Darizmetinib (HRX215)：处于1b/2a期临床开发阶段的潜在首创（first?in?Class）肝脏再生药物，靶向应激信号蛋白激酶MKK4

《Journal of Medicinal Chemistry》：Darizmetinib (HRX215): A Promising 1st-in-Class Liver Regenerating Drug in Phase 1b/2a Clinical Development, Targeting the Stress Signaling Protein Kinase MKK4

　　

丝裂原活化蛋白激酶激酶4（Mitogen?activated protein kinase kinase 4，MKK4）是应激激活蛋白激酶（stress?activated protein kinase，SAPK）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信号网络的关键激酶，可激活c?Jun N?末端激酶（c?Jun N?terminal kinase，JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶。抑制MKK4通过信号网络内的重路由机制（主要经由MKK7和JNK1）调节肝细胞再生能力，代表了一种新型治疗策略。本研究描述了darizmetinib（HRX215）的发现，这是一种首创（first?in?class）MKK4抑制剂，目前正处于临床开发阶段。Darizmetinib源自已知的BRAF抑制剂，通过广泛的构效关系（structure?activity relationship，SAR）研究，成功设计了针对MKK4的效力和选择性，同时消除了原有的BRAF靶点活性。临床前概念验证研究及不同先导候选物的体内评估表明，darizmetinib在多种疾病相关药理模型中表现出剂量依赖性疗效。

肝脏疾病是全球主要的健康问题，每年导致超过两百万人死亡，且预计在未来二十年内这一数字将翻倍。无论是急性还是慢性肝病，均以肝功能进行性下降和肝组织结构恶化为特征，其驱动因素包括高脂饮食、酒精滥用、毒素、感染、自身免疫性疾病、遗传易感性和代谢性疾病等内外因素。健康肝脏具有显著的再生潜力，但受损肝脏的肝微环境变化显著降低了肝细胞的再生能力，进而引发脂质积累、炎症、细胞损伤、纤维化乃至肝硬化。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）已加速批准Rezdiffra（resmetirom）——首个用于治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH，原NASH）的药物，但针对急性肝衰竭和晚期慢性肝病仍缺乏有效疗法，存在重大未满足的医疗需求。在此背景下，近期研究确定MKK4是肝细胞再生的关键调节因子。

2013年，Wuestefeld等人发现MKK4是肝脏再生的关键调节蛋白。MKK4属于三级应激信号通路中的MAP2激酶，被MAP3激酶激活后，与MKK7共同促进JNK亚型的活化，同时也参与主要由MKK3和MKK6激活的p38 MAP激酶信号通路。该应激信号通路虽广泛表达且高度保守，但具有细胞和背景特异性。研究表明，在再生肝脏中，shRNA介导的MKK4下调（残留蛋白表达约10%）并未抑制JNK信号，反而通过MKK7/JNK1信号的高活性及转录因子ATF2和ELK1的激活，解锁了肝脏再生能力。遗传抑制实验进一步证实，同时抑制MKK7与MKK4或JNK1与MKK4会完全消除MKK4特异性下调带来的促再生效应。在小鼠模型中，MKK4的基因抑制可加速2/3肝切除后的细胞周期进程，稳定CCl₄诱导的急性肝损伤后的肝细胞，并减少慢性肝病中的肝纤维化发展，充分证明MKK4是促进肝脏再生和治疗肝病的重要药理学靶点。

此前已有研究报道MKK4在前列腺癌转移转化中的作用，并通过热位移筛选发现了少数微摩尔级的异黄酮类抑制剂，也有企业披露了作为MKK4/MKK7双重抑制剂的嘧啶并吲哚衍生物，但均未进一步推进。研究人员基于BRAF^V600E抑制剂vemurafenib（VMF）对MKK4的脱靶活性，启动了以VMF为先导的优化项目。通过假设VMF在MKK4中的结合模式类似于其在BRAF中的Type 1?抑制剂构象，研究人员对分子的不同区域进行了系统性修饰。

研究首先针对铰链结合基序（区域a）进行改造，发现未取代的7?氮杂吲哚和1H?吡唑并[3,4?b]吡啶保留了较强的MKK4结合亲和力，而其他修饰则显著降低活性。随后对连接基团（区域c）的研究表明，羰基是维持MKK4结合所必需的，其同系物替换导致活性丧失。在疏水区域（区域b）的修饰中，引入极性基团如羧酸和磺酰胺可显著提高对MKK4的选择性，而对区域e（烷基磺酰胺尾部）的延伸和取代则进一步优化了药代动力学特性。经过多轮设计—合成—测试循环，研究人员获得了具有工具化合物特性的候选分子，并在小鼠2/3肝切除模型和CCl₄诱导的肝损伤模型中验证了其促再生和保护作用。

