长期施用氮肥对高山草地土壤线虫群落的影响：土壤酸化及线虫的功能响应

《Global Ecology and Conservation》：Long-term impacts of nitrogen addition on soil nematode communities in alpine meadows: soil acidification and functional responses

　　姜京汉|侯彦月|布海燕|李淑霞|张志明|刘倩|边珍|叶倩|张志龙|刘坤
中国甘肃省兰州市兰州大学草地改良与草原农业生态系统国家重点实验室

摘要
气候变化和人类活动的协同效应加速了大气氮沉降，尤其是在青藏高原等生态敏感地区。氮沉降可能通过改变碳的吸收和储存能力来影响生态系统功能。作为土壤食物网的关键组成部分，线虫群落动态是氮沉降影响下土壤健康状况的重要指标。我们在青藏高原东部的高山草甸进行了为期七年的氮添加实验（0、5、10、20克氮/平方米每年），以研究氮对土壤线虫群落的调控机制。尽管总线虫数量和α多样性没有显著变化，但群落组成和富集指数（EI）在不同氮梯度下发生了显著差异，这主要是由土壤酸化（pH值从6.11下降到5.01）以及土壤有机碳（C）、铵态氮（NH??-N）和硝态氮（NO??-N）可用性的变化引起的。功能代谢足迹和EI对氮输入表现出非线性响应。因此，氮的富集通过直接提供更多资源和间接导致土壤酸化来改变线虫群落，而耐受性线虫物种通过补偿机制帮助维持稳定的生态系统功能。

1. 引言
大气氮（N）沉降是陆地生态系统外部营养输入的重要部分（Sun等人，2022年），通过改变生态系统的物理化学性质显著影响物种多样性和个体数量（Phoenix等人，2006年；Bobbink等人，2010年）。人类活动，尤其是农业、工业和交通，导致氮沉降大量增加，这对生物多样性和生态系统稳定性构成了重大威胁（Liu等人，2013a年；Liu等人，2013b年）。在这种背景下，阐明大气氮沉降对不同生态系统的影响机制已成为全球变化研究中的关键问题之一。
土壤线虫是地球上数量最多的后生动物，几乎存在于所有生态系统中（Kergunteuil等人，2016年；Holterman等人，2019年）。线虫在土壤食物网中占据不同的营养级，它们在分解土壤有机物、维持土壤生态系统稳定性和促进物质循环与能量流动方面起着关键作用（Zhao等人，2012年；Zhao等人，2021年）。此外，线虫能快速响应环境变化，其多样性受土壤物理化学性质和食物资源可用性的调控。不同营养级的线虫对环境压力的反应也不同。因此，土壤线虫是土壤生态系统健康的重要指标（Bongers和Ferris，1999年；Yeates和Bongers，1999年；Yeates，2003年）。鉴于这些特性，线虫群落动态是大气氮沉降的高度代表性的生态指标。
虽然已有研究在全球范围内评估了土壤线虫对氮沉降的反应（Zhou等人，2021年），并且在不同生态系统中进行了区域研究（Liu等人，2019年；Ma等人，2023年；Wang等人，2023年），但关于氮施用对线虫群落影响的结论仍存在显著不一致性（Xing等人，2023年）。这种不确定性在青藏高原的高山草甸等生态脆弱地区尤为明显。该地区不仅对气候变化高度敏感，其高山生态系统还在碳封存、养分循环和生物多样性保护中发挥关键作用（Cai等人，2025年）。
关于氮添加对青藏高原土壤线虫群落影响的研究结论高度不一致。我们认为这种不一致性主要源于氮输入形式和观察时间尺度的差异。具体而言，首先，氮磷联合施用和单独施用对线虫群落有截然不同的影响。Ma等人（2024年）指出，单独施用氮显著降低了土壤微食物网的结构指数（SI）和富集指数（EI），导致食物网简化，而氮磷联合施用则增加了EI和SI。其次，采样时间也会影响研究结论的差异。Hu等人（2017年）发现，氮磷复合肥料增加了总线虫数量（尤其是食细菌线虫），但降低了生物多样性，随后在该地区的研究揭示了线虫数量与多样性之间存在驼峰状关系（Hu等人，2022年）。此外，不同营养级线虫对环境压力的不同反应也增加了总体结论的复杂性。例如，Hou等人（2023年）观察到施氮后食草线虫的数量和丰富度显著下降，而食真菌线虫未受到显著影响。总体而言，这些研究证实，目前尚未就氮添加对青藏高原土壤线虫群落的影响达成明确共识。因此，需要进一步研究以阐明氮添加对土壤线虫群落的影响。基于此，在高山草甸生态系统中进行长期、多梯度的纯氮添加实验，系统阐明单次氮输入对线虫群落结构和功能的影响，仍具有重要的研究价值。
我们的研究是青藏高原东部高山草甸长期氮添加梯度实验（0、5、10、20克氮/平方米每年，持续7年）的一部分。为了研究长期氮添加对土壤线虫多样性、群落结构和功能的影响，并确定关键驱动机制，我们提出以下假设：1）长期氮沉降将直接影响土壤线虫群落的总数量和多样性；2）氮沉降会通过改变土壤物理化学性质和资源可用性直接影响或间接影响土壤线虫群落；3）土壤线虫群落的功能特征，如代谢足迹和功能指数，将对氮添加表现出阈值依赖性的响应。

