RNA触发的CRISPR–Cas12a2细胞杀伤

《Nature》：RNA-triggered cell killing with CRISPR–Cas12a2

　　

基于其遗传或转录特性选择性清除靶细胞，在基础研究、医学、生物技术和农业领域仍然具有重要意义1-3。在涉及细菌的应用中，CRISPR核酸酶因其能够进行RNA引导的反向选择而提供了有前景的选择4-7；然而，在真核生物中使用相同的核酸酶进行反向选择已被证明限制性大得多8-14。本研究显示，最近发现的V型CRISPR核酸酶Cas12a2，表现出RNA触发的DNA降解15,16，并且能够程序化、序列特异性地消除表达目标转录本的酵母和人类细胞。触发Cas12a2会在反式位点引发广泛的DNA双链断裂，从而导致细胞死亡。细胞杀伤可以被多种目标转录本激活，且未观察到脱靶激活。利用这种方法，研究人员选择性地清除了携带人乳头瘤病毒(HPV)的细胞、未能进行基因编辑的细胞，或编码KRAS中常见致癌点突变的细胞。这些发现扩展了CRISPR工具箱，使得能够基于真核细胞的转录谱对其进行选择性清除。

研究背景与科学问题

选择性清除具有特定遗传或生理特性的细胞、组织或生物体一直是生命科学的支柱，无论是用于精确去除病变细胞、塑造细胞群落，还是根除污染物或病原体^1-3。常见的方法，如小分子抑制剂、毒素、抗体、裂解病毒或程序化的免疫细胞，通过靶向特定蛋白质或生存通路来清除细胞^17-20。然而，这些方法无法轻易地针对任意的遗传或转录状态，也难以应对“难以成药”的场景，例如非编码序列的突变或复杂的病因。一种能够通过特异性识别特定DNA或RNA序列直接触发的细胞杀伤方法，可以极大地拓宽可靶向疾病的范围，为各种情况和应用中的细胞反向选择提供新手段。

CRISPR核酸酶——细菌和古菌CRISPR-Cas免疫系统中的RNA引导效应蛋白²¹——具有被靶向DNA或RNA识别触发的多种生化活性；这些活性可用于基于细胞的遗传或转录状态对其进行选择性清除^22-25。在细菌中，CRISPR核酸酶可通过不同机制有效清除含有靶序列的细胞。然而，这些活性在真核细胞中进行程序性细胞清除时大多无效。例如，Cas9或Cas12a产生的双链DNA断裂(dsDNA breaks)可以通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)被高效修复^26-28，通常不会导致细胞死亡。仅当靶向整个基因组中高度重复的元件时，这些核酸酶才能诱导细胞死亡^12-14。同样，激活真核细胞中的Cas13通常导致目标转录本的特异性降解¹⁰。当观察到非特异性RNA降解时，激活的Cas13也无法驱动稳健的细胞休眠或死亡^8-11。因此，尽管基于CRISPR的方法在细菌中广泛应用，但在真核生物中实现选择性细胞清除的方法仍然难以捉摸。

最近报道的一类RNA引导的CRISPR核酸酶Cas12a2，在与互补RNA特异性碱基配对后，会释放出非特异性的双链DNA酶(dsDNase)活性，从而在细菌中驱动SOS DNA损伤反应和细胞休眠^15,16。然而，Cas12a2的RNA触发的非特异性dsDNase活性在真核生物中的作用尚未被探索。本研究旨在探究当Cas12a2被特定转录本识别激活时，如何影响真核细胞，以及这些核酸酶是否可用于RNA触发的程序性细胞清除。

主要技术方法

本研究主要使用了来自Sulfuricurvumsp. PC08-66 (SuCas12a2) 和宏基因组样本 (GeCas12a2) 的两个密切相关变体。研究利用酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 和多种人类细胞系（如HeLa、HEK293T、U2OS、NCI-H23等）进行功能验证。关键技术方法包括：

