低剂量放疗通过与程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断协同，通过抗肿瘤中性粒细胞重编程在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中实现持久生存

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Low-dose radiotherapy synergizes with PD-1 blockade to achieve durable survival in advanced NSCLC through antitumor neutrophil programming

　　

摘要 放疗（RT）与免疫疗法相结合的最佳策略仍在深入研究之中。在此，研究人员开发了一种名为“三模态放疗免疫驱动增强疗法”的新型治疗方案TRIDENT，它整合了针对大肿瘤的免疫调节性低剂量放疗、针对小肿瘤的免疫原性高剂量放疗以及程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断。在一项涉及29名未经治疗的、程序性死亡配体1（PD-L1）阳性晚期非小细胞肺癌患者的I期试验中，TRIDENT治疗达到了51.3个月的中位总生存期，高于同期标准（化疗）免疫疗法通常报道的结果。这一持久的生存信号在一个包含97名晚期肺癌患者的独立真实世界队列中得到了证实。从机制上讲，TRIDENT引发了中性粒细胞依赖性、系统性的抗肿瘤免疫，并诱导了一群独特的、表达肿瘤坏死因子-α（TNF-α+）的抗肿瘤中性粒细胞，其标志是主要组织相容性复合体和共刺激分子表达增加。中性粒细胞的募集由CXC基序趋化因子-趋化因子CXC受体2轴驱动，而向抗肿瘤状态的极化则由治疗诱导的干扰素-γ（IFN-γ）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）重编程。TNF-α+中性粒细胞通过细胞间粘附分子1-淋巴细胞功能相关抗原1相互作用增强了细胞毒性CD8+T细胞功能，而过继转移实验证实了它们在体内的内在抗肿瘤活性。患者肿瘤组织的空间转录组学进一步鉴定出TRIDENT治疗后存在一个TNF-α+中性粒细胞-效应CD8+T细胞微环境，为效应CD8+T细胞提供刺激信号。与这些机制发现一致，临床生物标志物分析将中性粒细胞数量与长期生存相关联。TRIDENT激活了放疗驱动的中性粒细胞-CD8+T细胞轴，并促进了与生存相关的中性粒细胞活化。这些机制见解，加上I期试验中观察到的持久生存，使TRIDENT成为一种有前景的转移性非小细胞肺癌治疗策略，目前正在随机II期评估中。该研究也强调了TNF-α+中性粒细胞作为增强抗肿瘤疗效的一种有前景的治疗策略。

论文解读文章

研究背景、现存问题与研究目的

免疫检查点抑制剂（ICIs）已重塑了实体瘤的治疗格局，然而仅有约20%的患者能获得持久获益。高剂量放疗（HDRT）能够诱导免疫原性细胞死亡，促进肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的启动，并在非照射病灶中引发全身性的“远隔效应”，这为放疗与免疫检查点抑制剂的联合应用提供了有力依据。然而，评估HDRT联合免疫检查点抑制剂的临床试验仅显示出适度的临床获益，表明HDRT的免疫原性潜力在临床环境中未能完全转化为系统性抗肿瘤免疫反应。这些有限的结局可能是由于无法安全地对所有转移灶进行HDRT，使得未受照射的肿瘤成为免疫抑制库，从而限制了系统性抗肿瘤免疫。相比之下，低剂量放疗可安全地应用于多个转移部位，并已成为一种有前景的方法，主要通过非细胞毒性的免疫调节机制来重塑肿瘤微环境。然而，单独使用LDRT并未能持续增强对免疫检查点抑制剂的反应，这突显了对新型放疗策略的需求。

超越免疫细胞丰度的变化，有效的抗肿瘤免疫还依赖于免疫细胞在肿瘤微环境内的通讯和相互作用。有效的细胞毒性T淋巴细胞活化需要免疫突触的形成，以及专门的免疫微环境。然而，放疗是否能重塑这些免疫微环境以促进有效的免疫串扰，从而将局部照射转化为系统性抗肿瘤免疫，目前尚不清楚。中性粒细胞传统上被视为短寿的先天免疫应答者，现在被认识到是肿瘤微环境中表型多样且功能可塑的组成部分。尽管肿瘤相关中性粒细胞长期以来与免疫抑制、血管生成、细胞外基质重塑和转移等癌症进展相关，但新兴证据表明，在某些炎症或治疗背景下，它们也能获得抗肿瘤功能。放疗，特别是在免疫调节剂量下，能够影响髓系细胞的募集和活性，但它是否能将中性粒细胞重编程为免疫刺激性表型尚不清楚。这引发了一个核心问题：基于放疗的策略能否利用或重编程中性粒细胞，使其与免疫检查点抑制剂协同，从而协调系统性抗肿瘤免疫？解决这一问题可能揭示中性粒细胞在连接局部放疗与系统性免疫激活方面未被充分认识的作用。

