富氢水能够抑制无结球白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）在采后由黑暗环境和ABA（脱落酸）引起的衰老现象 罗勇、 王欣满、 尹梦雅、 赵冉泽、 张丁宇、 朱红芳

《Antioxidants》：Hydrogen-Rich Water Suppresses Dark- and ABA-Induced Postharvest Senescence in Non-Heading Chinese Cabbage (Brassica rapa ssp. chinensis) Yong Luo, Xinman Wang, Mengya Yin, Ranze Zhao, Dingyu Zhang and Hongfang Zhu

　　**摘要**
开发高灵敏度和可靠的微囊藻毒素-LR (MC-LR) 监测策略对环境保护和公共卫生保护至关重要。本文介绍了一种基于超薄PdMoCu金属纳米片的电化学发光 (ECL) 生物传感平台，可实现飞克级别的MC-LR检测。这些二维PdMoCu金属纳米片具有丰富的活性位点，并通过Pd、Mo和Cu原子之间的协同电子调控加速了界面电荷转移动力学，显著提高了Ru(bpy)32+/TPrA ECL的效率。通过集成可编程的H1-适配体双链接口，实现了Ru(bpy)32+的静电富集，从而通过适配体触发的结构切换实现目标物质的发光信号释放。这种结合催化加速和DNA介导的信号调节的协同放大机制，使得该传感器具备出色的信号检测能力。在优化条件下，该生物传感器的线性响应范围为0.1 pg/mL至50 ng/mL，检测限低至37 fg/mL。该平台对结构类似物具有优异的选择性，在实际自来水样品中表现出高重复性和满意的回收率（99.3–102.0%）。这项工作不仅展示了金属纳米片在ECL系统中的催化潜力，还建立了一种通用的界面工程策略，用于超灵敏度检测环境污染物。

**1. 引言**
微囊藻毒素是一类由某些蓝绿藻产生的强效毒素[1,2]。这些藻类在营养丰富的环境中繁衍，常在水体（包括湖泊、河流和水库）中形成有害的藻华（HABs），并向水中释放微囊藻毒素。微囊藻毒素极其稳定且耐环境变化，因此会在水生生态系统中持续存在，对人类和动物构成重大健康威胁[3,4]。它们可通过多种途径进入人体，例如摄入受污染的水或海鲜、在娱乐活动期间吸入气溶胶或直接接触受污染的水[5]。已知这些毒素可导致肝脏损伤、胃肠道问题，甚至更严重的健康问题，如癌症和神经毒性[6,7]。在各种微囊藻毒素中，微囊藻毒素-LR (MC-LR) 因其对人类细胞中磷酸酶酶的强亲和力而被认为毒性最强，这种亲和力会破坏细胞信号通路并造成不可逆的损害[8]。鉴于其在水生生态系统中的高毒性和持久性，检测MC-LR对于保护公众健康、促进环境保护和推动科学知识发展具有重要意义[9,10,11]。及早检测水体中的MC-LR污染至关重要，因为这有助于迅速采取缓解措施，确保饮用水、娱乐用水和食物来源的安全[12,13,14]。鉴于微囊藻毒素污染可能造成广泛伤害，迫切需要可靠、快速且准确的检测方法来在环境和生物样品中检测MC-LR。近年来，人们投入了大量努力开发创新检测技术，以快速准确识别水样中的MC-LR[15]。传统方法如比色法、酶联免疫吸附测定 (ELISA) 和高效液相色谱 (HPLC) 常用于此目的[15]，但这些方法通常需要昂贵的设备、熟练的操作人员以及耗时的样品制备过程，限制了其常规监测的应用[16,17]。因此，研究人员一直在探索更先进的技术，包括化学发光、荧光、表面增强拉曼散射 (SERS) 和电化学传感器，这些技术都具有更快、更经济且更灵敏的检测潜力[18,19,20]。其中，电化学传感器，特别是ECL生物传感器，因其高灵敏度、操作简单、实时分析能力和最小的样品制备要求而成为有前景的替代方案[21,22]。ECL是一种经典的分析技术，最初由美国和欧洲的先驱研究者开发，通过电化学反应产生光，从而实现微量分析物的高灵敏度检测。凭借低背景噪声、高准确性和可靠的定量能力，ECL生物传感器已广泛应用于环境监测和生物医学领域[23,24]。