1. 1.
   体外生化活性分析：通过荧光标记的底物切割实验，验证Cas12a2被靶RNA激活后的非特异性dsDNA、ssDNA和RNA切割活性。通过原间隔子侧翼序列(PFS)文库筛选，确定其偏好性序列。
2. 2.
   酵母细胞杀伤实验：将表达GeCas12a2、gRNA及DNA修复模板的质粒共转化至酿酒酵母，通过转化子计数和ADE2基因失活导致的红色表型，评估细胞杀伤效率和同源重组修复(HDR)逃逸情况。
3. 3.
   人类细胞杀伤与机制研究：将预组装的Cas12a2-gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)通过电穿孔或脂质纳米颗粒(LNP)递送至目标细胞系。通过活细胞成像、磺酰罗丹明B(SRB)染色等方法定量细胞存活。通过53BP1焦点免疫荧光染色、细胞周期分析(DNA含量检测)、Annexin V染色、Caspase-3/7活性检测以及RNA测序(RNA-seq)分析，探究细胞死亡机制（DNA损伤、细胞周期阻滞、凋亡、炎症通路激活等）。
4. 4.
   特异性与脱靶评估：在缺乏目标转录本的细胞中检测细胞杀伤和DNA损伤（53BP1焦点）。通过预测基因组中潜在脱靶RNA序列并进行体外激活验证，系统评估错配耐受性。利用双链寡脱氧核苷酸(dsODN)条形码整合实验，通过定量PCR(qPCR)检测非特异性DNA双链断裂导致的NHEJ事件。
5. 5.
   应用场景验证：
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     清除病毒感染的细胞：设计gRNA靶向HPV的E6/E7转录本，在HeLa(HPV18+)和SiHa(HPV16+)细胞中验证特异性杀伤。在头颈鳞状细胞癌患者来源异种移植(PDX)小鼠模型中，通过瘤内注射LNP递送的Cas12a2 mRNA和gRNA，评估体内抗肿瘤效果。
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     富集基因编辑细胞：首先使用FnCas12a或Cas9碱基编辑器(Prime Editor)在目标位点引入插入/缺失(indels)或精确点突变，然后使用靶向未编辑转录本的Cas12a2进行反向选择，通过测序（Sanger测序、纳米孔测序）评估编辑效率的富集倍数。
   • •
     清除致癌突变细胞：设计gRNA特异性靶向致癌点突变KRAS^G12C的转录本，在过表达KRAS^G12C的U2OS细胞和天然携带该杂合突变的NCI-H23肺癌细胞中，验证对突变细胞的特异性杀伤。评估Cas12a2与FDA批准的小分子抑制剂sotorasib的联合疗效，以及在sotorasib耐药细胞中的效果。

研究结果

1. Cas12a2消除酵母细胞

在酿酒酵母模型中，研究人员设计了靶向非必需基因ADE2转录本的gRNA。结果显示，具有催化活性的GeCas12a2在靶向条件下，无论是否存在DNA修复模板，均能使转化子减少134倍，且没有观察到通过HDR逃逸的红色克隆。而催化失活的GeCas12a2突变体则无法减少转化子。相比之下，切割DNA的FnCas12a仅使转化子减少4倍，且90%的转化子通过HDR修复呈现红色。这表明，Cas12a2能够驱动高效的、靶点依赖性的酵母细胞清除，即使存在DNA修复机会。

2. Cas12a2消除人类细胞

在稳定表达GFP的HeLa细胞中，电穿孔递送靶向GFP转录本的GeCas12a2 RNP，导致细胞无法增殖甚至数量减少，5天后细胞耗竭达86%。而递送非靶向gRNA或催化失活的RNP则细胞正常生长。Cas12a2的细胞清除效率高于靶向相同位点的LbuCas13a。在源自黑色素瘤、肺癌和头颈癌的四种细胞系中，靶向六个内源转录本（表达水平从低到高），GeCas12a2均能引发细胞耗竭，且依赖于RNP浓度和目标转录本丰度。通过LNP递送Cas12a2 mRNA和gRNA同样能实现靶点依赖的细胞耗竭。

3. Cas12a2诱导致死性DNA双链断裂

机制研究表明，被RNA触发的GeCas12a2能够在体外降解纯化的染色体DNA。在细胞内，靶向GFP或GAPDH转录本可诱导53BP1修复焦点大量形成，其水平与化疗药物顺铂和依托泊苷处理相当。细胞周期分析显示，G1期细胞群体减少2.5倍，并出现亚G1期和>4N DNA含量的细胞，这是有丝分裂灾难和细胞凋亡的标志。靶向处理还导致约40%的细胞发生Annexin V染色阳性和Caspase-3/7激活，表明诱导了细胞凋亡。同时，RNA-seq分析显示特定炎症基因集上调。这些结果表明，RNA触发的Cas12a2主要通过诱导大量DNA损伤，继而引发细胞凋亡等死亡途径来清除人类细胞。

4. Cas12a2的脱靶激活极低

为评估脱靶风险，研究人员在缺乏目标转录本的HeLa细胞中测试，发现非靶向和GFP靶向的Cas12a2 RNP均未引起细胞耗竭、53BP1焦点增加或NHEJ介导的dsDNA条形码整合。通过计算预测潜在的脱靶RNA序列并进行体外验证，仅发现一个带有错配的潜在序列能微弱激活Cas12a2，且其对应转录本在细胞中表达量极低。系统性测试针对GFP靶点的双碱基错配gRNA，均未导致细胞耗竭。RNA-seq分析也显示，非靶向gRNA处理与对照相比无差异基因表达。因此，在本研究实验条件下，Cas12a2对错配敏感，在人类细胞中未检测到可测量的脱靶激活。

