通过尿液和粪便排病毒模型评估登革热病毒的废水检测限

《Water Research X》：Assessing wastewater detection limit for dengue virus via urinary and fecal shedding modeling

　　陈杜|华树增|李新月|吴春丽|黄雅岚|范阳|郭 Congrui|徐良才|李灵灵|梁照海|罗淼淼|陈妙玲|王雷|邱雅群|贾万|成彦鹏|陈志高|孔东风|张珍|史晓璐|李英辉
中国深圳市疾病预防控制中心

**摘要**
登革热病毒（DENV）是最具临床意义的虫媒病毒，正逐渐成为全球公共卫生关注的重点。实际上，DENV感染的发病率可能被低估了，因为超过一半的感染者没有症状，因此未被报告。基于废水的监测（WBS）已成为检测肠道和呼吸道病毒的有效方法，尤其是在存在大量无症状感染的情况下。然而，关于虫媒病毒在废水中释放的程度，尤其是来自无症状个体的病毒释放情况，仍存在关键知识空白。在本研究中，我们量化了有症状和无症状感染者尿液及粪便中的DENV RNA释放量，以评估它们对废水信号的相关贡献。首先比较了三种RNA提取方法，以确定处理尿液和粪便样本的最有效方案，随后采用了大规模提取方法。使用这种优化方法，在11%（8/71）的粪便样本中检测到了DENV RNA，这为首次在人类粪便中检测到DENV提供了证据。具体而言，尿液是DENV RNA的主要释放途径，有症状感染者的尿液RNA检测率（82% vs 57%，p = 0.019）和病毒载量（平均值分别为471 vs 102拷贝/毫升，p = 0.007）均高于无症状感染者。蒙特卡洛模拟进一步表明，为了确保在废水中检测到DENV，最低感染率为4%。这些发现为通过WBS检测DENV的可行性奠定了基于证据的框架，并提供了一种可扩展的方法，以便在资源有限的条件下优化环境监测设计，从而支持更早地发现疫情并加强全球对登革热及其他虫媒疾病的公共卫生应对措施。

**1. 引言**
虫媒病毒是由蚊子和蜱虫等节肢动物传播的病毒（Wilder-Smith等，2017年）。它们给公共卫生带来了巨大负担，尤其是在热带和亚热带地区。随着气候变化和全球化扩展了这些载体的栖息地，虫媒病毒的传播速度正在加快（Ghita等，2023年；Hales等，2002年；Robert等，2020年）。在所有虫媒病毒中，登革热病毒（DENV）的临床意义最为突出，已在141个国家和地区有记录（Shepard等，2016年）。据估计，每年有3.9亿人感染DENV，导致约2万至2.5万人死亡（Bhatt等，2013年）。
传统的DENV监测依赖于临床病例报告和媒介监测，其中临床监测是追踪感染的主要方法（Bowman等，2014年；Tambo等，2017年）。然而，在疫情期间，无症状感染的比例估计在50%到90%之间，这导致显著的感染漏报和隐匿性传播（Asish等，2023年；Bhatt等，2013年）。值得注意的是，大约88%的DENV传播来自无症状个体，他们常常逃避了临床监测的发现（Ten Bosch等，2018年）。鉴于这些限制，迫切需要全面、快速和实时的监测策略，以同时捕捉有症状和无症状感染。基于废水的监测（WBS）已成为多病原体监测的有前景工具，在监测SARS-CoV-2、脊髓灰质炎病毒和猴痘病毒方面已取得成功应用（Bivins等，2020年；Grassly等，2025年；Singer等，2023年）。即使在无症状的情况下，这些病毒也可能通过感染者? 粪便或尿液排出（Fischer等，2024年；Grassly等，2025年；Quee等，2020年），从而为检测人类群体中的DENV传播提供了潜在的价值。现有研究还表明，废水监测能够早期、在大规模人群中检测到隐匿性DENV传播，并作为临床和昆虫学监测的宝贵补充（Ahmed等，2026年；Ma等，2025年；Monteiro等，2024年；Wolfe等，2024年）。然而，由于病毒释放动态不明确，特别是在无症状个体中（Lee等，2022年），WBS在实际应用于DENV监测时面临挑战。
在高风险环境（如卫生设施不足的密集建筑工地）进行监测对于早期预警和疫情控制至关重要（Liang等，2018年；Likos等，2016年）。在这项研究中，我们招募了来自中国深圳建筑工地疫情的感染者，收集了他们的尿液和粪便样本，以比较有症状和无症状感染者的病毒释放情况。基于这些数据以及废水监测的蒙特卡洛框架（Chen和Bibby，2023a；b），我们开发了一个模型来估算废水中的DENV浓度，从而评估WBS的敏感性并确定不同人群规模下的最佳处理量。这项工作旨在确定WBS的最佳方法，以实现早期疫情检测，并为DENV控制提供有针对性的公共卫生干预措施。