在这些传感器中，发光信号由发光团的电化学氧化或还原产生，通常需要一种共反应物来促进反应[25,26]。设计高效ECL生物传感器的关键挑战之一是选择合适的共反应物材料，因为它们对所发射光的强度和稳定性起着关键作用。具有独特二维 (2D) 结构的金属纳米催化剂已成为ECL系统中非常有前景的共反应物[18,27]。这些材料，包括过渡金属合金和复合材料，展现出优异的催化性能、高表面积和低毒性，使其成为ECL生物传感器的理想候选材料[28,29]。金属纳米催化剂的高表面积增强了与电化学反应物的相互作用，而其独特的电子性质则促进了反应过程中的电子高效转移。此外，这些材料的低毒性确保了它们可以在生物和环境样品中使用而不会产生有害影响。最近的研究表明，二维纳米材料和基于金属的复合材料可以显著提升ECL生物传感器的性能。金属纳米片是由紧密堆积的单层或少量金属原子组成的原子级薄二维金属纳米片，具有纯金属框架和连续的二维结构，不含非金属支撑层。这些材料具有超薄片状形态、高比表面积、丰富的表面活性位点、优异的导电性以及可调的多金属协同效应。与石墨烯、MoS2、MXene和MOF衍生的二维材料相比，金属纳米片具有独特的优势，包括完全暴露的活性位点、高金属导电性、易于调节的电子结构、牢固的结构稳定性和快速的电荷传输能力。例如，可编程的金纳米簇 (AuNCs) 凝胶球已被用作高效的ECL发射体，用于构建敏感的生物传感器[30]。此外，鲁索合金-铜金属有机框架 (RuCu MOFs) 已被用于信号开启/关闭/开启的ECL适配体传感器策略，实现了对该肝毒素的高灵敏度检测[31]。此外，CRISPR-Cas12a与活性氧 (ROS) 敏感发光团的结合产生了双模式生物传感平台，增强了信号放大[32]。空间分离的传感和报告架构的使用也减少了目标分析物与发光物质之间的干扰，从而提高了检测精度[33,34,35]。本研究开发了一种基于PdMoCu金属纳米片的高性能ECL生物传感平台，用于超灵敏度的MC-LR检测。通过可控的湿化学方法合成的PdMoCu金属纳米片具有超薄的二维纳米结构和丰富的活性位点及优异的电子性能。通过将金属纳米片与适配体调控的DNA接口和Ru(bpy)32+ ECL系统集成，构建了一种可切换信号的传感器，实现了飞克每毫升级别的检测限、宽线性范围和良好的实用性。得益于金属纳米片的协同电子调控，该平台在电荷转移和信号稳定性方面优于传统的ECL系统。尽管已经研究了单/双金属纳米片，但很少有报道使用PdMoCu金属纳米片结合DNA静电富集和适配体信号切换来增强Ru(bpy)32+/TPrA ECL。本工作构建了一个PdMoCu催化接口和可编程的H1-适配体双链结构，实现了无需标记和酶参与的飞克级别MC-LR检测，具有高选择性，为超灵敏度环境毒素监测提供了一种通用策略。这项工作不仅提供了一种敏感的环境毒素检测方法，还扩展了基于金属的二维纳米材料在ECL生物分析中的应用，为微量污染物检测提供了通用框架。此外，该平台在早期癌症诊断和精准医学领域也显示出巨大潜力，通过适配体识别和ECL信号放大实现了微量疾病相关分子的检测，推动了生物传感技术向临床精准医学的扩展。

**2. 材料与方法**
本实验所用所有试剂和仪器的清单见补充材料。

**2.1. PdMoCu金属纳米催化剂的合成**
PdMoCu金属纳米片是通过受控的湿化学方法合成的，包括前体配位、超声波分散和低温溶剂热反应。准备三个干净干燥的50 mL烧杯，分别标记为A、B和C。每个烧杯分别加入50.0 mg乙酰丙酮钯 (Pd(acac)2（上海Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.）和100.0 mg六羰基钼 (Mo(CO)6（上海Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.）。然后按不同的摩尔比（Cu/Pd = 0.1、0.5和1）加入乙酰丙酮铜 (Cu(acac)2（上海Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.），以调节三金属组成。