2. 材料与方法
2.1. 研究地点
研究在中国甘肃省甘南草地生态系统国家观测与研究站（北纬33°40′，东经101°52′）进行，位于青藏高原东部。该地点海拔3550米，具有典型的高山气候：冬季寒冷、夏季凉爽，昼夜温差大。年平均气温为1.2°C，1月平均气温为-10.7°C，7月平均气温为11.7°C（Liu等人，2013a年；Liu等人，2013b年）。1983年至2013年间，年平均降水量为620毫米，主要集中在夏季。该地区每年接收约2580小时的阳光，有大约270个霜冻日。土壤类型为高山草甸土（Ma等人，2018年），植被主要由嵩草（Cyperaceae）、银莲花（Ranunculaceae）、羊茅（Poaceae）、早熟禾（Poaceae）和龙蒿（Asteraceae）组成（Liu等人，2022年）。

2.2. 实验设计
该实验于2015年春季在青藏高原东部的一个氮限制高山草甸设置，采用随机区组设计（Liu等人，2021年）。建立了9个实验区块（每个区块10米×6米），区块具有均匀的地形和坡向，彼此间距2-3米。每个区块划分为4个样地（2米×4米），之间有2米宽的缓冲区以减少处理间的干扰。实施了四种处理：对照组（N0，不施氮）、低氮处理（N1，5克氮/平方米每年）、中等氮处理（N2，10克氮/平方米每年）和高氮处理（N3，20克氮/平方米每年），每种处理重复9次。自2015年起，在每年5月初手动向N1-N3样地施用颗粒状缓释硝酸铵（NH?NO?），并与降雨同步以助于溶解（Liu等人，2021年）。对照组样地在建立后未进行任何干预，以保持自然条件并避免人为干扰。

2.3. 土壤采样
2022年夏季，从每个实验样地随机采集3个土壤芯样（直径3.8厘米，深度10厘米）。将三个芯样混合均匀并去除根、砾石和枯枝落叶后，合并成一个复合样本。每个复合样本分为两部分：一部分用于提取线虫，另一部分通过2.0毫米筛网筛选后储存在4°C下。对于筛过的部分，我们测量了土壤含水量（SM）、铵态氮（NH??-N）、硝态氮（NO??-N）和有效磷（AP）。剩余的土壤在暗处风干后用于测定pH值、总氮（TN）、总磷（TP）、土壤有机碳（C）和土壤有机质（SOM）。