为此，研究人员开发了TRIDENT，这是一种整合了针对大肿瘤的免疫调节性LDRT、针对小肿瘤的免疫原性HDRT以及系统性PD-1阻断的新型放射免疫治疗方案。该研究旨在评估其临床疗效，并深入探究其诱导系统性抗肿瘤免疫的机制，特别是在激活抗肿瘤中性粒细胞及其与细胞毒性T淋巴细胞相互作用方面的作用。

研究方法概述

研究采用多层面方法结合临床与临床前研究。临床部分包括一项前瞻性I期临床试验和一个回顾性真实世界队列，评估TRIDENT在晚期非小细胞肺癌患者中的疗效与安全性。临床前研究利用双边皮下肿瘤小鼠模型，以模拟转移性疾病的多病灶状态，评估系统性免疫反应。机制研究涉及高通量测序、流式细胞术、体外共培养、过继转移、以及空间转录组学和多重免疫荧光等。其中，单细胞RNA测序用于深度解析肿瘤浸润免疫细胞图谱；空间转录组学用于在空间水平上验证免疫微环境的重塑；CXCR2、GM-CSF、IFN-γ、LFA-1等关键分子的阻断抗体用于在体内外验证其功能。临床样本分析则关联了中性粒细胞亚群特征与患者的治疗反应和生存。

研究结果

1. Durable survival with TRIDENT in treatment-na?ve advanced NSCLC

在I期临床试验中，TRIDENT在不使用化疗的情况下，在未经治疗的晚期非小细胞肺癌患者中达到了51.3个月的中位总生存期，客观缓解率为60.7%。在97名患者的真实世界队列中，中位总生存期为41.5个月。这些生存数据优于历史对照的免疫检查点抑制剂单药或联合化疗方案，提示TRIDENT可诱导持久的临床获益。

2. TRIDENT drives neutrophil-dependent systemic antitumor immunity in mice

在双边肿瘤小鼠模型中，TRIDENT能有效抑制局部照射的HDRT肿瘤和非细胞毒性照射的LDRT肿瘤的生长，并显著延长生存。单细胞RNA测序和流式细胞术分析显示，TRIDENT显著增加了第二个肿瘤中的中性粒细胞浸润。体内中性粒细胞耗竭实验证实，中性粒细胞对TRINDENT引发的系统性肿瘤控制，特别是对第二个肿瘤的控制，至关重要。

3. TRIDENT expands TNF-α⁺neutrophils and effector CD8⁺T cells in second tumors

单细胞分析将肿瘤浸润中性粒细胞分为四个亚群，其中N1簇高表达肿瘤坏死因子-α，并与免疫检查点抑制剂应答相关，定义为TNF-α⁺中性粒细胞。TRIDENT处理显著增加了第二个肿瘤中TNF-α⁺中性粒细胞以及表达细胞毒性效应分子（如穿孔素、干扰素-γ、颗粒酶B）的细胞毒性T淋巴细胞的浸润。体内细胞毒性T淋巴细胞耗竭实验也证实，细胞毒性T淋巴细胞对TRIDENT的远端抗肿瘤效应至关重要。

4. TNF-α⁺neutrophils exhibit antitumor properties and activate CD8⁺T cells

TNF-α⁺中性粒细胞高表达主要组织相容性复合体I类/II类分子、共刺激分子CD86和CCR7，并上调4-1BB配体。体外实验显示，这些中性粒细胞能有效交叉呈递抗原，并与细胞毒性T淋巴细胞共培养时，显著促进T细胞的活化、增殖及对肿瘤细胞的杀伤。过继转移TNF-α⁺中性粒细胞联合PD-1阻断可抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长生存。

5. ICAM-1-LFA-1 interactions drive neutrophil-T cell engagement and cytotoxicity in TRIDENT-induced responses

单细胞转录组学及细胞通讯分析显示，TRIDENT特异性增强了TNF-α⁺中性粒细胞与效应细胞毒性T淋巴细胞之间由细胞间粘附分子1-淋巴细胞功能相关抗原1介导的相互作用。流式细胞术和成像流式细胞术证实TRIDENT上调了中性粒细胞上的细胞间粘附分子1和细胞毒性T淋巴细胞上的淋巴细胞功能相关抗原1α表达，并观察到可能的免疫突触样结构形成。阻断淋巴细胞功能相关抗原1α削弱了体外T细胞活化和增殖，并在体内降低了TRIDENT的治疗效果。