随后向每个体系中加入40 mL无水N,N-二甲基甲酰胺 (DMF）（上海Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.）作为反应溶剂。将混合体系密封并在25 ± 2 °C下用300 W的功率超声处理30分钟，获得均匀的透明浅绿色前体溶液，颜色变化对应于Cu含量。将溶液转移到100 mL圆底烧瓶中，再加入10 mL冰醋酸（上海Macklin Biochemical Co., Ltd.）作为配位和结构导向剂。在50 ± 0.5 °C的油浴中反应12小时，期间逐渐形成黑色沉淀，表明PdMoCu金属纳米片已生成。冷却至室温后，以7500 rpm离心10分钟收集产物。通过循环洗涤（五次）用环己烷/乙醇混合溶剂（1:1, v/v）彻底纯化沉淀物，每次洗涤包括超声重分散和离心以去除未反应的前体和有机残留物。最后，在50 °C下真空干燥6小时，获得用于后续表征和传感器制造的PdMoCu金属纳米粉（DNA来自上海Sangon Biotech Co., Ltd.）。BSA来自Thermo Fisher Scientific Inc.（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。抗原和抗体来自上海Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.。

**2.2. DNA制备和生物传感器构建**
DNA发夹 (H1) 结构是通过在95 °C下孵育DNA 10分钟然后快速冷却形成的。ECL DNA生物传感器是通过在玻璃碳电极 (GCE) 上逐步表面修饰策略构建的。修饰前，用氧化铝浆仔细抛光GCE以获得光滑清洁的表面，然后用超纯水和乙醇进行超声清洗以去除残留颗粒和有机污染物。在5.0 mmol L?1 [Fe(CN)6]3?/4?溶液中评估预处理电极的电化学性能，直至峰对峰电位分离 (ΔEp) 小于0.11 V，确保电极表面活性良好并适合后续功能化。在常温下干燥后，将6 μL PdMoCu金属纳米片分散液（1.5 mg/mL）滴涂在电极表面并自然干燥，形成均匀的催化层。随后沉积6 μL金纳米颗粒 (Au NPs) 以提供丰富的Au–S结合位点，用于硫醇化DNA的固定。将修饰后的电极与预处理的发夹DNA (H1) 溶液孵育30分钟，以通过Au–S键实现稳定锚定。用0.1 M磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 冲洗以去除未结合的DNA链，然后加入6 μL 1 wt%牛血清白蛋白 (BSA) 以阻断非特异性吸附位点并减少背景干扰。之后，加入10 μL适配体 (Apt) 溶液与H1杂交，在电极界面形成双链DNA结构。为了生成ECL信号，将三(2,2′-联吡啶)钌(II) 六水合物溶解在PBS中，配制成1 mg/mL的Ru(bpy)32+ 溶液（40 mg溶于40 mL中），并将适当体积滴涂在电极表面以实现静电吸附。最后，在修饰后的电极上孵育不同浓度的MC-LR溶液，以实现适配体的特异性识别，从而完成ECL DNA生物传感器的构建。

**2.3. ECL测量**
使用组合电化学工作站和超弱发光/生物发光检测系统进行ECL生物传感器的性能评估，以实现电化学激发和光子信号的同步获取。采用传统的三电极配置，其中修饰后的GCE作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极。电解质为浓度为1/15 mmol L?1的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，为ECL反应提供稳定的离子环境。循环伏安法（CV）在0–0.8 V的电位窗口内进行，以触发Ru(bpy)32+/共反应物系统的氧化还原反应并产生相应的化学发光（ECL）信号。为了优化分析性能，系统地研究了溶液pH值和Ru(bpy)32+孵育时间对ECL强度的影响，并根据最大信号输出和信号稳定性确定了最佳实验参数。在优化条件下，将一系列不同浓度的分析物溶液孵育在传感器表面上，并记录了它们对应的ECL响应。通过将ECL强度与分析物浓度对数绘制校准曲线，并根据信噪比（S/N = 3）标准计算出检出限（LOD），从而定量评估了构建的生物传感器的灵敏度和分析能力。