2.4. 土壤物理化学分析
通过将10克新鲜土壤置于铝盒中，在105°C下烘烤至恒重来测定SM。使用2摩尔/升的KCl提取10克新鲜土壤，并摇晃30分钟后静置。使用连续流动分析仪（Auto Analyzer，Skalar Breda，荷兰）（Esala，1995年）分析上清液中的NH??-N和NO??-N。AP也使用连续流动分析仪测定。TN采用凯氏定法测定，而TP则通过HClO?–H?SO?消化后进行比色测定。C通过重铬酸钾体积法测定，SOM含量使用公式计算：SOM = C × 1.724。土壤pH值在1:2.5的土壤-水悬浮液中进行测定，搅拌并静置后使用pH计测量。

2.5. 线虫群落分析
我们使用Baermann漏斗技术在48小时内从30克新鲜土壤中提取线虫（Barker，1985年）。然后在显微镜下计数并鉴定线虫至属级（Olympus CX31）。线虫群落分为四个营养级：食细菌线虫（Ba）、食真菌线虫（Fu）、杂食性-捕食者线虫（OP）和植物寄生线虫（Pp）（Yeates等人，1993年；Bongers和Bongers，1998年）。根据生活史策略，线虫进一步分为五个殖民者-持久者（c-p）组，从c-p1到c-p5（Bongers，1990年）。在本研究中，c-p1和c-p2线虫被视为r-策略者，c-p3至c-p5线虫被视为K-策略者（Cesarz等人，2017年）。我们计算了每个土壤样本以及每个营养级和c-p类的线虫绝对和相对丰度。为了评估线虫群落多样性，我们使用了Shannon-Wiener指数（H′）、Simpson指数（D）、Pielou均匀度指数（J′）和丰富度指数（SR）（Yeates和Bongers，1999年）：
Shannon-Wiener指数：(1)
H′ = ?∑p?×lnp?
Simpson指数：(2)
D = ∑p?
Pielou均匀度指数：(3)
J′ = H′/lnS
丰富度指数：(4)
SR = S?1/lnN
其中S是属的数量，N是线虫总数，p?是该属在群落中的比例。
线虫的生态指数通过以下公式计算（Bongers，1990年）：
(5)
成熟度指数（MI）= ∑vi×p?
其中v(i)是第i属的c-p值，pi是该属在群落中的比例。植物食性线虫未被纳入MI计算。

土壤食物网分析包括富集指数（EI）、结构指数（SI）、基础指数（BI）和通道指数（CI）。使用加权功能类群来推导食物网的组成部分：基础组分（b）、富集组分（e）和结构组分（s），反映土壤食物网的结构和功能（Ferris等人，2001年；Ferris，2010年）：
(6)
富集指数（EI）= 100×e/e+b
(7)
结构指数（SI）= 100×s/s+b
(8)
基础指数（BI）= 100×b/e+s+b
(9)
通道指数（CI）= 100×Fu2×w2/Ba1×w1+Fu2×w2
其中w表示每个功能类的加权因子。
线虫代谢足迹（NMF）的计算如下（Yeates，2003年）：
(10)
NMF = ∑N?×0.1×W?/m?+0.273×W?
其中N?是t分类群的丰度，m?是t分类群的c-p值，W?是单个线虫的鲜重（μg）。鲜重数据来自NEMAPLEX数据库（http://nemaplex.ucdavis.edu）。富集足迹（Fe）和结构足迹（Fs）基于线虫的生活史策略得出，功能代谢足迹为Fe和Fs的总面积。坐标点分别为：(SI - 0.5 × Fs / k, EI)、(SI + 0.5 × Fs / k, EI)、(SI, EI - 0.5 × Fe / k) 和 (SI, EI + 0.5 × Fe / k)，其中k是转换常数（Ferris，2010年）。