5. Cas12a2清除病毒感染的细胞

研究人员设计了靶向HPV18的E6或E7癌蛋白转录本的gRNA。在携带HPV18的HeLa-GFP细胞中，电穿孔递送靶向E6或E7的GeCas12a2 RNP导致约94%的细胞减少，而在不携带HPV的HEK293-GFP细胞中则无显著影响。gRNA的单碱基突变（除最靠近PFS的突变外）均导致细胞清除功能完全丧失，证明了靶点依赖性激活的特异性。在体内实验中，瘤内注射LNP递送的靶向HPV16 E6的Cas12a2，显著抑制了HPV16阳性头颈鳞癌PDX小鼠模型的肿瘤生长，组织学检测证实了Cas12a2的表达和细胞凋亡标志物的出现。

6. Cas12a2富集基因编辑细胞

在混合培养实验中，靶向GFP的Cas12a2 RNP可选择性清除GFP表达的HeLa细胞（减少93%），而RFP表达的细胞继续增殖。在基因编辑富集应用中，首先用FnCas12a RNP在整合的GFP基因中产生约11%的indels，随后用靶向同一转录本位点的GeCas12a2处理，可将indels频率富集3.1倍，且大片段缺失增加。在Prime Editing应用中，使用Cas12a2靶向未编辑的GAPDH转录本序列，可将精确编辑的细胞富集高达4.3倍。这表明Cas12a2可用于富集由不同基因编辑器产生的编辑细胞。

7. Cas12a2清除致癌细胞

研究人员设计了可区分KRAS^G12C点突变与野生型(WT)转录本的gRNA。在过表达KRAS^G12C或WT KRAS的U2OS细胞中，Cas12a2能特异性清除表达突变转录本的细胞（减少62%），而不影响过表达WT转录本的细胞，且在后者中未检测到DNA损伤。在天然携带KRAS^G12C杂合突变的NCI-H23肺癌细胞中，Cas12a2处理导致50%的细胞耗竭和DNA损伤。与FDA批准的KRAS^G12C抑制剂sotorasib联用，可协同增强细胞清除效果（超过85%）。重要的是，Cas12a2对已产生sotorasib耐药的NCI-H23细胞同样有效（清除51%）。

讨论与结论

本研究发现在特定转录本存在时，Cas12a2核酸酶的非特异性dsDNA切割活性可驱动酵母和人类细胞的清除。缺乏靶转录本的细胞则得以幸免。在人类细胞中，Cas12a2通过引发广泛的染色体DNA双链断裂，导致细胞周期阻滞和以凋亡为主的细胞死亡。基于这一发现，研究人员应用Cas12a2根据细胞独特的转录谱对其进行选择性清除。

Cas12a2介导的细胞杀伤不同于现有的基于CRISPR或非CRISPR的方法。Cas12a2仅在识别到特定转录本时才引发强烈的细胞杀伤，可实现单核苷酸分辨率特异性，并能被低表达转录本触发。因此，Cas12a2介导的细胞清除为CRISPR-Cas工具箱增添了一项独特的、可通过选择特定转录本触发细胞死亡的技术。

研究人员设想了Cas12a2可用于靶向多种类型的RNA目标，并将推动基础研究、医学、生物技术、生物制造和农业领域的众多应用。本研究具体展示了三种应用：清除携带高危HPV的细胞；富集未能发生基因编辑的细胞；以及清除携带体细胞致癌突变的细胞。基因编辑富集可扩展至其他编辑策略和高通量CRISPR筛选。

Cas12a2介导的细胞清除需要一种独特的脱靶分析方法。不同于Cas9（检测基因组脱靶切割位点）或Cas13（检测脱靶转录本沉默），Cas12a2被触发后会在全基因组范围内非特异性产生DNA双链断裂。因此，研究人员提出结合潜在脱靶激活剂的计算机预测、体外测试以及在相关细胞系中检测DNA损伤和细胞死亡标志物的方法。

展望未来，推动Cas12a2介导的细胞清除技术走向成熟，可能包括改变或放宽腺嘌呤富集的PFS以兼容更多靶点、基于高通量筛选和机器学习开发稳健的gRNA设计规则、对核酸酶进行工程化改造（如更紧凑、活性更高或保真度更高），以及将Cas12a2与病毒和非病毒递送载体结合用于体内研究和治疗。进一步研究目标转录本的丰度和定位如何影响Cas12a2激活和细胞清除、不同细胞类型对Cas12a2所致损伤的反应、以及存活细胞的特性，都将有助于该技术的发展。此外，阐明不同细胞类型中的细胞死亡过程及其对生物体的局部和全身影响，也将有助于治疗应用。例如，Cas12a2诱导的细胞死亡可能与损伤相关分子模式相关联，从而驱动局部免疫激活，有助于清除逃避直接靶向的癌细胞，类似于溶瘤病毒的作用⁵⁸。总之，通过进一步的研究和开发，Cas12a2有望扩展CRISPR工具箱，在真核细胞中实现程序化的细胞清除，从而开辟生命科学领域的广阔应用空间。