3. 结果
3.1 MC-LR的ECL检测原理
所提出平台的传感机制如图1所示，基于金属烯增强的界面ECL系统与目标触发的DNA结构转换。整体设计将催化界面工程、静电发光体富集和适体介导的分子识别集成到一个统一的信号转导框架中。PdMoCu三金属烯层作为基本的电活性界面。由于其超薄的二维结构和Pd、Mo、Cu原子之间的协同电子耦合，金属烯显著加速了界面电荷转移动力学，并降低了Ru(bpy)32+氧化过程的能量障碍。扩大的电化学活性表面积进一步促进了发光体的可及性，从而放大了内在的ECL响应。随后，将硫醇化发夹DNA（H1）固定在Au纳米粒子修饰的表面上，建立了一个可编程的分子支架。H1与MC-LR适体的杂交形成了一个富含负电荷磷酸酯骨架的双链DNA结构。这种聚阴离子界面作为静电储存库，有效地将带正电的Ru(bpy)32+物种集中在电极表面附近。结果，在电位扫描下实现了高局部的发光体密度，从而增强了ECL发射。当引入MC-LR时，特定的适体-目标结合诱导适体链的构象转变，破坏了双链结构。双链DNA框架的破坏减弱了静电限制效应，导致界面吸附的Ru(bpy)32+部分释放。因此，发光体的有效 surface concentration 减少。在循环伏安法激发过程中，Ru(bpy)32+被氧化为Ru(bpy)33+，并与共反应物自由基反应生成激发态Ru(bpy)32+*。这种激发态的辐射衰变产生了可测量的ECL发射。由于ECL强度直接依赖于界面发光体数量和电荷转移效率，目标诱导的发光体耗尽导致发射信号成比例地减弱。因此，传感器通过一种信号关闭机制工作，其中ECL强度与MC-LR浓度成反比。金属烯增强的电子转移动力学协同放大信号变化，使得在宽动态范围内实现超高灵敏度量化。本质上，分析性能源于（i）PdMoCu金属烯的催化电子转移加速，（ii）DNA双链介导的静电发光体富集，以及（iii）适体触发的结构转换以实现可控的信号调制。这种集成的界面工程策略建立了一个用于痕量MC-LR检测的稳健且高度灵敏的ECL平台。
3.2 材料表征
扫描电子显微镜（SEM）表征显示，合成的PdMoCu三金属烯呈现典型的皱褶二维超薄纳米片形态，具有良好的横向连续性（图1A）。透射电子显微镜（TEM）图像清楚地显示PdMoCu金属烯具有典型的二维皱褶纳米片结构，具有良好的横向连续性（图S1）。这种片状结构表明在湿化学合成过程中有效抑制了垂直晶体生长，这是由于Cu掺杂和配体介导的各向异性生长导致的协同晶格应变重新分布。超薄结构提供了丰富的表面活性位点和短的电子传输路径，有利于界面电荷转移和ECL信号放大。
3.3 界面组装的电化学阻抗分析
电化学阻抗谱（EIS）用于监测生物传感器的逐步组装并表征界面电荷转移行为（图2）。测试在含有2.5 mmol L?1 [Fe(CN)6]3?/4?和0.1 mol L?1 KCl作为氧化还原探针的三电极系统中进行，其中半圆直径代表电荷转移电阻（Rct）。裸玻璃碳电极显示出较小的Ret，表明电子传输快。PdMoCu金属烯的沉积通过形成纳米结构层适度增加了Ret，同时保持了良好的导电性。随后，H1的固定和适体杂交显著提高了Rct，因为负电荷的DNA阻碍了氧化还原探针的扩散，证实了DNA双链的成功组装。带正电的Ru(bpy)32+的吸附通过中和表面负电荷降低了Rct，验证了有效的静电富集。最后，与MC-LR的孵育再次增加了Rct，因为适体-目标结合解离了DNA双链并释放了Ru(bpy)32+。连续的Rct变化完全验证了逐步制造和目标响应的界面机制（表S1）。 apparent 电子转移速率常数（ks）被计算出来以评估PdMoCu金属烯修饰的GCE和裸GCE的界面电子转移动力学。在Ru(bpy)32+/TPrA系统中，以不同的扫描速率（0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 V/s）进行了循环伏安法（CV）测量。