**2. 方法**
**2.1. 研究设计**
我们使用了加入DENV的粪便和尿液样本，评估了三种核酸提取方法，以确定最有效的下游分析方法。选定最佳方法后，我们从中国深圳的登革热疫情中招募了有症状和无症状的个体。收集这些参与者的尿液和粪便样本，并检测其中是否存在DENV RNA及其浓度。然后将这些病毒释放数据纳入模型，以估算废水中的DENV浓度。通过这种建模，我们能够评估WBS对DENV检测的敏感性，并确定不同人群规模所需的最佳废水处理量。

**2.2. 加标尿液和粪便样本制备**
从一名健康个体中收集了约100毫升尿液和10克粪便作为DENV阴性对照。尿液样本未经进一步处理，而粪便样本则通过与二乙基焦碳酸盐（DEPC）处理的水混合并在6米/秒的速度下均质化1分钟后制备成100毫克/毫升的悬浮液。我们的实验室保存了登革热病毒1型（No. 19SZ131）和2型（No. 19SZ166）菌株，并按照制造商的说明，在GeneX DA Pro平台上使用登革热病毒1/2型数字PCR试剂盒（MABSKY，中国）进行数字PCR定量。这两种病毒类型被分别以最终浓度2×10^5、2×10^4、2×10^3、8×10^2、8×10^1拷贝/毫升以及阴性对照（0拷贝/毫升）加入尿液和粪便悬浮液中。

**2.3. RNA提取方法比较**
鉴于基于磁珠的核酸提取具有很高的自动化潜力，我们比较了三种方法（方法1-3），这些方法的主要区别在于最大样本处理能力。方法1和方法2每次处理最多200微升样本，而方法3能够处理多达8毫升样本，推荐用于粪便悬浮液的体积为2毫升。所有方法的详细方案如下：
**方法1**：使用NO-R-AI试剂盒（Hybribio，中国）在HBNP-9601A自动平台上从200微升样本中提取RNA，最终洗脱体积为100微升。这种方法此前已用于我们从废水浓缩物中提取RNA（Li等，2024年）。
**方法2**：使用TGuide SMart Ultra病毒DNA/RNA试剂盒（Tiangen，北京，中国）在TGuide S16平台上从200微升样本中提取RNA，最终洗脱体积为100微升。该方法已被报道用于从复杂废水样本中提取RNA（Jiang等，2026年）。
**方法3**：使用基于磁珠的生物样本病毒浓缩试剂盒（Suzhou Advanced Molecular Diagnostics Co., Ltd，中国）在WMC-24C平台上从2毫升粪便悬浮液或8毫升废水中提取RNA，最终洗脱体积为100微升。该方法已被报道用于一步病毒浓缩和从尿液及废水样本中提取RNA（Ma等，2025年；Xu等，2024年）。