2.6. 数据分析
根据数据正态性进行统计分析。对于正态分布的数据，使用参数检验（ANOVA和Tukey’s HSD检验），对于非正态数据，使用非参数检验（Friedman检验和Dunn’s检验及Bonferroni校正）。这些分析了线虫总数量、α多样性指数（Shannon-Wiener、Simpson、Pielou均匀度、丰富度）、功能指数（MI、EI、CI、BI、SI）以及土壤物理化学性质对氮肥化的响应。
EI与氮添加量的关系通过多项式回归分析。最佳拟合模型通过赤池信息量准则（AIC）选定。线虫的功能性代谢足迹是通过R语言中的ggplot2包可视化的。基于Bray-Curtis相似性矩阵的非度量多维缩放（NMDS）是使用R语言中的vegan包（Oksanen等人，2025年）进行的，以评估氮肥施用对线虫群落结构的影响。通过基于Bray-Curtis相似性的排列多元方差分析（PERMANOVA；999次排列）来检查处理之间的显著差异。使用Benjamini-Hochberg校正进行成对比较，以控制错误发现率。冗余分析（RDA）用于评估线虫群落与土壤物理化学性质之间的关系。线虫群落数据经过Hellinger变换，以减少优势物种的权重并改善线性模型假设。环境变量（如pH值、NH??-N、NO??-N、C）进行了标准化。在RDA之前，使用方差膨胀因子（VIF）评估了环境变量之间的相关性，并移除了VIF大于5的变量，以避免多重共线性效应。我们将排列测试与层次划分分析（使用rdacca.hp包）结合使用（Lai等人，2022年），以定量和定性识别重要的环境驱动因素，并区分各个变量对群落变异的贡献。贝叶斯结构方程模型（BSEM；brms包）（Bürkner，2021年）用于探索氮肥施用对线虫群落功能和结构的直接和间接影响。基于ANOVA结果和先前的研究建立了先验概念模型。土壤pH值和养分含量被设为中介变量，而EI和NMDS轴被用作响应变量（图S1）。根据之前的土壤方差分析和群落结构RDA的结果，NO??-N、NH??-N和C被选为土壤养分的指标。然后通过这三个指标的主成分分析（PCA）的首个主成分（PC1）来表示养分含量，该主成分解释了总方差的56.47%（Chen等人，2016年；Cui等人，2022年）。模型指定使用了默认先验。通过Gelman-Rubin诊断确认了收敛性（R? ≈ 1），所有效应的有效样本量（ESS）都大于5,000。如果95%的可信区间（CrI）不包括零，则认为种群水平效应显著。我们使用近似留一交叉验证（LOOIC；loo包）（Vehtari等人，2017年）验证了模型。模型收敛性通过迹线图分析进行了验证，并使用bayesplot R包（Gabry等人，2019年）进行了后验预测检验。所有统计分析都是使用R版本4.4.2（R核心团队，2024年）进行的。