根据Laviron方程（对于准可逆反应），将氧化峰电位（Epa）与扫描率的对数（logv）绘制出来，获得了良好的线性关系，相关系数R2 > 0.98。电荷转移系数（α）从线性拟合的斜率得出，然后通过线性方程的截距计算出ks值。PdMoCu金属烯修饰的GCE的ks约为6.26 × 10?1 cm·s?1，远高于裸GCE（约5.0 × 10?3 cm·s?1），表明PdMoCu三金属烯显著加速了界面电子转移动力学。使用电化学方法对电极表面上的DNA负载和杂交效率进行了定量分析。发夹DNA H1的表面密度确定为5.26 × 10?11 mol·cm?2，H1与适体之间的杂交效率达到87.3%。这些结果表明DNA在电极表面的固定是有效的，杂交效率很高，证明传感界面均匀、稳定且可控地组装。总体而言，电荷转移电阻的顺序变化清楚地证明了传感平台的成功逐步制造，并证实了目标响应的界面调制机制。阻抗演变与提出的信号转导途径完全一致，确认了构建的ECL生物传感器的可靠性。
3.4 实验参数的优化
为了实现最大的分析性能，系统地优化了影响ECL响应的关键界面和反应参数，包括支持电解质的pH值和Ru(bpy)32+在DNA修饰界面上的吸附时间。在实际检测复杂高盐样品之前，通常需要适当的稀释或缓冲液调整以保持静电富集的效率。磷酸盐缓冲盐的pH值在调节Ru(bpy)32+/共反应物系统的电化学行为和DNA双链层的结构稳定性方面起着关键作用。如图S4所示，随着pH值从6.0调整到7.4，ECL强度逐渐增加，在生理pH值时达到最大。这种增强可以归因于在接近中性条件下的共反应物氧化效率的提高和有利的质子耦合电子转移动力学。此外，在pH值为7.4时，DNA双链保持了最佳的结构稳定性和表面电荷密度，从而最大化了Ru(bpy)32+的静电富集。当pH值进一步增加到7.8时，观察到ECL强度明显下降。这种下降可能是由于DNA界面构象的部分改变和共反应物质子化状态的变化，这些共同影响了发光体的氧化效率和激发态的生成。因此，选择pH值7.4作为后续实验的最佳操作条件，确保了界面的平衡稳定性和电子转移动力学。Ru(bpy)32+的吸附时间直接决定了发光体在带负电的DNA双链框架内的静电积累程度，从而影响有效的表面浓度和ECL输出。如图S5所示，ECL强度随着吸附时间的延长逐渐增加，直到60分钟，表明吸附平衡逐渐建立和界面发光体密度增加。超过60分钟后，ECL信号达到平台期，表明表面结合位点变得饱和，系统接近动态平衡。 prolonged 孵育不再产生进一步的信号增强，表明已经达到了最大的静电富集。因此，选择60分钟作为最佳吸附时间，平衡了信号强度和实验效率。总体而言，这些优化结果表明生物传感器的ECL性能高度依赖于受控的界面动力学和物理化学条件。电解质pH值和发光体吸附平衡的精确调节确保了后续分析测量中的最大信号放大和重现性。
3.5 ECL生物传感器的灵敏度评估
在优化的实验条件下系统地评估了构建的ECL生物传感器的分析灵敏度。如图3A所示，随着MC-LR浓度的逐渐增加，记录了ECL发射曲线。随着MC-LR浓度的逐渐增加，ECL强度逐渐降低，表明信号衰减行为依赖于浓度。这一趋势与提出的信号关闭传感机制一致，其中目标结合诱导了表面限定的Ru(bpy)32+的部分释放，并减少了电极界面的有效发光体密度。图3B进一步展示了ECL强度随MC-LR浓度变化的情况。随着浓度从0.1 pg/mL增加到50 ng/mL，发射强度呈现出明显的单调下降，这证明了该传感器能够在广泛的浓度范围内将分子识别事件转化为定量光学信号。如图3C所示，在0.1 pg/mL到50 ng/mL的宽动态范围内，ECL强度（IECL）与MC-LR浓度的对数之间建立了明确的线性关系。相应的线性回归方程为IECL = 5269.09 ? 906.496 log c，相关系数（R2）为0.988，表明具有良好的线性和可靠的定量性能。校准曲线的斜率反映了该平台的内在分析灵敏度。如此高的信号-响应梯度源自于传感架构中嵌入的协同放大机制。具体来说，超薄PdMoCu类金属烯层加速了界面电子转移动力学，并提高了Ru(bpy)32+的氧化效率，而DNA双链介导的静电富集显著增加了局部荧光团的浓度。