血清CCL1蛋白有助于区分脓毒症和急性胰腺炎中的感染性全身炎症与无菌性全身炎症

《Scientific Reports》：Serum CCL1 discriminates infectious and sterile systemic inflammation in sepsis and acute pancreatitis

　　摘要
在系统性炎症性疾病中区分感染性和非感染性病因可能具有挑战性，因为临床表现存在重叠，且缺乏可靠的鉴别生物标志物。调节性T细胞（Tregs）可调节免疫反应，其功能受特定趋化因子（包括CCL1和CCL22）的调控。我们研究了这些吸引Tregs的趋化因子在感染性炎症与无菌性炎症中的表达是否存在差异。这项前瞻性、单中心生物标志物研究纳入了败血症、急性胰腺炎患者以及无传染性疾病的住院对照组。在研究第1、3、5和7天收集血清样本，检测CRP、IL-6、PCT、CCL1和CCL22的水平。2019年3月至2022年10月期间，共纳入159名患者，其中急性胰腺炎45例，确诊败血症15例，住院对照组99例。传统的炎症参数CRP、IL-6和PCT表现出了典型的动态变化特征。CCL1水平下降（而CCL22水平未变化），这有助于在所有时间点区分急性胰腺炎和败血症。此外，在败血症患者中，CCL1水平与器官衰竭的严重程度呈负相关。CCL1有望成为区分败血症和急性胰腺炎中无菌性与非无菌性炎症的生物标志物，从而有助于临床决策，并促进抗生素的精准使用。

背景
系统性炎症性疾病常表现为急性且可能致命的综合征，需要及时诊断和立即治疗。其中，败血症和急性胰腺炎都是具有日益重要流行病学意义的急性炎症性疾病。败血症是指由于宿主对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。器官衰竭是败血症的关键要素，通过SOFA评分等评分系统进行评估。急性胰腺炎虽然大多数情况下病情较轻或仅中度严重，但也可能导致严重的器官衰竭。这两种疾病都以复杂的免疫失调为特征。尽管临床表现有重叠，但败血症和胰腺炎的管理方法存在显著差异：败血症需要早期使用抗生素，而胰腺炎通常不需要使用抗生素。在实际临床中，由于两者临床表现相似，区分由败血症或急性胰腺炎引起的系统炎症颇具挑战性，因为传统的炎症血清标志物（如C反应蛋白CRP和白细胞介素-6 IL-6）在两种疾病中都可能升高，导致诊断困难。研究表明，调节性T细胞（Tregs）在维持免疫稳态和调节免疫反应中起关键作用。Tregs在稳态和炎症状态下的空间分布及组织招募过程由趋化因子调控，其中CCL1和CCL22属于CC趋化因子家族，是主要的吸引Tregs的趋化因子，在稳态及感染、自身免疫和癌症等炎症状态下发挥重要作用。CCL1通过CCR8受体发挥作用，主要由活化T细胞、单核细胞和巨噬细胞产生，促进表达CCR8受体的细胞（如Tregs）的募集；CCL22通过CCR4受体作用，主要由树突状细胞（DCs）和巨噬细胞分泌，介导Tregs的迁移并促进Tregs与DCs之间的相互作用。

本研究旨在寻找能够可靠区分细菌性败血症和急性胰腺炎引起的无菌性炎症的新生物标志物。我们发现，CCL1和CCL22的血清水平与基线特征无关。虽然CCL22在败血症患者中最初降低，但无法有效区分这两种疾病；而CCL1在急性胰腺炎患者中降低，在所有测量时间点均能显著区分这两种疾病，并且CCL1水平与败血症患者的器官功能障碍呈负相关。因此，未来应进一步评估CCL1在临床决策和预后预测中的价值。

研究人群
2019年3月至2022年10月期间共纳入159名患者，基线特征见表2。对照组共99名住院患者，急性胰腺炎患者45名，败血症患者15名。各组在年龄、吸烟状况、饮酒习惯及冠心病患病率等方面存在显著差异，但在其他流行病学和医学因素方面大致平衡。159名患者在第1天均采集了血清样本，其中121名患者在第3天也采集了样本；24名急性胰腺炎患者和10名败血症患者在第1、3、5天均采集了血清样本。中位观察期为3天。