3. 结果
3.1. 土壤物理化学性质
土壤物理化学性质受到氮添加的显著影响。随着氮输入的增加，NO??-N和NH??-N的浓度均增加，在N3处理下达到峰值。N3处理下的总氮（TN）显著高于N1和N2处理，但与CK处理没有显著差异。随着氮添加量的增加，土壤pH值逐渐降低，在N3处理下达到最低值，表明发生了显著的酸化。碳（C）表现出非线性响应，在低至中等氮输入下减少，但在N3处理下恢复到对照水平。土壤有机质（SOM）也遵循相同趋势，且在高氮输入下与CK处理相比，相关参数没有显著变化。
磷相关参数（AP和TP）和土壤湿度（SM）在不同处理间没有显著差异（表1）。因此，氮肥施用选择性地改变了氮循环和有机动态，而不是磷的有效性或水文条件。
表1. 不同氮肥处理下的土壤物理化学性质
空单元
CK
N1
N2
N3
NO??-N (mg kg?1) 10.64 ± 1.82b 19.28 ± 4.28ab 28.72 ± 2.95a 40.98 ± 6.83a
NH??-N (mg kg?1) 116.45 ± 11.87ab 102.40 ± 3.28a 107.02 ± 4.12ab 157.81 ± 20.27b
TN (%) 0.45 ± 0.02ab 0.42 ± 0.02b 0.42 ± 0.01b 0.49 ± 0.02a
pH 6.11 ± 0.03a 5.91 ± 0.04a 5.64 ± 0.07b 5.01 ± 0.06c
SM (%) 48.39 ± 1.50a 46.99 ± 1.74a 44.99 ± 0.98a 48.03 ± 2.13a
AP (mg kg?1) 15.55 ± 1.01a 11.75 ± 0.93a 14.21 ± 2.31a 15.58 ± 1.15a
TP (mg kg?1) 989.64 ± 32.82a 815.32 ± 73.23a 855.03 ± 53.63a 919.89 ± 48.84a
C (g kg?1) 51.19 ± 1.61a 45.87 ± 2.87ab 39.60 ± 1.54b 53.64 ± 3.93a
SOM (g kg?1) 88.24 ± 2.78a 79.08 ± 4.95ab 68.27 ± 2.65b 92.48 ± 6.78a
注释：数据以平均值±标准误差（n = 9）表示。同一行内的不同小写字母表示处理间存在显著差异（p < 0.05）。
CK：对照（0 g N m?2 year?1）；N1：低氮（5 g N m?2 year?1）；N2：中氮（10 g N m?2 year?1）；N3：高氮（20 g N m?2 year?1）。
NO??-N：硝态氮；NH??-N：铵态氮；TN：总氮；pH：土壤pH值；SM：土壤湿度；AP：有效磷；TP：总磷；C：土壤有机碳；SOM：土壤有机质。
3.2. 线虫群落组成和多样性
线虫营养群组（Ba、Fu、OP和Pp）和c-p类别的总丰度不受氮添加处理的影响。然而，某些组的绝对丰度和相对丰度显示出明显的变化趋势。Ba和Fu随着氮输入的增加而增加，而c-p2和c-p3类别在不同处理中占主导地位（图1）。α-多样性指数，包括Shannon-Wiener、Simpson、丰富度和均匀度，不受处理的影响（表2）。
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图1. 不同氮肥处理下营养群组（a）和定殖者-持久者（c-p）类别（b）的组成。Ba：细菌食者；Fu：真菌食者；OP：杂食性-捕食者；Pp：植物寄生虫。
表2. 不同氮肥处理下的线虫多样性指数
指数 CK N1 N2 N3
Shannon-Wiener 1.78 ± 0.15a 2.05 ± 0.15a 1.94 ± 0.10a 1.86 ± 0.14a
Simpson 0.76 ± 0.04a 0.83 ± 0.03a 0.82 ± 0.02a 0.79 ± 0.03a
丰富度 9.22 ± 1.27a 10.78 ± 1.39a 9.33 ± 1.04a 8.89 ± 1.30a
均匀度 0.86 ± 0.03a 0.90 ± 0.01a 0.89 ± 0.03a 0.89 ± 0.03a
注释：数值表示平均值±标准误差（n = 9）。同一行内的相同小写字母表示处理间无显著差异（p > 0.05）。
NMDS显示不同处理间线虫群落组成存在显著差异（PERMANOVA：R2 = 0.20, F(3, 32) = 2.65, p = 0.001）（图2）。有趣的是，这种群落结构的变化与之前观察到的稳定α-多样性形成鲜明对比。随后的成对比较进一步证明了CK与N2（p = 0.001）、CK与N3（p = 0.001）、N1与N3（p = 0.001）以及N2与N3（p = 0.030）之间的显著差异（表S1）。总之，这些结果表明，尽管群落多样性没有显著变化，但氮的添加选择性地重塑了线虫群落。