催化增强与目标引发的荧光团消耗的结合，即使在极低的MC-LR浓度下也能产生显著的信号变化。根据信噪比标准（S/N = 3），检测限（LOD）被计算为37 fg/mL。公式为LOD = 3σ/k，其中σ代表11次空白样品测量的标准差，k是校准曲线的斜率。噪声水平（σ）是通过11次不含MC-LR的空白溶液测量的ECL强度的标准差确定的。这种飞克级别的检测能力展示了所提出策略的显著灵敏度。异常低的LOD可以归因于三个协同因素：（i）高效的类金属烯介导的电荷转移加速；（ii）通过静电相互作用对Ru(bpy)32+的高密度表面限制；（iii）由适配体-目标结合引起的结构增强信号衰减。我们还在检测限附近测量了ECL信号。结果表明，接近LOD时的相对标准偏差（RSD）保持在较低水平，验证了传感平台在超痕量浓度下的可靠性（图S6）。图3. ECL生物传感器对MC-LR检测的分析性能。（A）在不同MC-LR浓度下获得的ECL发射响应（a–j分别对应0.1 pg/mL、0.5 pg/mL、5 pg/mL、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、500 pg/mL、5 ng/mL、10 ng/mL和50 ng/mL）。（B）ECL强度与MC-LR浓度的依赖性。（C）ECL强度与MC-LR浓度对数的线性校准曲线（n = 3）。基于Langmuir吸附等温模型，我们对MC-LR浓度与ECL响应的校准数据进行了非线性拟合，并获得了界面结合和传感性能的关键参数。拟合结果显示，最大相对信号变化ΔECLmax/ECLIntensity0为0.92 ± 0.03，这与实验中观察到的饱和响应高度一致，代表了传感器可实现的最大信号衰减。同时，适配体-MC-LR相互作用的表观解离常数被拟合为Kd = (1.2 ± 0.2) × 10?11 mol/L（相当于大约0.01 ng/mL的质量浓度）。这个极低的Kd值充分证明了适配体与目标之间的高亲和力结合特性，验证了传感界面的特异性识别能力。此外，模型的拟合优度R2 = 0.991，表明Langmuir模型能够准确描述0.1 pg/mL到50 ng/mL范围内ECL响应与MC-LR浓度之间的平衡关系，进一步证实了传感过程是由分子识别平衡控制的。重要的是，所实现的灵敏度与之前报道的ECL或电化学传感平台相当，在许多情况下甚至更优越（表S2）。尽管CRISPR提供了极高的特异性，但本研究通过PdMoCu类金属烯的内在催化活性实现了无酶的超灵敏检测，这显著简化了操作程序并缩短了检测时间。跨越五个数量级的宽线性范围进一步突显了该系统用于痕量环境监测的稳定性和适应性。总体而言，宽广的动态范围、高的信号放大效率和飞克级别的检测限共同证明了所提出的ECL生物传感器在MC-LR测定方面具有出色的分析灵敏度。3.6. 特异性和抗干扰性能通过检测其对结构相关类似物和潜在干扰物质的影响，系统评估了所提出的ECL生物传感器对MC-LR的选择性。在相同的实验条件下，将微囊藻毒素-YR（MC-YR）、微囊藻毒素-LA（MC-LA）、脂多糖（LPS）和空白对照组引入分析系统，并记录与相同浓度水平下MC-LR的ECL响应进行比较。如图4A所示，仅在MC-LR存在的情况下观察到ECL强度的显著下降，而MC-YR、MC-LA、LPS和空白组的信号变化可以忽略不计。尽管MC-LR与其他微囊藻毒素类似物在结构上相似，但传感器表现出强烈的区分能力，表明适配体对MC-LR具有高结合亲和力和序列特异性识别。这一结果证实，除非存在MC-LR，否则微囊藻毒素变异体之间的氨基酸残基微小差异不会触发适配体的显著构象变化。在选择性实验中，脂多糖（LPS）被引入作为代表性的生物大分子干扰物（图S7）。结果显示LPS对ECL信号的影响可以忽略不计，这证实了适配体和BSA阻隔层在减少非特异性吸附方面的有效性。非目标物质观察到的最小信号波动表明非特异性吸附和交叉反应得到了有效抑制。这可以归因于传感界面中嵌入的双重调节机制：（i）适配体-目标分子识别的高特异性；（ii）BSA介导的电极表面非特异性结合位点的阻挡。这些因素共同减少了背景干扰并提高了信号保真度。