胞稳定性的更广泛的应激反应途径。虽然我们的映射是在H. discus hannai中进行的，但ABT相关位点所暗示的广泛生物学主题与其他在水产养殖物种中进行短期升温测试或季节性热 stress研究时报道的模式相匹配。这些研究反复强调了内质网中的蛋白质质量控制以及可兴奋组织中的离子处理的重要性（Su et al., 2020; Wang et al., 2021; Esmaeili et al., 2025）。在扇贝的研究中，基于ABT的遗传分析指出与兴奋性信号传导、离子调节和热刺激下的心脏表现相关的位点，支持了膜兴奋性和Ca2+-相关过程在接近急性热限时可能很重要这一观点（Liu et al., 2026）。在大型黄鲷鱼中，关于急性热耐受性的GWAS指向了与蛋白质稳态相关的途径，包括内质网应激反应、未折叠蛋白质反应成分和蛋白质泛素化，这符合快速升温增加了蛋白质折叠和质量控制需求的预期（Alemu et al., 2018; Wu et al., 2021）。在这个背景下，我们在太平洋鲍鱼中的基于ABT的GWAS突出了可能影响升温期间心脏表现快速下降的基因组区域，为开发遗传标记提供了一个实际的起点。从实际角度来看，最强的SNP及其附近的单倍型是后续工作的优先选择，特别是当一个位点同时得到GWAS证据和在热刺激下的明确表达响应支持时。尽管如此，它们对于育种或管理的价值取决于这些信号是否可以再现，以及它们是否可以在独立群体中预测表现。一旦得到验证，最可靠的位点可以被转化为低成本的SNP面板，用于筛选亲鱼和幼体，并可以纳入基于标记的选择或全基因组选择，以改善ABT同时监测其他关键的生产性状。这些标记也可能有助于指导养殖决策，例如在预测的温暖时期选择更耐热的种群，以及减少热负荷和死亡风险的常规做法。尽管我们的结果基于单一物种和有限的育种系，并且转录组证据仅来自一次30°C下持续2小时的短暂暴露，但仍存在一些限制。因此，观察到的表达变化被视为支持热相关性的证据，而不是因果关系或长期夏季存活性的证明。未来的研究需要包括在不同队列和养殖地点进行验证性的GWAS、测量存活时间的更长热暴露试验，以及针对生理或功能测试，包括时间序列表达分析和与离子平衡和钙处理相关的测试，以确认机制并改进这些发现在不同育种系和生产设置中的适用性。

结论

本研究使用ABT方法评估了H. discus hannai的热耐受性，研究对象是一个由630个个体组成的混合家族群体，他们在两种养殖系统中饲养。ABT在不同养殖方法和壳色之间存在显著差异，表明养殖条件和可见表型都与热耐受性相关。全基因组关联分析确定了23个显著位点，包括13号染色体上的一个主要簇，并强调了与细胞凋亡（例如tm117, anxa6）、蛋白质稳态（例如ubxn4, nktr）和免疫相关过程（例如ddx58, vwa7）相关的候选基因。转录组验证进一步显示，几个候选基因在急性热应激下表现出显著的表达变化，包括anxa6下调和ddx58上调，提供了这些基因响应热刺激的直接证据。总之，这些发现支持热耐受性的多基因基础，涉及多个生物过程，包括能量利用、蛋白质处理、细胞损伤控制和免疫反应。通过结合关联信号和应激响应表达，这项工作提供了可验证的位点和候选基因，可以作为育种计划的测试性分子线索，以开发更耐热的亲鱼。这些发现可能有助于减少热相关损失并提高升温条件下的生产稳定性，从而支持食品安全和可持续水产养殖。然而，通过基因组选择实现该物种热耐受性的遗传增益程度仍不确定，因为本研究没有进行基因组预测和育种试验，因此这一应用需要进一步验证。