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图2. 氮肥处理下线虫群落组成的非度量多维缩放（NMDS）。应力值 = 0.27。PERMANOVA结果：R2 = 0.20, F(3, 32) = 2.65, p = 0.001。彩色椭圆代表每个处理组的95%置信区间。点对应于单个样本。
3.3. 线虫群落功能指数和功能性代谢足迹
氮添加对Enrichment Index（EI）有显著影响（F(3, 22) = 4.47, p = 0.014）（表3）。EI首先随着N1的增加而增加，在N2处理下减少，然后在N3处理下部分反弹（图3）。与氮添加对基础资源富集的强烈影响相反，其他功能指数，包括Structure Index（SI）、Basal Index（BI）和Channel Index（CI），在不同处理间没有显著差异（表3）。
表3. 不同氮肥处理下的线虫功能指数
指数 CK N1 N2 N3
MI 2.92 ± 0.16a 2.71 ± 0.19a 2.42 ± 0.12a 2.45 ± 0.12a
EI 11.44 ± 4.94b 40.25 ± 4.83a 33.56 ± 5.50ab 38.47 ± 7.65a
SI 72.32 ± 6.17a 65.27 ± 9.69a 49.94 ± 9.97a 51.26 ± 9.54a
BI 26.44 ± 5.82a 27.29 ± 7.11a 38.22 ± 6.82a 37.00 ± 6.49a
CI 100.00 ± 0.00a 39.22 ± 13.19a 68.89 ± 15.67a 53.89 ± 13.97a
注释：数值表示平均值±标准误差（n = 9）。同一行内的不同小写字母表示处理间存在显著差异（p < 0.05）。
MI：成熟度指数；EI：富集指数；SI：结构指数；BI：基础指数；CI：通道指数。
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图3. 线虫群落的富集指数（EI）随氮添加的变化。实线代表显著的三次多项式拟合（调整后的R2 = 0.25, F(3, 30) = 4.58, p = 0.009）。0：CK（0 g N m?2 year?1）；1：N1（5 g N m?2 year?1）；2：N2（10 g N m?2 year?1）；3：N3（20 g N m?2 year?1）。
功能性代谢足迹主要分布在C和D象限，分别代表生态系统的稳定和退化阶段。除了N2处理外，所有处理的质心都在C象限，表明土壤食物网结构相对稳定。然而，在N2和N3处理下，部分向D象限偏移。总的功能性代谢足迹由菱形多边形的面积表示，顺序为N1 > N3 > N2 > CK（图4）。这一趋势与EI响应一致。
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图4. 不同氮处理下线虫群落的功能性代谢足迹。每个足迹的垂直轴代表富集足迹，水平轴代表结构足迹。
3.4. 土壤物理化学性质对线虫群落的影响
RDA显示氮添加处理显著影响土壤线虫群落（F(8, 19) = 1.57, p = 0.002）。影响线虫丰度的主要环境变量是pH值、C（有机碳）、NH??-N和NO??-N（图5a）。这两个轴共同解释了总变异的59.13%。其中，pH值贡献最大（27.70%），其次是C和NH??-N，而NO??-N的贡献最小（图5b）。
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图5. 冗余分析（RDA）揭示了不同土壤线虫食性群组与环境因素之间的关系（a）。红色箭头表示具有显著影响的土壤物理化学性质（p < 0.05）。层次划分（HP）分析（b）。排列测试得到了显著结果（F(8, 19) = 1.57, p = 0.002），累积方差解释率为59.13%。
BSEM表明，氮肥施用主要通过直接效应和通过降低土壤pH值介导的间接级联途径调节土壤线虫群落结构和功能（图6）。具体来说，施肥显著降低了土壤pH值，同时增加了土壤养分含量。土壤pH值对EI有正面影响，但对NMDS1轴（代表群落组成）有负面影响。此外，施肥直接增加了EI，表明氮输入直接调节了线虫的功能动态。然而，土壤养分对EI没有显著影响。所有报告的效应都具有统计学显著性（95%可信区间不包含零），这一结论得到了可靠的模型诊断支持（Gelman-Rubin R? ≈ 1；有效样本量 > 5,000）（表S2），并通过留一交叉验证（LOOIC）得到验证，Pareto k值小于0.70（表S3）。模型收敛性好（图S2，图S3）。为了更好的清晰度，移除了不显著的路径。
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图6. 方框代表模型中包含的变量。箭头上面的值表示估计值，箭头宽度根据估计值的大小进行缩放。蓝色箭头表示正面效应，红色箭头表示负面效应。模型仅显示显著效应。