**2.4. 临床样本收集**
2024年7月24日至12月1日期间，深圳市建筑工地共发现43例2型登革热病毒感染病例。其中10例因数据不完整而被排除，剩余33例（19例有症状，14例无症状）。在当地区CDC实验室通过RT-qPCR检测血清中的DENV RNA。有症状感染定义为体温超过38°C并经实验室确认（WHO，2009年）。无症状感染者是通过RT-qPCR筛查与有症状感染者有过接触的宿舍居民确定的。收集的流行病学数据包括性别、年龄、症状和发病日期。样本在感染后1至8天内采集（图S1）。由于症状消失和解除隔离，无法在8天后继续采集样本。总共获得了74份尿液样本和71份粪便样本。

**2.5. 加标废水样本制备**
废水样本来自中国深圳的污水处理厂（WWTPs），作为全市监测系统的一部分（Du等，2024年）。这些污水处理厂根据地理位置分布在五个区域：福田（中心）、南山（南部）、宝安（西部）、龙华（北部）和平山（东部）（表S1）。将DENV 2型病毒（No. 19SZ166）以500、100、50、10、5和0拷贝/毫升的浓度加入这些废水中。直接使用基于磁珠的病毒浓缩和提取试剂盒（方法3）处理8毫升样本，无需预先过滤，最终RNA洗脱体积为100微升。

**2.6. DENV RT-qPCR检测**
对于尿液、粪便和废水样本，使用登革热病毒（I型、II型）RT-PCR试剂盒（MABSKY，中国）和SLAN 96S实时PCR系统（Hongshi Medical Technology Co. Ltd，中国）进行了三次重复检测。如果在至少两次重复实验中观察到明确的指数荧光升高且Ct值≤40，则认为样本呈阳性。阳性样本中的病毒浓度根据制造商提供的质粒系列稀释液（10^5至10^1拷贝/微升）的标准曲线计算得出。用于加标尿液、粪便和废水样本中DENV菌株定量的同一数字PCR方法也被用于制备qPCR标准曲线，从而在各种平台上实现量化的统一。通过逻辑回归模型（Du等，2025年）确定了DENV检测的95%置信限（LOD95%），即绘制出每个标准品的阳性扩增比例与浓度的关系图（图S2）。在整个研究过程中，我们遵循了定量实时PCR实验的最低信息发布（MIQE）指南和环境微生物学的最低信息（EMMI）指南（Bivins等，2021年；Borchardt等，2021年）。每次采样当天收集的空白样本与测试样本同时处理。每次RT-qPCR运行至少包含两个无模板阴性对照，如果该对照中出现扩增，则排除该数据集并重新进行整个实验。

**2.7. 建模废水中的DENV浓度**
为了预测废水中的DENV浓度，我们应用了稳态质量平衡模型（Ahmed等，2020年），并结合了尿液和粪便中的测量释放数据。所有值根据以下公式计算：
**CW = Ni × (U × V + F × M) / Nc × Qe^(-kτ)**
为了获得废水中的阳性信号，所需的最小感染数为：
**Nmin = LOD × Ni × Qp × U × V + F × Me^(-kτ)**
其中，CW是预测的废水中的DENV浓度（拷贝/升）；Ni是采样点的感染数量；U是每日尿液中的病毒释放量（拷贝/升）；V表示每人每日尿液量（平均值=1.76升，最小值=1.38升/天，最大值=3.26升/天）（Armstrong等，2010年）；F是每日粪便中的病毒释放量（拷贝/克）；M表示每人每日粪便质量（平均值=127克，最小值=80克，最大值=211克/天）（Rose等，2015年）；Nc是采样点的居民人数；Q是每人日均用水量（平均值=135升，最小值=102升，最大值=199升/天）（深圳市水务局，2023年）；k是一阶衰减常数，描述病毒在运输过程中的损失（Chandra等，2021年）；τ是从病毒释放到采样之间的平均水力停留时间或传输时间（天）。LOD95%是在95%置信度下可以在废水中检测到的最低病毒浓度（拷贝/升）。模型参数的详细信息见表S3。U和F使用对数均匀分布进行建模，而V、M和Q使用正态分布进行建模。这些参数的估计是通过最大似然拟合基于实证数据得出的，Kolmogorov-Smirnov检验确认了拟合优度（p > 0.05）。病毒的排泄平均值（U或F）是包括所有阳性和阴性样本计算得出的，其中阴性样本的排泄值被设定为0个基因拷贝。该模型假设病毒流动恒定、病毒持续存在且混合均匀。蒙特卡洛模拟使用ModelRisk v6.0进行了10,000次迭代。预测的DENV浓度以平均值报告，并附有95%置信区间，这些置信区间来自1,000次自助重采样。