疾病病因
败血症最常见的原因是尿路感染（7例），其次是肺炎（2例），其余患者病因多样。15名患者中有9名（60%）的血培养结果呈阳性。急性胰腺炎最常见的病因是胆道问题和酒精相关性因素（16例和10例），其余患者病因复杂或原因不明（8例和11例）。15名败血症患者中有10名在入院首日即被送入ICU或IMC，2名因医疗或个人原因未升入高级别监护单元，3名在入院时未进入这些单位。首日SOFA中位分为11分（IQR 9–11分）。ICU/IMC患者的中位SOFA分为11分（IQR 10–13分），非ICU/IMC患者的中位SOFA分为8.5分。

传统的炎症血清标志物在患者队列中表现出典型的动态变化。败血症和急性胰腺炎患者的CRP、PCT和IL-6水平均升高。我们分别在研究第1、3、5和7天检测了这些参数，结果符合预期，证实了患者队列的代表性。

研究设计
我们比较了急性胰腺炎和败血症患者队列中CCL1和CCL22的水平，发现CCL1在急性胰腺炎患者中显著降低；而CCL22在两种疾病中的变化不显著。进一步探索CCL1的诊断潜力时，发现其在急性胰腺炎患者中的鉴别能力中等至良好，但需注意研究的探索性和样本量限制。

结果
CCL1水平与败血症患者的器官衰竭严重程度呈负相关，表明其在临床应用中的潜在价值。此外，某些基线特征（如年龄、吸烟状况和冠心病）在两组患者间的血清CCL1和CCL22水平分布存在差异：吸烟者PCT水平较高，糖尿病患者CRP水平升高。但这些特征与血清CCL1或CCL22水平无显著相关性。因此，血清CCL1可作为区分这两种疾病的实用生物标志物。

结论
研究表明，CCL1在区分急性胰腺炎和败血症方面具有显著作用。高水平的CCL1与较低的器官衰竭风险相关，这提示其在临床应用中的潜在价值。然而，某些基线特征与血清CCL1或CCL22水平无显著相关性，这提示这些特征可能不影响其作为生物标志物的适用性。统计分析使用了双尾Mann-Whitney-U检验。确定了入住中级护理病房（IMC）或重症监护病房（ICU）的败血症患者以及普通病房（无IMC/ICU）接受治疗患者的CCL1血清水平。图表显示了平均值±标准误差（SEM）。统计分析使用了双尾Mann-Whitney-U检验。

讨论

在这项前瞻性生物标志物研究中，我们评估了已知的炎症标志物以及吸引调节性T细胞的趋化因子CCL1和CCL22，在159名败血症、急性胰腺炎患者和住院对照组的样本中进行了研究。值得注意的是，CCL1水平在急性胰腺炎和败血症患者中表现出不同的趋势，在所有测量时间点上，其区分能力逐渐提高，并在第5天达到最高水平。此外，较高的CCL1水平可能与败血症中早期器官功能障碍的减少有关，这表明它可能具有预后作用，需要在更大规模的队列中得到验证。结合其在败血症和急性胰腺炎之间的区分能力，CCL1成为一个具有转化医学意义的候选生物标志物。

据我们所知，之前尚未对败血症或急性胰腺炎患者的系统性CCL1水平进行研究。先前的数据将升高的CCL1水平与自身免疫性胰腺炎38和其他自身免疫性疾病13,20,23,39,40,41联系起来，而外周血单核细胞（PBMCs）上CCR8（CCL1的受体）的高表达与各种原因引起的严重急性胰腺炎相关42。我们研究中急性胰腺炎和败血症血清CCL1水平差异调节的机制仍不清楚。急性胰腺炎主要是由受损腺泡细胞释放的损伤相关分子（DAMPs）引起的无菌性炎症驱动的，而败血症是由感染引发的，并涉及强烈的模式识别分子（PAMP）驱动的先天免疫激活43,44。这些不同的上游信号可能产生不同的趋化因子调控程序。在这方面，小鼠败血症模型中显示肺泡巨噬细胞通过Wnt/β-连环蛋白信号通路上调CCL145，这一通路在无菌性炎症中不太可能被激活。与此一致的是，在NLRP3炎性小体激活后，B组链球菌膜囊泡在人类巨噬细胞系中诱导的趋化因子中也发现了CCL146。