4. 讨论
本研究评估了氮添加对线虫群落动态的影响，部分结果支持了最初假设。与预期相反，尽管观察到了线虫群落的组成变化，但总丰度和多样性指数在不同处理间没有显著差异，这与长期氮沉积将直接影响土壤线虫群落的总丰度和多样性的假设相矛盾。这种差异可能是由于耐受性类群之间的功能冗余和补偿机制。尽管如此，氮输入确实通过双重途径调节了线虫群落的功能和结构。首先，长期氮添加不仅直接影响EI（代表资源利用能力），还通过诱导的土壤酸化间接驱动了群落结构的分化和功能指数的变化。其次，EI和代谢足迹都表现出非线性响应。EI和代谢足迹在低氮添加处理（N1）下达到峰值，进一步氮添加导致它们下降，表明氮添加对土壤线虫群落的功能特征具有阈值效应。

4.1. 线虫丰度和多样性的稳定性
与我们的假设相反，不同的氮梯度并未显著影响线虫群落的总丰度和α-多样性指数（表2）。然而，这种看似稳定的群落实际上是由于群落内部的重组造成的。我们发现不同的线虫营养群组和c-p类别对氮添加表现出不同的响应。根据绝对和相对丰度的分析，Ba和Pp主导了线虫群落（图1a），主要由采用r选择生活史策略的c-p2群体组成（图1b），包括Acrobeloides、Cephalobus和Atetylenchus。这些线虫的特点是世代时间短、繁殖率高且对干扰具有很强的抵抗力（Bongers, 1990；?alamún等人, 2012）。长期氮输入后，土壤发生了酸化（表1）。土壤pH值下降所引起的扰动调节了土壤线虫的分布和活动（Li等人，2010年；Zhang等人，2021年），导致K策略型线虫（如c-p4和c-p5）的数量减少。然而，这并没有导致总数量显著下降，因为由此空出的生态位很快被前述的c-p2类群占据，这些类群的数量相应增加，从而缓解了氮对整个群落数量的影响（Zhao等人，2014年）。有趣的是，物种替换发生在同一营养级或c-p类群内部，这意味着新殖民的类群在功能上与原有类群相当，因此α多样性指数没有显著变化（Hillebrand等人，2018年）。这种模式支持了功能冗余假说。本研究中的数量和多样性稳定性与一些长期观察结果一致（Cheng等人，2008年；Cheng等人，2021年；Li等人，2024年），表明在养分限制的生态系统中，氮输入引起的物种更替可以通过功能冗余机制维持群落数量和多样性的表观稳定性。此外，实验中的氮梯度（0–20克氮每平方米每年）可能仍然低于扰乱该生态系统地下群落的临界阈值（Liu等人，2020年）。该系统仍处于自我调节的弹性范围内（Elmqvist等人，2003年），这也解释了我们结果的稳定性。

4.2 施肥对群落组成的影响
尽管α多样性指数和数量保持稳定，氮的添加仍然改变了土壤线虫群落的组成（图2，表S1）。硝酸铵（NH?NO?）中的铵离子（NH??）会促进质子积累（Guo等人，2010年；Chen等人，2023年），最终导致土壤酸化（表1）。作为主要的环境驱动因素，土壤pH值可能通过改变微生物资源的可用性和线虫表皮的渗透性来发挥作用（Rousk等人，2010年；Ren等人，2018年；Hu等人，2024年）。首先，高氮添加通过降低pH值间接改变了群落结构，筛选出耐酸的物种并淘汰了敏感物种（图6）。这与环境筛选假说（Keddy，1992年；Le Bagousse-Pinguet等人，2017年）一致。其次，土壤酸化对线虫的影响并不仅仅是通过生理毒性来实现的。更重要的是，它调节了食物资源的可用性，通过重塑微生物资源网络产生连锁效应。在低pH环境中，真菌通常具有竞争优势（Sun等人，2016年），促进了耐酸真菌的生长，为其他物种创造了更多生态位和食物资源（图1a）。尽管由养分富集引起的土壤酸化通常会影响土壤生物多样性，但一些耐酸细菌种类仍然存活并继续作为其他物种的食物来源（Chen等人，2021年；Cheng等人，2026年）。这种微生物群落的方向性演替直接改变了线虫的食物基础。因此，在酸化环境中，这些物种的相对数量增加（图1a），并通过自下而上的效应相应调整了其他物种的数量。此外，Pp的变化主要受植物根系健康和根系分泌物的影响。氮的添加还通过土壤酸化和改变养分可用性影响地下植被，进而影响Pp。通过上述途径，线虫群落最终通过资源中介途径发生了变化（Han等人，2022年）。