2.8 统计分析
统计分析使用R v4.1.2进行。对于2×2列联表中两个比例的比较，当n ≥ 40且所有预期计数（T）≥ 5时，使用卡方检验；当n ≥ 40且1 ≤ T < 5或n < 40或T < 1时，应用费希尔精确检验。两个独立组之间的平均值（对数10转换后）使用配对t检验进行比较，涉及三个或更多组的比较则使用单因素方差分析（ANOVA）；本研究中的所有参数分析都在进行时每组样本量至少为30个。相关性使用斯皮尔曼等级相关检验进行评估。p值< 0.05被认为是统计学上显著的。

3. 结果
3.1 DENV血清型1和2的RT-qPCR检测的质量控制
DENV血清型1和2的RT-qPCR检测表现出稳健的分析性能（表S4）。DENV血清型1和2的扩增效率分别为101%和99%。它们的标准曲线的相关系数（R2）为0.999，表明目标基因拷贝数与荧光信号之间存在极好的线性关系。对于单独的RT-qPCR步骤，DENV-1和DENV-2的LOD95%值分别为562和741拷贝/mL（图S2），这证实了该检测方法可以可靠地检测到这些目标的低浓度。
3.2 尿液和粪便中DENV RNA提取方法的比较
我们使用添加了DENV血清型1和2连续稀释液的尿液和粪便样本，评估了三种RNA提取方法的性能（图1）。在尿液样本中，方法3的回收效率最高，为28.5 ± 8.4%，显著优于其他方法（p < 0.001，单因素ANOVA）。方法2的回收率为17.9 ± 12.4%，而方法1的回收率为9.3 ± 7.0%。对于粪便悬液，方法2的回收效率最高，为23.2 ± 14.7%，尽管方法之间的差异不具有统计学显著性（p > 0.05，单因素ANOVA）。方法3的回收率为18.5 ± 8.4%，方法1的回收率为16.2 ± 10.1%。重要的是，方法3能够检测到低至80拷贝/mL的DENV浓度，而方法1和方法2的LOD ≥ 800拷贝/mL。鉴于其优越的敏感性和对尿液和粪便样本的广泛适用性，选择方法3进行后续分析。

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图1. 尿液和粪便中DENV RNA提取方法的比较。(A) 添加了DENV血清型1和2的尿液和粪便样本的制备以及三种RNA提取方法的协议。(B) 通过三种RNA提取方法在添加了DENV血清型1和2的尿液样本中DENV RNA的回收情况比较。(C) 通过三种RNA提取方法在添加了DENV血清型1和2的粪便样本中DENV RNA的回收情况比较。条形图代表平均值，误差条代表标准差（SD）。
3.3 人口统计和临床特征
所有登记的DENV感染病例均发生在建筑工人中，其中97%（32/33）为男性，平均年龄为43岁（范围：21–59岁）。在有症状和无症状组之间未观察到年龄或性别的显著差异（表1），男性的比例反映了建筑工地劳动力的性别分布特征。在有症状感染中，尿液排泄率为95%（18/19），而在无症状感染中为64%（9/14）（p = 0.0616，费希尔精确检验）。相比之下，在有症状感染中12%（2/17）检测到粪便排泄，在无症状感染中为38%（5/13）（p = 0.1897，费希尔精确检验）。