此外，CCL1通过CCR8信号传导，CCR8表达在调节性T细胞上，CCL1-CCR8相互作用可以促进调节性T细胞的招募和抑制功能13。因此，我们推测急性胰腺炎中循环中的CCL1减少可能反映了系统性诱导的减少和/或组织水平上CCL1的消耗增加，而败血症中较高的CCL1水平可能反映了对感染相关刺激的更强免疫激活，并可能与调节过度炎症和器官功能障碍的通路有关。这些解释仍然是假设性的，因为本研究没有包括细胞免疫分析，如PBMC分析或直接评估CCR8表达和调节性T细胞分布。然而，我们的研究是第一个报告这两种情况下系统性CCL1水平的研究，并将这些发现置于一个新兴的机制框架中。

本研究报道了败血症和急性胰腺炎患者以及一大组住院对照组。过去，对照组通常来自健康捐赠者，这可能不能充分反映住院患者的炎症血清水平。尽管如此，住院对照组内的血清CCL1水平表现出明显的异质性，这可能会影响循环趋化因子水平的解释，并表明临床适用的临界值需要在更大规模的队列中得到验证。尽管存在这种变异性，但纳入住院对照组提供了比健康捐赠者更具有临床相关性的比较。

由于临床需求高，过去已经广泛研究了区分败血症和非感染性炎症的诊断参数。尽管有诸多生物标志物被评估，但已建立的参数CRP和PCT通常表现出最佳的区分潜力，尽管它们存在局限性35。在某些临床情况下，包括晚期肾病、大手术、创伤或其他非感染性炎症条件下，PCT的解释仍然具有挑战性，因为这些情况下PCT水平可能独立于细菌感染而升高47。在这种情况下，反映宿主免疫反应不同方面的其他生物标志物可能提供补充的诊断信息。之前尚未在这种背景下探索与调节性T细胞相关的趋化因子。与观察到的败血症和急性胰腺炎之间循环CCL1水平的差异一致，探索性接受者操作特征（ROC）分析显示CCL1在区分这两种疾病方面表现出中等到良好的诊断性能，其中第5天的AUC最高。尽管未来的诊断可能依赖于多模式方法或人工智能支持的算法，但目前评估特定的单一参数对于医疗保健仍然是必不可少的。这强调了CCL1作为急性胰腺炎和败血症患者区分因素的转化医学相关性。在急性胰腺炎的背景下，一个相关的应用可能是在胆源性胰腺炎中，早期识别并发的胆管炎对于指导抗生素使用和内镜逆行胰胆管造影（ERCP）至关重要5,48。我们败血症队列中患者的相对较少反映了这项前瞻性研究的严格纳入标准以及常规临床实践中的招募限制。因此，本研究没有足够的样本量进行正式的诊断验证或确定临床适用的诊断临界值，因此ROC分析应被视为探索性的。因此，未来的研究应该调查CCL1在这种背景下的效用。

与吸引它们的趋化因子相反，调节性T细胞已经在临床前胰腺炎模型中进行了研究，但研究发现结果相互矛盾。急性胰腺炎的小鼠模型显示，CD4+ T细胞的耗竭意外地抑制了疾病的严重程度33，这一效应归因于胰腺内的Th2反应减少而非调节性T细胞数量的变化。相反，更近期的临床前数据支持调节性T细胞的保护作用：在急性胰腺炎的临床前模型中，调节性T细胞被证明能够强烈抑制促炎反应49，而半乳糖凝集素-3缺乏通过促进胰腺内的Foxp3 + 调节性T细胞积累和IL-10的产生来减轻胰腺损伤32。支持这些实验发现的是，一项孟德尔随机化研究发现，静息的CD45RA+ 调节性T细胞是遗传决定的对抗急性胰腺炎保护作用的部分介质31。然而，临床数据仍然存在矛盾：虽然外周血中调节性T细胞数量的增加与较少的器官衰竭相关50，但另一项研究报道在预后较差的患者中特别观察到调节性T细胞计数增加51。旨在增强调节性T细胞活性的药物方法，如Ulinastatin52，通过增加调节性T细胞数量从而改善急性胰腺炎的进程，不仅在临床前环境中显示出益处53，也在临床实践中显示出益处52。这些不同的发现表明调节性T细胞在胰腺炎病理生理学中扮演着复杂的、依赖于背景的角色，既抑制胰腺内的炎症也可能是全身性的，但最终可能导致有害的免疫抑制副作用。因此，CCL1-CCR8轴的发病机制及其对急性胰腺炎中局部和全身性调节性T细胞功能的影响需要在临床前胰腺炎模型中进一步研究。