此外，区分MC-LR与结构同源毒素的能力突显了基于DNA的识别策略的稳健性，并证实了信号转导机制的可靠性。出色的抗干扰性能表明所提出的生物传感器非常适合在实际环境矩阵中的应用。总体而言，与其他潜在干扰物相比，对MC-LR的独特信号响应证明了所开发的ECL生物传感平台的高选择性和分子特异性。图4. 评估ECL生物传感器的选择性和重复性。（A）在潜在干扰物质（包括MC-YR、MC-LA、LPS和空白对照组）存在的情况下，对MC-LR（50 ng/mL）的选择性评估。（B）基于五个独立测量的重复性评估，使用相同条件下的制备的生物传感器。3.7. 可重复性和稳定性评估为了验证其分析可靠性，系统评估了构建的ECL生物传感器的可重复性和操作稳定性。为了进一步检查制备的可重复性（电极间的精度），在相同条件下测试了五个独立制备的电极。如图4B所示，所得到的ECL响应高度一致，不同传感器批次之间的变化最小。低RSD值证实了逐层组装策略提供了可靠和可控的表面修饰。传感器在4°C下储存7天后，其ECL信号几乎没有变化，显示出优异的长期稳定性（图S8）。通过连续循环伏安扫描修改后的电极来评估操作稳定性。如图S9所示，重复扫描过程中记录的ECL强度波动可以忽略不计，表明在连续电化学激发下信号输出稳定。计算出的相对标准偏差（RSD）为2.37%，表明测量的精度极高且信号漂移最小。这种稳定的性能表明PdMoCu类金属烯层保持了稳健的界面导电性和结构完整性，而DNA双链框架在电化学操作过程中保持了表面组织，没有显著脱附或降解。优异的可重复性和稳定性可以归因于几个因素：（i）强Au–S键合确保了DNA的稳定固定；（ii）BSA阻隔减少了非特异性吸附和表面污染；（iii）类金属烯增强的界面提供了耐用的电子转移路径，减少了结构塌陷。总体而言，低RSD值和一致的信号保持性证明了所开发的ECL生物传感器具有高可靠性、结构稳健性和操作耐久性，使其非常适合实际的环境监测应用。由于特定的适配体-目标结合和DNA双链解离是不可逆的，这种传感器被设计为一次性使用，以确保最高的检测准确性。同时，GCEs的易抛光和重新修饰提供了实际、低成本和可重复制造的可行性。3.8. 实际样品分析和实际应用为了评估所开发的ECL生物传感器的实际适用性，使用自来水作为代表的环境基质进行了实际样品分析。通过将已知浓度的MC-LR加入到自来水样本中，然后在优化的实验条件下进行检测，进行了标准添加实验。这种方法用于评估传感平台的分析准确性、精度和基质耐受性。如表1所总结的，不同添加水平下的MC-LR回收率范围为99.3%到102.0%，表明分析准确性优异。相应的相对标准偏差（RSDs）在1.1%到3.6%之间，表明在复杂样品基质中具有令人满意的精度和重复性。接近100%的回收率证实传感器响应不受自来水中共存离子或背景成分的显著影响。在实际样品分析中观察到的最小基质干扰可以归因于适配体-目标相互作用的高特异性和表面阻隔策略对非特异性吸附的有效抑制。此外，类金属烯增强的ECL界面即使在潜在干扰物质存在的情况下也能保持稳定的电子转移性能，确保了一致的信号输出。这些结果共同证明了所提出的生物传感器在实际环境样本中具有强大的抗基质干扰能力和可靠的定量性能。表1. 传感器在实际样品分析和回收中的应用。3.9. ECL过程的机制研究为了阐明所提出的生物传感平台的信号生成途径，基于电化学行为、优化结果和建立的信号转导模型分析了ECL机制。ECL发射源自经典的Ru(bpy)32+/三丙胺（TPrA）共反应物系统，其效率显著受到PdMoCu类金属烯增强界面和DNA介导的荧光团富集的调节。在正电位扫描下，TPrA首先在电极表面氧化生成自由基阳离子TPrA•+：（1）随后，自由基阳离子发生脱质子化形成强还原性自由基TPrA•：（2）同时，Ru(bpy)32+被氧化为Ru(bpy)33+：（3）高反应性的TPrA•自由基随后与Ru(bpy)33+通过还原途径反应生成激发态物种Ru(bpy)32+*：（4）最后，激发的荧光团返回基态并释放光子：（5）虽然上述反应代表了传统的ECL途径，但当前系统由于PdMoCu类金属烯的界面调节而表现出增强的发射效率。