表1. 有症状和无症状DENV感染的人口统计和临床特征。
症状感染（n = 19）无症状感染（n = 14）
p值
年龄 – 中位数（95%置信区间）43（32–53）46（41–52）0.422
性别 – 无./总计百分比> 0.9999
女性1/19（5%）0/14（0%）
男性18/19（95%）14/14（100%）
尿液样本检测呈阳性的患者 – 无./总计百分比18/19（95%）9/14（64%）0.0616
粪便样本检测呈阳性的患者 – 无./总计百分比2/17（12%）5/13（38%）0.1897
3.4 尿液中的DENV RNA排泄
从33名DENV感染者中收集了74份尿液样本，包括19例有症状感染者的39份样本和14例无症状感染者的35份样本。有症状感染者的尿液样本中DENV的检测率为82%（32/39），显著高于无症状感染者的57%（20/35）（p = 0.0193，卡方检验）（图2A）。在所有DENV感染中，无论症状如何，尿液样本中的检测率和病毒载量在诊断后的第一周内呈上升趋势（图2B、2C和图S3）。有症状感染者的尿液病毒载量显著高于无症状感染者（平均值 = 471拷贝/mL，范围：0–6078拷贝/mL），相比之下无症状感染者的平均值 = 102拷贝/mL（范围：0–736拷贝/mL）（p = 0.0074，配对t检验）（图2D）。

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图2. DENV血清型2感染者尿液中的病毒排泄动态。(A) 感染者尿液中DENV RNA水平的时间分布。比例（B）和所有感染者的病毒载量（C），包括有症状感染者和无症状感染者，在诊断后0至8天内的尿液病毒排泄。(D) 有症状感染者和无症状感染者尿液中病毒载量的比较。
3.5 粪便中的DENV RNA排泄
从30名DENV感染者中收集了71份粪便样本，包括17例有症状感染者的32份样本和13例无症状感染者的39份样本。有症状感染者的粪便样本中DENV的检测率为6%（2/32），低于无症状感染者的15%（6/39）（图3A和图3B），但这种差异不具有统计学显著性（p = 0.4043，卡方检验）。由于阳性粪便样本数量有限，粪便样本中的DENV RNA排泄动态仅在每周水平上进行了描述，因为每日阳性样本数量< 2。有症状感染者的病毒载量较低（平均值 = 45拷贝/g，范围：0–746拷贝/g），相比于无症状感染者（平均值 = 187拷贝/g，范围：0–3696拷贝/g）（图3C）；然而，这种差异不具有统计学显著性（p = 0.2347，配对t检验）。

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图3. DENV血清型2感染者粪便中的病毒排泄动态。(A) 感染者粪便中DENV RNA水平的时间分布。(B) 所有感染者的比例，包括有症状感染者和无症状感染者，在诊断后0至8天内的粪便病毒排泄。(C) 有症状感染者和无症状感染者粪便中病毒载量的比较。
3.6 粪便和尿液对废水中DENV RNA浓度的贡献
通过将粪便和尿液中的平均DENV浓度乘以相应的每日排泄体积，我们估算了每人平均病毒排泄量（图4）。通过尿液的平均每日排泄量为5.22 × 10?拷贝/感染（范围：0–1.07 × 10?），比通过粪便的平均每日排泄量1.56 × 10?拷贝/感染高33.5倍（范围：0–4.69 × 10?）（p < 0.0001，配对t检验）。有症状感染者通过尿液平均每天排泄8.28 × 10?拷贝（范围：0–1.07 × 10?），是无症状感染者每天1.80 × 10?拷贝（范围：0–1.30 × 10?）的4.6倍（p = 0.0112，单因素ANOVA）。这些发现表明尿液是废水中DENV RNA的主要来源，尤其是来自有症状个体的。