4.3 富集指数和线虫代谢足迹对氮输入的非线性响应
尽管我们将青藏高原上关于线虫群落研究结果的不一致性归因于氮的形式和实验持续时间的因素，但即使在控制氮形式的情况下，我们的研究仍然观察到了EI（富集指数）和代谢足迹的明显非线性模式，而其他功能指数并未受到显著影响。这与其他研究报道的线性响应形成对比（Ma等人，2024年）。这表明，即使在氮形式恒定的情况下，当地环境条件的内在差异（如土壤母质和地点历史）也会导致线虫群落功能指数对氮输入的响应阈值不同。因此，青藏高原上线虫群落功能指数对氮添加的响应表现出强烈的环境依赖性（Zhang等人，2022年）。具体来说，受到青藏高原资源匮乏生态系统的影响，CK组中的线虫群落的代谢功能相对简化，群落分解和养分循环能力有限（图4）。低氮输入（N1）改善了凋落物质量，从而促进了微生物的增殖（Zhang等人，2015a；Zhang等人，2015b），增加了资源富集（图3），并扩大了进入线虫群落的碳通量（Zhang等人，2012年；Zhang等人，2015a；Zhang等人，2015b），导致代谢足迹达到峰值（图4）。在这个阶段，土壤食物网保持了相对稳定状态（Ferris等人，2001年）。然而，当氮输入超过临界负荷（N2）时，土壤酸化触发了负反馈循环。抑制微生物活动和线虫代谢导致EI和代谢足迹同步下降。在N3处理下，EI和代谢足迹的轻微反弹并不表示群落结构和功能的真正恢复，而是耐酸线虫的补偿作用（图6）。例如，本研究中的c-p2类群表现出更强的耐酸生理性，因此在物种更替期间保持了基础代谢通量（Chen等人，2025年；Kong等人，2025年）。然而，这种补偿是有限的。代谢足迹向D象限的偏移仍然表明土壤食物网尚未恢复到N1水平（图4），仅代表在胁迫条件下耐受性物种的扩大。这些结果表明，N1处理优化了资源利用效率，而没有突破临界酸化阈值。我们建议在该地区的氮输入强度控制在N1和N2之间，以维持区域土壤食物网的相对稳定，并防止因过度土壤酸化导致的功能下降。

5. 结论
关于氮添加对土壤线虫影响的研究结果不一致可能源于实验生态系统、施用形式、频率和持续时间的不同。即使氮添加显著影响了线虫的α多样性，功能指数的响应也存在差异，大多数关于代谢足迹的研究通常显示出随氮剂量线性增加的趋势。此外，区域环境的异质性解释了青藏高原上研究结果的多样性，尽管它们具有共同的高山背景。我们的研究表明，氮沉积可以通过直接影响资源可用性和通过土壤酸化间接影响来共同影响线虫的功能代谢足迹和富集指数，同时驱动群落组成的变化，但同时也依赖于耐酸物种的补偿机制来缓解氮沉积的影响，从而维持α多样性的相对稳定性。我们的结果不仅丰富了该领域的现有知识，还表明长期氮输入下土壤酸化的持续加剧可能接近该生态系统的恢复极限，引发群落结构和功能的变化。因此，未来的研究应着重于揭示氮诱导的生态临界点背后的机制，特别是在气候敏感区域，需要仔细考虑土壤资源收益与酸化风险之间的动态平衡。