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阐明神经回路结构的改变如何驱动行为创新仍然是神经科学和进化生物学的关键挑战。在哺乳动物中，新皮层（neocortex）被认为在促进快速行为创新中发挥关键作用。尽管长程连接（long-range connectivity）的改变被提议为这种行为创新的基础，但这些
阐明神经回路结构的改变如何驱动行为创新仍然是神经科学和进化生物学的关键挑战。在哺乳动物中，新皮层（neocortex）被认为在促进快速行为创新中发挥关键作用。尽管长程连接（long-range connectivity）的改变被提议为这种行为创新的基础，但这些假设在很大程度上仍未得到定量验证，这在一定程度上是由于缺乏跨物种的单神经元分辨率高通量神经元投射数据。在此，研究人员研究了Alston's singing mouse (Scotinomys teguina)，它表现出实验室小鼠(Mus musculus)所缺乏的显著发声行为，旨在定量确定整个大脑中运动皮层投射的物种特异性变化。利用批量示踪（bulk tracing）、连续双光子断层扫描（serial two-photon tomography, STPT）以及对超过76,000个条形码神经元的高通量DNA测序，研究人员发现口面部运动皮层（orofacial motor cortex, OMC）向听觉皮层区域和中脑导水管周围灰质（midbrain periaqueductal grey, PAG）的投射发生了特异且大幅度的扩张，这些区域与发声行为有关。此外，单个OMC神经元的投射模式分析揭示了歌唱小鼠向听觉皮层区域的排他性投射（exclusive projections）的优先扩张。研究结果表明，祖先运动皮层投射的选择性扩张可能导致短时间尺度上的行为分歧。此外，这些结果为增强皮层对发声的控制（这是人类语言的关键前适应）提供了机制研究基础。这种比较最近分化且具有显著行为分歧的物种的方法可以推广到其他模型支系，以发现神经回路进化的定量规则。
研究背景与意义
阐明神经回路结构的修饰如何驱动行为创新是神经科学与进化生物学的核心难题。哺乳动物的新皮层（neocortex）被认为是促进快速行为创新的关键结构。长期以来，科学界提出长程连接（long-range connectivity）的改变可能是行为创新的基础，然而由于缺乏跨物种单神经元分辨率的高通量投射数据，这些假说大多未能得到定量验证。为了填补这一空白，研究人员选择了Alston's singing mouse (Scotinomys teguina) 作为模型，该物种表现出实验室小鼠(Mus musculus)所不具备的复杂鸣唱行为。通过比较这两种约1800万年前分化的近缘物种，研究人员旨在定量解析运动皮层投射的变化如何导致行为表型的剧烈分歧。该研究成果发表在《Nature》杂志，为理解神经回路进化的机制提供了重要证据。
关键技术方法
本研究采用了多种前沿技术相结合的策略。首先，利用批量病毒示踪（bulk viral tracing）结合连续双光子断层扫描（STPT）对全脑轴突投射进行无偏倚图谱绘制。其次，核心技术采用了多重测序投影分析（Multiplex Analysis of Projections by Sequencing, MAPseq），通过对携带独特RNA条形码的辛德毕斯病毒（Sindbis virus）注射，实现了对数千个神经元进行高通量、单细胞分辨率的投射靶点鉴定。此外，研究还结合了顺行跨突触示踪（anterograde trans-synaptic tracing）以及突触小体标记物（synaptophysin-mRuby）验证突触连接。研究对象包括雄性及雌性歌唱小鼠与实验室小鼠，实验样本涵盖了多个个体以确保统计效力。
研究结果
歌唱小鼠的行为新颖性
研究人员首先在相同的社交互动范式下量化了两个物种的发声行为差异。实验室小鼠主要产生超声发声（ultrasonic vocalizations, USVs），而歌唱小鼠则表现出两种截然不同的声学簇：一种是安静的USVs，另一种是响亮的、刻板化的鸣唱（songs）。通过声谱图分析证实，鸣唱是Baiomyini族特有的行为创新，其响度显著高于USVs，表明这是一种新颖的表型。
测试全脑皮层投射模型
研究人员提出了三种可能的回路分歧模型：出现全新靶区（模型1）、轴突支配强度改变（模型2）或投射概率改变（模型3）。通过AAV介导的tdTomato示踪及STPT全脑成像发现，歌唱小鼠与实验室小鼠在OMC注射后的轴突分布模式在宏观解剖结构上高度相似，未发现明显的全新投射靶区，且主要脑区体积未见显著差异，排除了模型1。
OMC投射模式的单细胞分析
利用MAPseq技术，研究人员在单细胞水平分析了超过76,000个条形码神经元。结果显示，虽然OMC神经元在两种物种中投射到相同的总体下游区域，但在投射概率（projection probability）上存在显著差异。具体而言，歌唱小鼠的OMC神经元向听觉区域（Auditory Region, AudR）和PAG的投射概率分别比实验室小鼠高出2.8倍和3.3倍。而在轴突支配强度（innervation strength）方面，两个物种间未见显著差异，从而支持了模型3。
OMC投射基序的分析
进一步分析单个神经元的投射基序（projection motifs）发现，歌唱小鼠中向AudR投射概率的增加主要由排他性投射（exclusive projections）驱动，即OMC神经元仅投射至AudR而不发出侧支至对侧OMC或纹状体（striatum）。这种非均匀的基序扩张偏离了简单的二项式独立投射模型，表明这是一种特定于某些基序的选择性扩张。
结论与讨论
综上所述，本研究通过定量比较发现，歌唱小鼠相对于实验室小鼠表现出的发声行为创新，并非源于大脑皮层整体结构的剧烈重组或全新通路的建立，而是源于祖先运动皮层投射在特定靶区（AudR和PAG）的选择性扩张。这种扩张主要表现为单细胞投射概率的增加，尤其是向听觉皮层的排他性投射。该研究提出的分析框架（偏离二项式预期）可推广至其他模型系统以识别进化改变的位点。研究结果表明，在较短的系统发育时间尺度上，祖先回路连接的定量修饰可能是促进行为多样化的普遍机制。此外，这种皮层至听觉及中脑通路的选择性增强，为人类语言进化中关键的皮层对发声控制的前适应机制提供了可能的神经生物学解释。