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图4. 尿液和粪便对废水中DENV血清型2 RNA的贡献。(A) 尿液和粪便中每次感染的DENV排泄量比较。(B) 有症状感染者和无症状感染者之间的DENV排泄量比较。缩写：S表示有症状感染者；A表示无症状感染者。
3.7 废水中DENV的模型浓度
为了减少废水样本中基质变异性对结果的影响，我们从深圳市五个不同区的污水处理厂选定了废水样本进行加标实验（图5A）。使用添加了DENV血清型2连续稀释液的废水，确定废水中DENV检测的LOD95%为10拷贝/mL（图S4）。对于废水中DENV浓度≥ 10拷贝/mL的样本，平均回收率为56%（范围：21–97%）（图5B）。以8 mL的提取体积，估计的检测限为每样本80拷贝。在提取前加入高浓度样本可以进一步提高低滴度样本的检测灵敏度。

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图5. 废水中DENV血清型2的模型浓度。(A) 使用深圳5个污水处理厂的废水制备加标样本。(B) 不同浓度梯度下废水样本的检测和回收率。(C) 用于模拟100人流域废水中病毒载量原理的示意图。(D) 估计在废水中检测到DENV所需的最小感染者数量。(E) 在不同情景下进行有效DENV废水监测所需的灵敏度和废水处理体积。模型参数的详细信息见表S4。通过整合观察到的排泄数据，我们对100人的建筑工地的水质进行了建模（图5C）。当有1人感染时，预测的平均病毒浓度为170拷贝/L（95%置信区间：0–430拷贝/mL），检测概率为45%（图5D）。当有2人感染时，预测的平均值为350拷贝/L（95%置信区间：0–750拷贝/L），检测概率为83%。当有4人感染时，预测的平均值为690拷贝/L（95%置信区间：130–1,250拷贝/L），检测概率达到100%。因此，推断在100人中至少需要有4人感染（4%的感染率）才能确保在废水中检测到可检测的DENV RNA排泄。可靠检测所需的平均体积为116 mL（95%置信区间：64–615 mL），对于100人的流域，建议使用615 mL的处理体积。比例估计表明，对于10人、100人、1,000人和10,000人的流域，所需处理体积分别为62 mL、615 mL、6,150 mL和61,500 mL（图5E）。