进一步的氟代模式优化（区域d）发现，2,6?二氟苯基取代相比2,4?二氟苯基可显著提升MKK4抑制效力和对BRAF及JNK1的选择性。结合上述各区域的优化成果，研究人员最终锁定了化合物42（darizmetinib，HRX215）。该化合物在生化酶活实验中表现出对MKK4的高抑制活性（IC₅₀≈0.04?μM），对BRAF和JNK1的选择性分别超过200倍和80倍，并且在口服给药后在小鼠和大鼠中显示出剂量线性的药代动力学特征。安全性评估显示其对hERG通道和细胞色素P450酶的抑制风险较低。体内实验进一步证实，darizmetinib在2/3肝切除模型中显著增加了Ki67阳性肝细胞比例，并在CCl₄诱导的急性肝损伤模型中减少了凋亡细胞数量。

综上所述，研究人员通过对已知BRAF抑制剂的结构改造，成功实现了从多靶点激酶抑制剂到高选择性MKK4抑制剂darizmetinib的转化。该研究不仅验证了MKK4作为肝脏再生治疗靶点的可行性，也为急性肝衰竭和晚期慢性肝病提供了新的临床开发候选药物。相关成果已发表于《Journal of Medicinal Chemistry》。

关键技术方法包括：基于激酶结合亲和力和功能酶活实验的体外药效评价；采用核磁共振（NMR）蛋白质结构生物学解析配体与MKK4的结合模式；利用2/3肝切除术、CCl₄诱导的急慢性肝损伤以及乙醇喂养加暴饮模型进行体内药效学评估；通过小鼠、大鼠、犬和人的肝微粒体代谢稳定性实验以及hERG通道抑制实验进行早期安全性筛选；并采用液相色谱?串联质谱（LC?MS/MS）监测血药浓度以评估口服生物利用度和药代动力学参数。

研究结果部分：

1. 1.
   策略与苗头化合物识别：研究人员通过文献和专利检索，确定BRAF抑制剂vemurafenib（VMF）为MKK4抑制剂的起始骨架，并基于假设的VMF?MKK4结合模式，对分子的五个关键区域（a–e）进行构效关系探索。结果表明，保留7?氮杂吲哚或1H?吡唑并[3,4?b]吡啶作为铰链结合基序，并对磺酰胺尾部进行烷基链优化，可获得较高的MKK4结合亲和力。
2. 2.
   化合物16的体内概念验证：在2/3肝切除模型中，化合物16显著提高了Ki67阳性肝细胞的比例，并在CCl₄诱导的急性肝损伤模型中降低了TUNEL阳性细胞数量和血清转氨酶水平，证实了MKK4抑制可促进肝脏再生并保护肝细胞。然而，化合物16对JNK1的选择性仍有限，促使后续进一步优化。
3. 3.
   Darizmetinib（化合物42）的发现：通过在2,6?二氟苯基位置引入双氟原子，并结合优化的磺酰胺侧链，研究人员获得了化合物42（darizmetinib）。该化合物在生化水平上对MKK4的抑制活性达到纳摩尔级，对BRAF和JNK1的选择性显著提升，且在小鼠和大鼠中表现出良好的口服暴露量和线性药代动力学。
4. 4.
   NMR结合模式解析：蛋白质NMR分析显示，darizmetinib以与VMF类似的方式占据MKK4的ATP结合口袋，7?氮杂吲哚与Met¹⁸¹和Glu¹⁷⁹形成铰链相互作用，磺酰胺基团与Phe²⁴⁸、Gly²⁴⁹及Asp²⁴⁷等残基形成氢键网络，进一步解释了其高选择性的结构基础。
5. 5.
   化学合成路线：研究人员分别开发了适用于7?氮杂吲哚和1H?吡唑并[3,4?b]吡啶两类核心结构的多步合成策略，包括Friedel–Crafts酰基化、Weinreb酰胺制备、Suzuki偶联和脱保护等关键步骤，实现了目标化合物的克级规模制备。

讨论与结论部分指出，Wuestefeld等人的前期工作已经确立了MKK4在肝脏再生中的关键作用，但当时缺乏小分子抑制剂来验证其治疗潜力。本研究通过“激酶调谐”策略，成功将BRAF抑制剂VMF转化为首创（first?in?class）MKK4抑制剂darizmetinib，并在临床前模型中验证了其促进肝细胞增殖、减轻肝损伤和纤维化的功效。经过系统的构效关系优化和体内外安全性评估，darizmetinib被确定为临床开发候选药物。在完成非临床研究和新药临床试验申请（IND）?enabling安全性项目后，darizmetinib已进入首次人体Phase?1试验，并正在开展针对结直肠肝转移患者的Phase?1b/2a安全性和疗效研究（ClinicalTrials.gov ID NCT06638502）。这项工作不仅填补了MKK4小分子抑制剂的空白，也为肝脏再生领域的药物研发提供了成功的案例。