6. TRIDENT induces chemotactic and polarizing signals that recruit and program neutrophils toward an antitumor phenotype

机制研究发现，LDRT处理的肿瘤上清可显著增强中性粒细胞迁移，LDRT诱导了CXC基序趋化因子1、2、3的表达，而TRIDENT增加了肿瘤中性粒细胞上趋化因子CXC受体2的表达。体内阻断趋化因子CXC受体2削弱了TRIDENT的远端抗肿瘤效应，证实CXC基序趋化因子-趋化因子CXC受体2轴在中性粒细胞募集中的关键作用。同时，LDRT诱导了肿瘤中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素-γ的上调，这些细胞因子驱动中性粒细胞向具有抗原呈递和共刺激特征的表型极化。体内中和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素-γ同样损害了TRIDENT的系统性疗效。

7. High-resolution spatial mapping corroborates N1_TNF-α⁺-mediated immune activation

利用Visium HD空间转录组学对三名非小细胞肺癌患者治疗前后的配对肿瘤样本进行分析。结果显示，治疗后样本免疫浸润和活化增强，抗原处理和呈递通路上调。空间分析鉴定出多个细胞微环境，其中TNF-α⁺中性粒细胞富集的微环境与上皮细胞区或细胞毒性T淋巴细胞区相邻或重叠，提示其可能参与肿瘤核心的抗原处理、在肿瘤边缘募集免疫细胞、并与效应细胞毒性T淋巴细胞在免疫激活枢纽中相互作用。多重免疫组化进一步证实治疗后肿瘤中出现了共表达肿瘤坏死因子-α、CD14、细胞间粘附分子1的髓过氧化物酶阳性中性粒细胞，并与细胞毒性T淋巴细胞空间共定位。

8. N1_TNF-α⁺neutrophil activation correlates with clinical outcomes

临床相关性分析表明，在回顾性队列中，治疗后外周血中性粒细胞计数高的患者有更长的无进展生存期。对公共基因表达数据库的分析显示，瘤内TNF-α⁺中性粒细胞相关基因特征的高评分与更长的无进展生存期相关。在一项观察性研究中，接受放疗联合抗PD-1治疗的应答者，治疗后肿瘤中TNF-α⁺、CD14⁺、TNF-α⁺CD14⁺和TNF-α⁺ICAM-1⁺中性粒细胞亚群显著增加，而非应答者则无此变化。这表明TNF-α⁺中性粒细胞的活化与良好的临床反应相关。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出放疗与免疫检查点抑制剂的联用已引起广泛兴趣，但临床试验结果不一，表明放疗的免疫刺激潜力尚未被充分利用。本研究确立了TRIDENT作为一种通过整合高、低剂量放疗来释放系统性抗肿瘤免疫的新策略。I期试验中，TRIDENT在晚期非小细胞肺癌患者中实现了持久的临床疗效，中位总生存期显著优于历史对照。机制上，研究揭示了一个此前未被充分认识的、以中性粒细胞可塑性为核心的免疫轴。TRIDENT通过CXC基序趋化因子-趋化因子CXC受体2趋化信号促进中性粒细胞募集，并通过治疗诱导的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素-γ驱动产生具有T细胞刺激特征的TNF-α⁺中性粒细胞亚群。这些中性粒细胞在空间上与细胞毒性T淋巴细胞共定位于免疫刺激性微环境，并通过细胞间粘附分子1-淋巴细胞功能相关抗原1依赖的相互作用促进细胞毒性T淋巴细胞活化和效应功能。在接受放疗免疫治疗的转移性肺癌患者中，TNF-α⁺中性粒细胞的增加与更好的预后相关。这些发现为TRIDENT在II期随机试验中的进一步研究提供了强有力的依据，并强调了中性粒细胞重编程作为未来放射免疫治疗策略的一个潜在作用轴。

综上所述，研究人员认为，尽管肿瘤相关中性粒细胞传统上与癌症进展相关，但本研究证明TRIDENT能够将中性粒细胞驱动为抗肿瘤表型。该研究提出的机制见解，结合I期试验中观察到的持久生存，将TRIDENT定位为一种有前景的转移性非小细胞肺癌治疗策略，目前正在进行随机II期评估。该研究也强调了TNF-α⁺中性粒细胞作为增强抗肿瘤疗效的一种有前景的治疗策略。