4. 讨论
尽管之前在葡萄牙和美国的废水中检测到了DENV RNA，但在较大健康人群中识别出单个感染者仍然存在不确定性（Monteiro等，2024；Wolfe等，2024）。此外，由于无症状感染的排泄模式不明确（Likos等，2016），根据废水中的病毒浓度预测污水流域内的DENV感染者数量仍然具有挑战性。本研究通过量化有症状和无症状感染者的DENV排泄，并将这些数据应用于预测废水浓度，填补了这些空白。这些结果为选择适合检测DENV的废水处理系统和废水体积提供了实际指导。
先前研究中报告的尿液样本中DENV RNA的检测率范围从42%（36/74）到49%（184/442）（Andries等，2015；Hirayama等，2012）。我们的研究在诊断后的前8天内实现了显著更高的检测率70%（52/74）（p = 0.0193，卡方检验）。之前对SARS-CoV-2 RNA排泄的研究表明，较低的检测率主要是由于测试体积较小所致，这有助于解释为什么在我们的研究中尿液检测率要高得多，因为我们的处理尿液体积明显大于早期研究（Bivins，2025）。
废水处理系统的灵敏度取决于病毒排泄的量和持续时间。本研究中尿液中的病毒载量在诊断后的第一周内增加（图1），这一现象也在之前的研究中得到报道（Andries等，2015；Hirayama等，2012；Matusali等，2025）。尿液中存在DENV RNA，特别是在感染的急性期，突显了废水处理系统在检测新发疫情中的重要性。目前，只有一项研究报告了住院患者尿液中DENV的排泄量（平均值 = 1,244拷贝/mL，范围：0至166,000拷贝/mL）（Andries等，2015），这比我们研究中观察到的平均病毒载量296拷贝/mL（范围：0至6,078拷贝/mL）高四倍。我们还发现，有症状感染者的尿液中平均病毒载量约为471拷贝/mL（范围：0至6,078拷贝/mL），而无症状感染者的尿液中平均病毒载量为102拷贝/mL（范围：0至736拷贝/mL），大约是前者的四倍。这些发现支持这样的观点：更严重的疾病与更高的病毒复制和更多的尿液排泄有关。
尿液中检测到DENV RNA在生物学上是有道理的，因为有越来越多的证据表明病毒具有直接的肾脏趋向性和免疫介导的损伤（Bignardi等，2022；Martina等，2009）。免疫组织化学和原位研究表明，登革热抗原主要存在于肾小管上皮细胞中，而肾小球受累则主要由IL-17驱动的炎症损伤引起（Jessie等人，2004年；Lima等人，2007年；Pagliari等人，2016年）。这种模式表明，病毒血症主要来自受感染的小管上皮细胞，细胞因子诱发的小管坏死和上皮通透性的增加进一步促进了病毒泄漏到小管腔内，尤其是在临床严重病例中（Lima等人，2007年；Oliveira和Burdmann，2015年；Vachvanichsanong等人，2016年）。对于环状病毒，也有类似的机制描述，病毒包涵体和核酸始终在肾小管上皮细胞中被发现，表明病毒在细胞内活跃复制并通过顶端释放到尿液中，而不仅仅是被动过滤（Cobos等人，2024年；Huang等人，2008年）。因此，在血清病毒血症消退后尿液中仍能检测到DENV RNA，可能反映了小管细胞中低水平的病毒复制或RNA滞留时间延长（Jessie等人，2004年；Lima等人，2007年；Stauber等人，2025年）。这种直接的小管感染、免疫介导的肾损伤和小管清除延迟的组合为DENV病毒血症提供了机制基础，并支持将尿液中的病毒脱落作为定义WBS对登革热实际检测灵敏度的关键参数。这项工作还首次报道了在感染个体的粪便样本中检测到DENV RNA，尽管总体检出率较低，为11%（8/71）。无症状感染的检出率高于有症状感染（15%，6/39 vs 6%，2/32），且其平均病毒载量也更高（187 vs 45拷贝/克），但这些差异无统计学显著性（p > 0.05）。粪便中存在DENV表明病毒通过胃肠道排出，与其他黄病毒（如寨卡病毒）的研究结果一致（Li等人，2018年）。尿液中的病毒RNA排出量（平均=5.22×10^5，范围为0至1.07×10^7拷贝/人/天）显著高于粪便（平均=1.56×10^4，0至4.69×10^5拷贝/人/天）（p < 0.0001）。此外，有症状个体的尿液中平均病毒载量更高，为8.28×10^5拷贝/人/天（范围为0至1.07×10^7拷贝），而无症状个体为1.80×10^5拷贝/人/天（p = 0.0112）。