值得注意的是，我们观察到在败血症中升高的CCL1水平与器官功能障碍的减少有关。一种可能的解释是，高水平的CCL1反映了由于免疫细胞激活而诱导的有效免疫激活，这支持了细菌清除并防止了继发性器官损伤。或者，较高的CCL1浓度可能增强了CCR8依赖的调节性T细胞的招募和激活，从而调节了过度的炎症并可能限制了器官损伤。这种双重解释与当前文献一致，其中调节性T细胞在败血症中与有利和不利的结局相关25,26,27,28,29。然而，仍然是一个引人注目的观察，即CCL1似乎对败血症中的器官功能很重要，而其血液水平保持不变。需要在小鼠败血症模型以及人类患者中进行关于调节性T细胞分布和功能的实质性研究，以解答我们队列中观察到的这种现象的机制背景。

总之，CCL1可能有助于临床推理，从而在这些患者群体中更精确地使用抗生素。败血症中CCL1水平与器官功能障碍之间的负相关进一步表明了其预后作用，这与数据一致，即调节性T细胞在败血症期间具有保护功能。未来的研究还需要阐明CCL1在由急性胰腺炎和败血症引起的全身性炎症中的功能。另一个有前途的方向是将CCL1作为移植患者中的区分生物标志物进行探索，因为在这些患者中区分移植物排斥和感染并发症仍然具有诊断挑战性。除了诊断之外，调节性T细胞及其吸引趋化因子可能代表可药物靶点，以减弱有害的过度炎症反应。

方法

研究设计

我们设计了一项前瞻性、单中心、诊断性研究，以评估与调节性T细胞相关的趋化因子以及其他实验室和临床生物标志物以及住院后七天内的随访参数。研究设计在图1中以示意图形式展示，该图使用BioRender（BioRender.com）创建，可以通过以下链接访问：https://BioRender.com/kb6a9vp。

研究包括三个患者组（表1）：确诊为败血症的患者、由于急性胰腺炎引起的无菌性炎症患者以及患有非炎症性疾病的住院对照患者。 active malignancy、原因不明的发热和急性冠状动脉综合征的患者被排除在外。此外，如果存在无菌性炎症或对照组，确诊的感染也会导致排除。败血症被定义为确诊的感染（如肺炎或膀胱炎）以及SOFA评分至少增加2分，根据Sepsis-3共识指南3。败血症和无菌性炎症组的患者在住院后24小时内被纳入。所有情况下都获得了患者的书面知情同意。

血液收集

第一次血液收集在住院后的第一个早晨进行。在第1天、第3天、第5天、第7天和第14天收集血液，如果患者在此之前出院，则不进行收集。住院对照组的血液在每个时间点收集两次，每次之间有48小时的间隔。

实验室值和趋化因子的测量

患者的血清被转移到LMU实验室医学研究所。根据该研究所的常规做法，测量了C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）和前降钙素（PCT）。患者的另一部分血清被分装并在-80°C下冷冻。随后，根据制造商的协议（Human CCL1/I-309 DuoSet ELISA #DY272，Human CCL22/MDC DuoSet ELISA #DY336，两者均由R&D Systems生产）通过ELISA测定了CCL1和CCL22的血清水平。对于对照组患者，所有血清学参数至少在两个不同的时间点进行了测量，间隔至少48小时，并计算所有测量时间点的平均值以获得血清学标志物的对照值。

临床数据的记录

除了血液收集外，患者的临床数据还在第1天、第3天、第5天和第7天（如适用）以电子病例报告表（eCRF）的形式进行了匿名记录，该表由实验室医学研究所提供。

统计学

统计分析使用了Microsoft Office Excel（版本16.75.2）以及R（版本4.3.1）、R Studio（版本2023.06.0+421）和GraphPad Prism版本10进行。使用了以下R包：tidyverse、readxl、dplyr、lubridate、writexl、ggplot2、ggpubr、ggsignif、nnet和pROC。除非另有说明，否则显著性是用Wilcoxon检验确定的。使用双尾Student’s t检验测试了对照组的测量值是否存在显著的个体差异，如果没有显著性，则计算个别平均值并作为对照值。统计显著性定义如下：* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001，**** = p < 0.0001。进行了接受者操作特征（ROC）曲线分析，以评估第1天、第3天和第5天血清CCL1在败血症和急性胰腺炎之间的区分性能。败血症被定义为阳性结果，急性胰腺炎被定义为阴性结果。计算了每个时间点的曲线下面积（AUC）值。

伦理

该研究于2018年12月12日得到了LMU伦理委员会的审查和批准（内部记录698-16）。所有参与者在参与研究之前都提供了知情同意。