超薄类金属烯层加速了电子转移动力学，降低了TPrA和Ru(bpy)32+氧化的过电位，并增加了Ru(bpy)33+与TPrA•之间的有效碰撞概率。Pd、Mo和Cu原子之间的协同电子耦合可能改变了局部电子态密度，促进了电极-电解质界面处的快速电荷交换。此外，带负电的DNA双链作为静电限制矩阵，富集了电极表面的Ru(bpy)32+，从而增加了可用于激发的局部荧光团浓度。这种限制效应通过促进反应中间体之间的空间接近性提高了ECL过程的量子效率。在MC-LR结合时，适配体诱导的双链解离导致Ru(bpy)32+部分从界面释放。界面荧光团密度的降低减少了Ru(bpy)32+*的生成速率，从而降低了ECL发射。因此，观察到的信号变化源自于界面电子转移效率和荧光团可用性的共同调节。总体而言，增强的ECL响应源于双重放大机制：（i）PdMoCu类金属烯对氧化还原反应的催化加速；（ii）通过DNA双链形成对Ru(bpy)32+的静电富集。目标诱导的结构切换进一步将分子识别事件转化为可测量的光学信号。这种协同的界面工程机制是所提出的MC-LR检测平台具有超高灵敏度的基础。3.10. 未来展望尽管在本研究中取得了良好的分析性能，但在复杂的生物基质中的实际应用仍面临着与非特异性吸附和高离子强度相关的挑战。值得注意的是，在生理条件下，高离子强度可能会损害Ru(bpy)32+的静电富集作用，而这种富集作用是该传感机制的基础。为了解决这些问题，未来的研究将致力于整合抗污染界面工程策略，例如引入两性聚合物涂层或刚性亲水间隔层，以抑制非特异性吸附，并保护静电相互作用免受高盐浓度的干扰。此外，还将进一步优化DNA-适配体双链结构以及表面锚定方式，以提高在血清和其他生物流体中的结构稳定性和信号保真度，从而将该平台从环境毒素监测扩展到临床生物传感应用。4. 结论总之，我们成功开发了一种高度灵敏且可靠的电生成化学发光（ECL）生物传感平台，用于通过将PdMoCu三金属烯与基于DNA的分子识别界面结合来检测微囊藻毒素-LR（MC-LR）。超薄的二维PdMoCu金属烯提供了具有催化活性和导电性的表面，显著增强了界面电荷转移动力学，并提高了Ru(bpy)32+/TPrA的ECL发射效率。同时，可编程的H1-适配体双链结构实现了对发光分子的有效静电富集和目标响应的结构切换，将分子识别事件转化为可量化的光学信号。在优化条件下，所提出的传感器实现了从0.1 pg mL?1到50 ng mL?1的宽线性检测范围，相关系数（R2）为0.988，检测限低至37 fg mL?1。该平台还对结构相关的类似物表现出优异的选择性，以及高重复性和操作稳定性，相对标准偏差低。在实际的自来水样品中，令人满意的回收率（99.3–102.0%）进一步证实了其准确性和强大的抗基质干扰能力。从机制上讲，这种卓越的分析性能源于一种协同的界面工程策略，包括金属烯加速的氧化还原动力学、DNA介导的发光体限制以及适配体触发的信号调制。这种协同放大框架不仅提高了ECL效率，还为将特定的分子识别转化为放大的电化学光学输出建立了稳健的途径。总体而言，这项工作扩展了三金属烯在ECL生物传感中的功能应用，并为构建超灵敏检测平台提供了多功能的设计策略，以检测微量环境污染物。所提出的方法在实时环境监测方面具有重大潜力，并且可以通过适配体替换和界面定制轻松扩展到其他有害分析物的检测。补充材料以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios16050264/s1：图S1：PdMoCu金属烯的TEM图像。图S2：含与不含PdMoCu金属烯的传感界面的ECL响应。图S3：单金属（Pd）、双金属（PdMo）和三金属（PdMoCu）系统之间的ECL性能比较。图S4：实验PBS pH值对ECL响应的影响优化。图S5：Ru(bpy)32+吸附时间对DNA修饰电极ECL响应的影响。图S6：接近 LOD 时的ECL信号。图S7：ECL传感平台的选择性评估。图S8：生物传感器在4°C下7天的稳定性测试。图S9：所提出的ECL传感器的稳定性测试。表S1：定量表征。表S2：不同传感器在MC-LR检测方面的分析性能比较。参考文献[30,31,36,37,38,39]列在补充材料中。