这些发现表明尿液是病毒排出的主要途径，也是废水中DENV RNA的主要来源，尤其是有症状感染。然而，每人每天的平均DENV RNA排出量（5.80×10^5拷贝）明显低于SARS-CoV-2（10^8–10^10拷贝）（Li等人，2024年）和诺如病毒（10^10–10^11拷贝）（Atmar等人，2008年；Tu等人，2008年）。由于DENV的排出量比SARS-CoV-2或诺如病毒低约2–4个数量级，WBE协议需要处理相应的更大体积的废水才能达到相同的检测概率。先前的一项研究报告称，基于处理500毫升废水，检测灵敏度为每100人中有2例感染（Lee等人，2022年），而我们的研究表明WBS的灵敏度为每100人中有4例感染。这种差异可能源于先前研究仅关注有症状病例，而我们的WBS算法同时考虑了有症状和无症状感染。由于无症状感染也会导致病毒在废水中排出，因此提高了检测能力。通过同时考虑有症状和无症状感染，我们的算法提供了更全面和具有代表性的WBS效果评估，反映了该地区登革热感染的真实流行情况。具体来说，邻近的城市广州在登革热爆发期间实施了废水监测，发现DENV仅在感染住宅下游50米范围内可检测到，检测率为2.3%（14/618），废水处理量为8毫升（Ma等人，2025年）。将这项研究的人口参数、LOD95%和废水处理量纳入我们的WBS模型后，预测的检测概率为每100名居民中有2例感染的采样点的检测概率为2.0%，支持该模型适用于深圳周边城市。应用于寨卡病毒的蒙特卡洛方法同样表明，病毒排出主要是通过尿液进行的，平均总排出量为每天5.37×10^6个基因组拷贝（Chen和Bibby，2023b），这远高于我们研究中观察到的尿液中的DENV排出量。因此，理论上，对于寨卡病毒，即使在感染率低至0.11%的情况下，废水监测也能实现50%的检测概率，这强调了尿液中病毒排出量对WBS灵敏度的关键作用。与SARS-CoV-2和诺如病毒不同，后者即使感染量很少也能在大型废水中持续检测到（Hata和Honda，2020年），而有效的DENV监测需要在社区甚至建筑物层面进行针对性采样。我们的研究还强调了根据监测人口规模调整废水处理量的必要性（图5E）。对于人口约10人的小规模流域（例如，小便池、化粪池、隔离室、蚊子栖息地），62毫升的废水量就足够了。约100人的中型流域（建筑工地、宿舍、酒店、飞机）需要615毫升。约1,000人的大型流域（学校、医院、社区中心、船舶）需要6,150毫升，而10,000人的社区需要61,500毫升。未来的改进应结合大容量浓缩方法（例如超滤、沉淀）和能够处理共浓缩PCR抑制剂的提取方案（Corpuz等人，2020年；McMinn等人，2021年；Schrader等人，2012年），从而实现从社区到市政污水处理厂的多样环境下的可扩展和敏感检测。除了简单的模板稀释降低目标浓度外，还推荐了几种避免抑制剂的策略用于WBS，包括使用qPCR添加剂、抑制剂去除试剂盒和聚维吡咯烷酮等聚合物吸附剂（Hamza和Leifels，2023年）。这项研究存在一些局限性。首先，研究对象主要是来自深圳的男性建筑工人，限制了结果的普遍性。更广泛的研究应包括不同的人口统计特征和地理区域，以全面描述病毒排出动态。其次，样本收集仅限于急性期（诊断后第一周），因此未检查后期病毒排出情况。需要纵向采样以确定康复期间的排出持续时间。第三，所有感染均由DENV 2型引起，因此四种血清型之间的潜在排出差异尚不清楚。针对特定血清型的研究将提高WBS的灵敏度和血清流行率估计（Bos等人，2025年；Monteiro等人，2024年）。第四，不同的病毒浓度和RNA提取方法及其相关的回收效率可能会影响未来应用中WBS的灵敏度（Chandra等人，2023年；Rusi?ol等人，2020年）。总之，由于无症状感染导致虫媒病毒流行率被低估，因此需要像WBS这样的补充工具。我们的发现为将WBS应用于DENV检测提供了框架，尤其是在临床监测不足的情况下，可以提前发出疫情警告。通过为10至10,000人的人群提供模型衍生的、可扩展的采样量，这项研究支持了有针对性的公共卫生干预措施，如媒介控制、疫苗接种和保护易感群体。最终，这些见解不仅增强了针对DENV的准备，也增强了对其他虫媒病毒的应对能力，提高了早期检测、疫情预防和疾病负担的减轻。